營(yíng)養(yǎng)素對(duì)水生動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響及機(jī)理研究

■許友卿 鄭一民 丁兆坤

(廣西大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)研究所，廣西南寧 530004)

營(yíng)養(yǎng)素是機(jī)體進(jìn)行新陳代謝的基礎(chǔ)，對(duì)機(jī)體影響很大[1-5]。傳統(tǒng)的水產(chǎn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)主要從表觀水平上研究營(yíng)養(yǎng)素的作用。然而，機(jī)體的新陳代謝、生長(zhǎng)發(fā)育、遺傳變異、免疫和疾病發(fā)生等生理和病理變化，本質(zhì)上是由于體內(nèi)基因的表達(dá)和調(diào)控改變的結(jié)果[6-10]。如果掌握了營(yíng)養(yǎng)素調(diào)控基因表達(dá)的確切途徑及機(jī)理，就能人為調(diào)控水產(chǎn)動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)代謝，預(yù)防營(yíng)養(yǎng)及代謝疾病，促進(jìn)它們健康生長(zhǎng)。但是該領(lǐng)域的研究還處于起始階段，相關(guān)問(wèn)題亟待研究。

本文綜述了營(yíng)養(yǎng)素對(duì)水生動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響和機(jī)理研究的進(jìn)展，旨在對(duì)其進(jìn)行深入研究，以便更有效地利用營(yíng)養(yǎng)素調(diào)控水生動(dòng)物，提高它們的代謝、生長(zhǎng)發(fā)育和生產(chǎn)性能，促進(jìn)養(yǎng)殖漁業(yè)的健康生態(tài)發(fā)展，提高經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。

1 營(yíng)養(yǎng)素對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響

1.1 營(yíng)養(yǎng)素對(duì)GHGHR、IGF-1基因表達(dá)的影響

GH/IGF-1軸是動(dòng)物機(jī)體中重要的內(nèi)分泌生理軸，包括生長(zhǎng)激素（growth hormone，GH）、生長(zhǎng)激素受體（growth hormone receptor，GHR）和類胰島素生長(zhǎng)因子（insulin-like growth factor-I，IGF-1）等，主要調(diào)控機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育。GH對(duì)魚類等脊椎動(dòng)物的代謝、生長(zhǎng)、繁殖、免疫、滲透壓調(diào)節(jié)及其他生理功能發(fā)揮重要作用[11-14]。GH是通過(guò)其受體GHR及IGF-1的作用來(lái)調(diào)控生長(zhǎng)的，IGF-1是GH促進(jìn)生長(zhǎng)的最重要介導(dǎo)物[15]，因此是該領(lǐng)域研究的重要對(duì)象之一。

營(yíng)養(yǎng)素影響魚IGF-1、GHR基因表達(dá)，因物、量、時(shí)和組織而異。在基礎(chǔ)飼料中分別添加酵母硒0.25、0.50 mg/kg干飼料，導(dǎo)致團(tuán)頭魴(Megalobrama amblycephala)腦垂體的MaGH基因表達(dá)水平分別比對(duì)照組提高了75.76%和50.51%；而添加茶多酚50、100 mg/kg干飼料顯著提高團(tuán)頭魴腦GHR2基因表達(dá)水平(P＜0.05)；二種添加劑均顯著影響團(tuán)頭魴肝IGF-1基因的表達(dá)水平(P＜0.05)，表明酵母硒和茶多酚可通過(guò)上調(diào)GH、IGF-1和GHR2基因mRNA的表達(dá)而促進(jìn)團(tuán)頭魴的生長(zhǎng)性能[16]。Gómez-requeni等[17]分別用魚粉（FM）、植物蛋白替代魚粉50%(PP50)、75%(PP75)和100%（PP100）投喂金頭鯛（Sparus aurata），禁食過(guò)夜后發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)M組魚肝GHR、IGF-1基因表達(dá)量是PP100組的4倍。Zheng等[18]報(bào)道，給牙鲆(Paralichthys olivaceus)飼喂超濾魚水解物37 g/kg干飼料，其肝中的IGF-1 mRNA表達(dá)量是魚粉對(duì)照組的1.4倍(P＜0.05)。用輪蟲(RR組)投喂大西洋鱈(Gadus morhua)仔稚魚，其于出膜后16 d和29 d的GH mRNA水平最高；而用湯氏紡錘水蚤和輪蟲混合物(CR組)投喂，其GH mRNA水平于出膜后29 d最高[19]。Picha等(2015)[20]發(fā)現(xiàn)，于投喂期，所有實(shí)驗(yàn)組的混血條紋鱸（Morone chrysops Morone saxatilisc）肌肉IGF-1 mRNA表達(dá)量與生長(zhǎng)率呈正相關(guān)。隨著日糧中精氨酸水平增加，大異育銀鯽(Carassis auratus gibelio)肝GH mRNA水平?jīng)]有變化(P＞0.05)，而小異育銀鯽腦下垂體GH mRNA水平明顯增加，其中飼喂精氨酸17.6、13.0 g/kg干飼料的魚肝IGF-1 mRNA水平比飼喂精氨酸5.4 g/kg干飼料的顯著升高。但是，小異育銀鯽的GH和IGF-1 mRNA水平顯著高于大異育銀鯽(P＜0.05)[21]。

禁食2周的虹鱒（Oncorhynchus mykiss）脂肪組織和紅肌GHR1 mRNA表達(dá)量比正常飼喂對(duì)照組下降近1倍；當(dāng)禁食4周，其肝GHR1 mRNA表達(dá)量下降近2倍；重新投喂后，其肝和脂肪組織的GHR1表達(dá)量恢復(fù)至連續(xù)投喂的虹鱒水平。然而，營(yíng)養(yǎng)狀況對(duì)紅肌中的GHR1 mRNA表達(dá)量沒(méi)有明顯影響[22]。Kawanago等(2015)[23]報(bào)道，鰤?mèng)~(Seriola quinqueradiata)幼魚禁食3 d后，再重新投喂含支鏈氨基酸混合物（BCAA）0.4%、1%和2%的飼料，發(fā)現(xiàn)2%BACC組魚于重新飼喂3 h和9 h后肝IGF-1和IGF-2表達(dá)量顯著高于對(duì)照組（前者P＜0.01，后者P＜0.05）；1%BCAA組魚在重新飼喂9 h后，其肝IGF-1 mRNA表達(dá)量略高于對(duì)照組，但不顯著（P＜0.08）；而IGF-2 mRNA表達(dá)量顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）。2%BCAA組魚血漿中的BCAA濃度顯著增高，表明鰤?mèng)~進(jìn)食后合成氨基酸，可能是由于提高血漿中BCAA水平而誘導(dǎo)肝IGF-1和IGF-2表達(dá)的緣故。

1.2 營(yíng)養(yǎng)素對(duì)CAPN和CAST基因表達(dá)的影響

鈣蛋白酶（calpain，CAPN）系統(tǒng)參與肌肉生長(zhǎng)分化、神經(jīng)發(fā)育和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等正常生理過(guò)程，CAPN表達(dá)還會(huì)引起肌細(xì)胞肌原纖維降解[24-28]。CAPN是廣泛存于動(dòng)物體的一種特異性依賴鈣激活的中性半胱氨酸巰基內(nèi)肽酶，主要有三類：鈣蛋白酶I（CAPN 1)、鈣蛋白酶II(CAPN 2)和骨骼肌特異性蛋白(CAPN 3)[29]。鈣蛋白酶抑制蛋白(Calpastain，CAST)是CAPN的特異性內(nèi)源抑制劑，CAST表達(dá)可抑制肌蛋白水解[24-28]。Rolland等(2015)[30]用5種含不同水平甲硫氨酸(Met)的日糧(Met1、Met2、Met3、Met4、Met5)飼喂虹鱒，發(fā)現(xiàn)Met5組魚肝Capn1表達(dá)量是Met1組的2.4倍，Met2組Capn2表達(dá)量是Met組的1.5倍，但各組間沒(méi)有線性關(guān)系；而長(zhǎng)亞型（CAST-L）和短亞型（CAST-S）的鈣蛋白酶抑制蛋白基因表達(dá)量隨著日糧Met水平的增加而增加，其中Met5組表達(dá)量最高，分別是Met1組的3.8倍和2倍，表明增加日糧Met的水平能減少魚體蛋白質(zhì)的降解。Preziosa等[31]報(bào)道，饑餓35 d的斑點(diǎn)叉尾鮰骨骼肌Capn1、Capn2、Capn3的表達(dá)分別比饑餓17 d的減少了2.3、1.3和13倍（P＜0.05）；而重新飼喂并沒(méi)有改變這些基因的表達(dá)量。Cleveland等[32]發(fā)現(xiàn)，不同水平日糧（0.25%、0.5%、0.75% 生物量/d和飽食）及性成熟均影響二倍體和三倍體虹鱒蛋白降解的相關(guān)指標(biāo)、CAPN 基因（CAPN1和CAPN2）的表達(dá)；對(duì)相同投喂水平者來(lái)說(shuō)，未成熟二倍體和多倍體魚的CAST1和CASTs基因表達(dá)較低，性成熟者會(huì)增加蛋白降解；而較高水平的飼料攝入不能緩和蛋白降解，卻能阻止肌肉蛋白的凈損失。Salem等[33]發(fā)現(xiàn)，虹鱒饑餓3周后，其CAPN催化活性增加，卻減少CAST和CAST長(zhǎng)型異構(gòu)體（CAST-L）mRNA的表達(dá)。禁食15 d和30 d的金頭鯛sacapns1b基因表達(dá)量分別是對(duì)照組的2倍和2.8倍；然而，重新飼喂14 d后，金頭鯛Sacapn1、Sacapn2、Sacapns1a、Sacapns1b的表達(dá)量分別比對(duì)照組降低了65%、50%、42%和70%。因此，可通過(guò)營(yíng)養(yǎng)成分及水平調(diào)控金頭鯛CAPN基因的表達(dá)[34]。

1.3 營(yíng)養(yǎng)素對(duì)Pept1基因表達(dá)的影響

小肽是蛋白質(zhì)消化的主要產(chǎn)物。小肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（peptide transporter，PepT）參與二肽和三肽的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)[35]，促進(jìn)蛋白質(zhì)的消化、吸收和代謝。小肽與游離氨基酸的吸收不同，兩者比較，小肽具有吸收快、耗能低、不易飽和、各種肽之間轉(zhuǎn)運(yùn)無(wú)競(jìng)爭(zhēng)性與抑制性等特點(diǎn)。小肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（PepT1）是小肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中研究最廣泛而重要的一種[36]。PepT1基因存在于許多脊椎動(dòng)物，包括哺乳動(dòng)物和鳥(niǎo)類[37-41]、斑馬魚(Danio rerio)[42]、鯉魚（Cyprinus carpio）[43]、草魚[44]、大西洋鮭（Salmo salar）[45]、底鳉(Fundulus heteroclitus)[46]、海鱸（Lateolabrax japonicus）[47]和虹鱒[48]等。

日糧中蛋白質(zhì)的水平可影響魚PepT1基因的表達(dá)。Liu等[49]將含有5種不同蛋白質(zhì)水平（22%、27%、32%、37%和42%）的日糧投喂三倍體鯽-鯉魚1個(gè)月，發(fā)現(xiàn)投喂42%蛋白質(zhì)日糧組的魚小腸PepT1基因表達(dá)量最高，是27%蛋白日糧組魚的7倍。如果長(zhǎng)時(shí)間日糧營(yíng)養(yǎng)不良，盡管投喂低蛋白日糧，魚小腸的PepT1基因表達(dá)也升高，這是代償作用，以加速蛋白質(zhì)代謝和補(bǔ)償生長(zhǎng)。經(jīng)過(guò)7 d饑餓后，歐洲鱸魚PEPT1基因mRNA的含量降低，再投喂則其PEPT1基因 mRNA的表達(dá)水平顯著提高[50]。Cai等（2015）[51]用魚粉作為對(duì)照組的主要蛋白源，分別用超濾魚肉水解滲透物（PUFH)、超濾后魚肉水解滲余物(RUFH)和無(wú)超濾魚肉水解物(NUFH)替代40%魚粉投喂大黃魚幼魚，發(fā)現(xiàn)飼喂PUFH-40的魚PepT1表達(dá)水平是RUFH-40魚的2.6倍（P＜0.05），也顯著高于NUFH-40日糧組和對(duì)照組。表明添加PUFH更能影響大黃魚幼魚對(duì)蛋白質(zhì)的消化和吸收。

日糧影響魚PepT1基因的表達(dá)，因蛋白質(zhì)元素而異。Ostaszewska等[52]分別用添加Lys-Gly二肽、游離Lys、Gly及不添加Lys的飼料投喂鯉魚，發(fā)現(xiàn)投喂添加Lys-Gly二肽日糧的鯉魚PepT1基因表達(dá)量最高，未添加Lys日糧組鯉魚表達(dá)最低，表明在魚日糧中添加一定量小肽會(huì)增加其PepT1基因的表達(dá)，該實(shí)驗(yàn)中Lys-Gly二肽效果最好。給虹鱒投喂富含不同蛋白源形式的三種飼料(賴氨酸-甘氨酸二肽、晶體賴氨酸和晶體甘氨酸、商品飼料)4周，發(fā)現(xiàn)以賴氨酸-甘氨酸二肽形式作為主要蛋白源的飼料顯著促進(jìn)了PEPT1基因mRNA的表達(dá)[48]。如果給鱈魚幼魚分別投喂富含小肽和晶體氨基酸的飼料，雖然對(duì)在魚體小腸同一區(qū)域的PEPT1基因水平產(chǎn)生了顯著影響，但是與魚粉對(duì)照組比較卻無(wú)顯著性差異[53]。Amberg等[54]給大西洋鱈魚(Gadus morhua)仔稚魚分別投喂野生浮游動(dòng)物和營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化的輪蟲，大西洋鱈PEPT1基因水平均無(wú)顯著差異。

1.4 營(yíng)養(yǎng)素對(duì)脂肪酸去飽和酶基因表達(dá)的影響

高度不飽和脂肪酸(HUFAs)，特別是二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)是魚類必需營(yíng)養(yǎng)素，在維持機(jī)體的正常機(jī)能、促進(jìn)生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖和提高成活率等方面發(fā)揮重要的生理作用[55]。近來(lái)，水產(chǎn)動(dòng)物合成HUFAs的幾個(gè)關(guān)鍵去飽和酶—Δ6、Δ5和延長(zhǎng)酶基因廣為研究，其中通過(guò)營(yíng)養(yǎng)素調(diào)節(jié)Δ5和延長(zhǎng)酶基因的表達(dá)是研究熱點(diǎn)之一[56-60]。Li等[61]用含不同比例葡萄籽油（GO）和亞麻籽油（LO）的日糧投喂皺紋盤鮑（Haliotis discus hanai）120 d后，發(fā)現(xiàn)投喂含50%GO日糧者的兩種Δ5脂肪酸去飽和酶基因（Hdfad1和Hdfad2）在肌肉表達(dá)量分別是對(duì)照組的2.34和2.5倍(P＜0.05)；投喂100%LO日糧組的Hdfad1和Hdfad2表達(dá)量分別是0%GO/LO日糧組的2.09和2.46倍（P＜0.05）。隨著日糧中亞油酸（LA）和α-亞麻酸（ALA）含量增加，Δ5 Fads表達(dá)量增高，皺紋盤鮑肌肉中的長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸（PUFAs)合成量也隨之增加。但大量攝取LA和ALA則會(huì)抑制DHA合成，影響皺紋盤鮑的生長(zhǎng)性能。Yang等[62]用不含油脂類飼料（對(duì)照組）、含魚油（FO）飼料、含大豆油(SO)飼料和魚油/大豆油（FO/SO）=1∶1混合飼料分別投喂中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）幼蟹，于168 d和238 d取樣測(cè)定，發(fā)現(xiàn)投喂SO飼料238 d的蟹肝胰臟的類Δ6脂肪酸去飽和酶基因的表達(dá)量分別是對(duì)照組、FO組和FO/SO組之蟹的2.1、6.9和1.52倍；而且投喂SO飼料238 d的蟹肝胰臟類Δ6脂肪酸去飽和酶基因表達(dá)量高于投喂SO 168 d之蟹。當(dāng)用添加不同比例FO（0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%）和對(duì)照組飼料（不添加FO）投喂玉虎雜交鮑(Abalone)90 d，發(fā)現(xiàn)投喂含1.5%FO日糧組鮑肌肉延長(zhǎng)酶2基因表達(dá)最高，是1%FO組的5倍，還顯著提高鮑的n-3 PUFAs水平。而投喂含0.5%FO日糧組鮑肌肉中的Δ6脂肪酸去飽和酶基因表達(dá)最高，是2.5%FO組的5倍[63]。Kuah等（2015）[64]和Xue等（2015）[65]分別報(bào)道，日糧中添加高水平的C18PUFA能提高魚體中Δ5、Δ6脂肪酸去飽和酶基因的表達(dá)量，表明日糧中不飽和脂肪酸能誘導(dǎo)Δ5、Δ6脂肪酸去飽和酶基因mRNA的轉(zhuǎn)錄。然而，Thomassen等[66]報(bào)道，給大西洋鮭分別投喂魚油（FO）或菜籽油（RO）+EPA+DHA的飼料，會(huì)抑制Δ5和Δ6脂肪酸去飽和酶基因表達(dá)，還抑制延長(zhǎng)酶2基因的表達(dá)。

2 營(yíng)養(yǎng)素影響水生動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的機(jī)理

營(yíng)養(yǎng)素可通過(guò)直接或間接途徑調(diào)控每個(gè)基因調(diào)控點(diǎn)調(diào)控基因的表達(dá)[67]。這種調(diào)控作用既可在基因轉(zhuǎn)錄水平，也可在轉(zhuǎn)錄后[68]。對(duì)真核細(xì)胞而言，其mRNA的5’和3’端非編碼區(qū) (UTR)含有控制mRNA的腺苷聚合、穩(wěn)定、在細(xì)胞中分布定位以及翻譯的調(diào)節(jié)信號(hào)，對(duì)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)發(fā)揮核心作用。因此，某些養(yǎng)分可通過(guò)mRNA UTR，特別是3’UTR實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控作用[69-70]。

雷帕霉素靶向基因（mTOR）信號(hào)通路被認(rèn)為是一個(gè)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和細(xì)胞生長(zhǎng)的信號(hào)匯聚點(diǎn)，在基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯和核糖體合成等生物過(guò)程中發(fā)揮重要作用，對(duì)細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)、分化、自噬、血管形成發(fā)揮中心調(diào)控點(diǎn)的作用[71]。在哺乳動(dòng)物，氨基酸通過(guò)激活mTOR/p70 S6激酶轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與胰島素共同調(diào)節(jié)蛋白合成[72-73]。

蛋白激酶B（Akt）經(jīng)由磷酸化作用和FoxO1轉(zhuǎn)錄因子（FoxO1）調(diào)節(jié)代謝中間階段相關(guān)的基因表達(dá)，也通過(guò)TOR激活作用調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成[74]。TOR激活作用還有助于脂肪酸合成，主要通過(guò)阻斷固醇反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(SREBP1)成熟形式的核聚積和隨后的SREBP1靶基因的表達(dá)[75]。Lansard（2010）等[76]研究發(fā)現(xiàn)，在虹鱒肝細(xì)胞中，胰島素和氨基酸調(diào)節(jié)脂肪合成，并通過(guò)TOR-依賴途徑調(diào)節(jié)SREBP1基因表達(dá)。目前，魚類TOR信號(hào)通路的研究較少。Gutiérrez等[77]通過(guò)體外投喂飼料和體內(nèi)添加胰島素實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)虹鱒魚TOR信號(hào)通路的調(diào)節(jié)是通過(guò)對(duì)TOR及其下游 PKB、p70S6k等基因磷酸化實(shí)現(xiàn)的。然而，關(guān)于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是否通過(guò)影響TOR基因mRNA表達(dá)來(lái)調(diào)控TOR信號(hào)通路，從而調(diào)控魚體的生長(zhǎng)還在爭(zhēng)議中。Wu等[78]報(bào)道，飼料中添加膽堿會(huì)促進(jìn)建鯉后腸TOR基因的表達(dá)，影響肌肉和肝TOR mRNA表達(dá)。然而，Li等[5]報(bào)道，投喂含不同氨基酸的飼料對(duì)大黃魚仔稚魚TOR基因mRNA的表達(dá)未產(chǎn)生顯著影響。Luo等[79]也報(bào)道，營(yíng)養(yǎng)物對(duì)軍曹魚TOR基因的表達(dá)量無(wú)顯著影響。Lansard等[80]用高植物蛋白替代魚粉實(shí)驗(yàn)，也發(fā)現(xiàn)對(duì)虹鱒肝的TOR信號(hào)通路無(wú)顯著影響。因此，關(guān)于TOR信號(hào)通路在魚體的調(diào)控機(jī)制尚待研究。

3 小結(jié)

綜上所述，營(yíng)養(yǎng)素調(diào)節(jié)功能基因的表達(dá)是十分復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，其具體機(jī)制尚缺少了解。然而，該領(lǐng)域是分子營(yíng)養(yǎng)學(xué)的核心內(nèi)容，深入研究和理解之是營(yíng)養(yǎng)學(xué)者的使命。隨著營(yíng)養(yǎng)學(xué)特別是分子營(yíng)養(yǎng)學(xué)的發(fā)展，深入研究和理解營(yíng)養(yǎng)素對(duì)水生動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響及機(jī)理刻不容緩，只有綜合利用生理、生化、遺傳和現(xiàn)代分子生物學(xué)等技術(shù)，研究營(yíng)養(yǎng)素特別是必需營(yíng)養(yǎng)素對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育生物學(xué)的影響及機(jī)制，真正理解之，才能更積極主動(dòng)和正確地用營(yíng)養(yǎng)素調(diào)控水產(chǎn)動(dòng)物，有效促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物代謝、生長(zhǎng)發(fā)育和生產(chǎn)性能，發(fā)展規(guī)模的健康生態(tài)和可持續(xù)養(yǎng)殖漁業(yè)，努力提高經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。