非霍奇金淋巴瘤患者外周血及骨髓中免疫球蛋白、T細(xì)胞受體基因重排檢測的意義

丁士華，熊述道，翟志敏，秦慧，陶莉莉

(安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，合肥 230061)

淋巴細(xì)胞從原始的胚系構(gòu)型到分化成熟，其抗原受體通過基因重排形成有功能的基因。1個T、B細(xì)胞或其克隆性后代均只含1種獨特的分子遺傳學(xué)標(biāo)記，一旦某一克隆的淋巴細(xì)胞發(fā)生惡性變化，即可呈現(xiàn)特異的基因重排［1］。因此，免疫球蛋白(Ig)及T細(xì)胞受體(TCR)基因作為淋巴細(xì)胞單克隆增殖的主要分子標(biāo)志，可作為判斷是否存在惡性克隆的標(biāo)準(zhǔn)。為此，我們應(yīng)用PCR方法檢測非霍奇金淋巴瘤(NHL)中 Ig及 TCR基因重排情況，并探討其在MHL診斷、分期、預(yù)后等方面的價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2012年6月～2013年12月本院經(jīng)病理確診NHL患者60例，男34例、女26例，年齡19～82歲、中位年齡47歲。其中41例為B細(xì)胞淋巴瘤，19例為T細(xì)胞淋巴瘤。根據(jù)AnnArbor標(biāo)準(zhǔn)確定臨床分期，早期(Ⅰ～Ⅱ期)14例，晚期(Ⅲ～Ⅳ期)46例;按2010年WHO分類確定病理組織學(xué)惡性程度，低度惡性11例，中、高度惡性49例。

1.2 方法

1.2.1 檢測方法 收集患者治療前外周血及骨髓標(biāo)本，單個核細(xì)胞分離按常規(guī)方法進(jìn)行，RNA提取和cDNA合成應(yīng)用TRIZOL試劑盒，并應(yīng)用隨機(jī)引物和反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈;均按常規(guī)方法進(jìn)行。①BIOMED-2引物系統(tǒng):根據(jù)文獻(xiàn)［2］設(shè)計的引物組合共有14管97對引物，包含了IgH(A、B、C、D、E 共 5 管)、Igκ(A、B 共 2 管)、IgL(1管)、TCRβ(A、B、C 共 3 管)、TCRγ(A、B 共 2管)。這些引物組合后應(yīng)用于檢測Ig重鏈(H)、輕鏈(κ 和 λ)、TCRβ、TCRγ、TCRδ 基因重排;IgH 分成5 組:IgH-A、B、C、D、E;Igκ 分成 2 組:Igκ-A、B;TCRβ 分成 3組:TCRβ-A、B、C。TCRγ 分為 2組:TCRγ-A、B。所有引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，采用相同的擴(kuò)增條件和檢測方法，PCR實驗陽性對照為已知發(fā)生單克隆性基因重排的淋巴瘤病例;陰性對照為非淋巴瘤患者;空白對照以雙蒸水代替模板進(jìn)行擴(kuò)增。②PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件:擴(kuò)增采用25 mL反應(yīng)體系:10×緩沖液2.5 mL，25 mmoL/L MgCl21.5 μL，10 mmol/L dNTP0.5 μL，模板DNA 100 ng，每條引物10 pmol，Taq DNA聚合酶1 U，余用雙蒸水補(bǔ)足。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min，然后94℃變性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸90 s，擴(kuò)增35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min，4℃放置。樣本DNA均擴(kuò)增β-actin基因作為內(nèi)參照。③聚丙烯酰胺凝膠電泳:取5～10 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，溴化乙錠染色后，紫外透射儀下照相、觀察。

1.2.2 統(tǒng)計學(xué)方法 采用 SPSS18.0統(tǒng)計軟件，率以百分比表示，比較采用χ2檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 B、T細(xì)胞Ig及TCR基因重排陽性率 41例B細(xì)胞NHL中，出現(xiàn)IgH基因重排16例，其中IgH和TCR雙重重排1例，IgH基因重排陽性率為39.02%。19例T細(xì)胞NHL有7例擴(kuò)增出TCR基因重排帶，基因重排陽性率為36.84%。B、T細(xì)胞NHL Ig及TCR基因重排陽性率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)。

2.2 不同分期、不同惡性度NHL患者Ig及TCR基因重排陽性率 NHL基因重排陽性率在早期和晚期患者中分別為 28.57%(4/14)及41.30%(19/46);低度惡性 NHL(包括B系的FL及 MALT)與中、高度 NHL(除 FL、MALT的 B-或 T-NHL)Ig及TCR基因單克隆重排陽性率分別為36.36%(4/11)和38.78%(19/49);不同分期、不同惡性度患者基因重排陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均＞0.05)。

2.3 基因重排與骨髓侵犯 對53例NHL骨髓標(biāo)本進(jìn)行骨髓涂片形態(tài)學(xué)檢查，異形淋巴細(xì)胞≥5%為骨髓侵犯。結(jié)果53例NHL患者中有6例檢出骨髓侵犯(其中4例為Ⅳ期B-NHL、2例為Ⅳ期T-NHL)，陽性率為11.32%，低于骨髓Ig及TCR基因重排檢測的陽性率37.73%(20/53)，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.01)。

2.4 外周血與骨髓Ig及TCR基因重排 53例同時行骨髓及外周血檢測，其骨髓Ig及TCR基因重排的陽性率37.73%(20/53)，而外周血Ig及TCR基因重排的陽性率為30.19%(16/53)，兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)。

2.5 隨訪結(jié)果 對14例NHL患者化療前后骨髓標(biāo)本進(jìn)行了跟蹤觀察，化療前骨髓基因重排均有陽性帶，經(jīng)化療后均達(dá)到臨床完全緩解，但檢測重排帶與臨床不完全一致，3例仍有基因重排陽性帶。其中1例為彌漫大B淋巴細(xì)胞淋巴瘤Ⅳ期，1例為套細(xì)胞淋巴瘤Ⅳ期，1例為外周T細(xì)胞性淋巴瘤Ⅲ期。彌漫大B淋巴細(xì)胞淋巴瘤化療前IgH重排陽性，CHOP化療達(dá)到臨床完全緩解后，復(fù)查IgH重排仍陽性，給予R-ECHOP強(qiáng)化鞏固治療。治療結(jié)束復(fù)查基因重排無陽性帶，現(xiàn)已無復(fù)發(fā)存活1.5年。T細(xì)胞淋巴瘤化療前TCR陽性，化療達(dá)臨床完全緩解后，TCR重排檢測仍陽性;患者治療結(jié)束后迅速復(fù)發(fā)，給予二線化療方案治療，療效差，現(xiàn)已死亡(從確診到死亡僅11個月)。外周T細(xì)胞性淋巴瘤出院時與入院基因重排檢測均出現(xiàn)TCR陽性帶，出院后于短期內(nèi)(45 d)復(fù)發(fā)并侵及顱內(nèi)，進(jìn)展為Ⅳ期，給予Hyper-CVAD方案，并行鞘內(nèi)注射(Ara-C/MTX)，現(xiàn)存活22個月。

3 討論

基因重排是淋巴細(xì)胞發(fā)育成熟的一個正常生理過程。淋巴細(xì)胞從原始胚系構(gòu)型到分化成熟，基因組上彼此分離的DNA片段通過重組才能形成有功能的基因，進(jìn)而表達(dá)抗原受體，即Ig和 TCR［3］。正常淋巴細(xì)胞在發(fā)育中是多克隆性質(zhì)，但淋巴造血系統(tǒng)腫瘤所具有的是單克隆性重排，也就是全部腫瘤細(xì)胞具有一個相同的Ig或TCR基因重排，即表現(xiàn)為重排基因為單一模式，它是克隆性增生和譜系來源的標(biāo)志，已被公認(rèn)為淋巴瘤診斷、鑒別診斷和治療后監(jiān)測的重要指標(biāo)［4，5］。

本研究采用Ig和TCR基因重排的克隆性分析，覆蓋了絕大部分的功能性基因片段，所有引物采用相同的擴(kuò)增條件和檢測方法，操作性強(qiáng)，具有很高的敏感性和特異性。盡管如此，本結(jié)果顯示的骨髓和外周血Ig及TCR基因重排陽性率遠(yuǎn)低于相關(guān)報道［6～8］，考慮與不同類型 NHL 本身的增殖、播散特點有關(guān)。NHL早期以局限于結(jié)內(nèi)病變?yōu)橹?，進(jìn)展期或晚期才出現(xiàn)結(jié)外或骨髓浸潤，導(dǎo)致了Ig及TCR基因重排陽性率的差異。

本研究還出現(xiàn)1例免疫組化確定為B細(xì)胞來源的淋巴瘤具有IgH和TCR兩種重排的病例，這種現(xiàn)象被稱為序列失真現(xiàn)象［9］。目前認(rèn)為該現(xiàn)象的產(chǎn)生是由于Ig和TCR基因既具有同源性，又有相同的重組酶。當(dāng)發(fā)生重排的調(diào)節(jié)機(jī)制異常時，相同的重組酶就可以將兩個基因錯誤地進(jìn)行重排。盡管IgH或TCR進(jìn)行了錯誤重排，但其他標(biāo)志性表面抗原不會改變，結(jié)合免疫組化檢查仍可確定為B或T細(xì)胞來源，故在區(qū)分B細(xì)胞與T細(xì)胞來源時，一定要結(jié)合細(xì)胞形態(tài)學(xué)和免疫組織化學(xué)，而不能單純地應(yīng)用基因重排類型來確定。

骨髓涂片及活檢是目前臨床上判斷NHL是否侵犯骨髓的常用方法。由于受瘤細(xì)胞的分布特點(灶性)及抽吸負(fù)壓被血液稀釋，或因骨髓網(wǎng)狀纖維含量增加及瘤細(xì)胞致密等因素的影響，抽吸取材假陰性率較高，且常因腫瘤細(xì)胞數(shù)目少、與周圍正常的細(xì)胞形態(tài)相似而容易導(dǎo)致漏檢。本研究中患者骨髓涂片檢查發(fā)現(xiàn)骨髓侵犯的陽性率明顯低于Ig、TCR基因單克隆重排陽性率。因此多重PCR檢測有利于腫瘤細(xì)胞比例低于5%的骨髓微小轉(zhuǎn)移的發(fā)現(xiàn)，可用于早期發(fā)現(xiàn)淋巴瘤的骨髓侵犯及治療后的骨髓復(fù)發(fā)［10］。

本研究提示，單克隆基因重排陽性率在不同臨床分期和惡性程度的NHL中差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明NHL可能早期已有骨髓轉(zhuǎn)移，低度惡性NHL也具有相當(dāng)高的單克隆基因重排陽性率，這比傳統(tǒng)的AnnArbor分期更能反映NHL的本質(zhì)，說明NHL為全身彌漫性疾病，其治療原則支持以化療為主的全身治療。

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