缺血預(yù)處理對(duì)下頜下腺缺血再灌注損傷大鼠的保護(hù)作用

孫斌，高峻田，石亮，宋代輝，魏奉才(山東大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，山東省口腔生物醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南500; 山東大學(xué)齊魯醫(yī)院，山東大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)研究所)

缺血預(yù)處理對(duì)下頜下腺缺血再灌注損傷大鼠的保護(hù)作用

孫斌1，高峻田2，石亮2，宋代輝1，魏奉才2
(1山東大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，山東省口腔生物醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南250012; 2山東大學(xué)齊魯醫(yī)院，山東大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)研究所)

摘要:目的觀察缺血預(yù)處理(IPC)對(duì)下頜下腺缺血再灌注(I/R)損傷大鼠的保護(hù)作用，并探討其機(jī)制。方法將48只大鼠隨機(jī)分為模型組和觀察組各24只，均制作右側(cè)下頜下腺I(mǎi)/R損傷模型。觀察組在制模前行IPC，夾閉頜外動(dòng)脈下頜下腺供血支3 min，再灌注3 min，重復(fù)3次。以左側(cè)下頜下腺作為對(duì)照組。再灌注1、12、24、72 h，取6只大鼠檢測(cè)各組腺體分泌量、組織學(xué)變化、緊密連接結(jié)構(gòu)及M受體表達(dá)情況。結(jié)果對(duì)照組腺體分泌量、組織形態(tài)、緊密連接結(jié)構(gòu)及M受體表達(dá)情況均正常。I/R后1、12 h，模型組腺體分泌量明顯降低，觀察組稍有降低，24 h時(shí)兩組分泌量開(kāi)始增加，至72 h逐漸恢復(fù)正常。模型組腺實(shí)質(zhì)細(xì)胞萎縮，間質(zhì)水腫及炎癥浸潤(rùn)，電鏡下超微結(jié)構(gòu)觀察顯示緊密連接結(jié)構(gòu)破壞，寬度降低，均在再灌注12 h后最為嚴(yán)重，觀察組部分腺體組織出現(xiàn)上述情況，且反應(yīng)較輕。模型組I/R后，M受體水平1、12 h下降明顯，觀察組稍有下降，72 h時(shí)逐漸恢復(fù)。結(jié)論IPC對(duì)下頜下腺I(mǎi)/R損傷大鼠具有保護(hù)作用，其機(jī)制與上調(diào)下頜下腺M(fèi)受體的表達(dá)、保護(hù)下頜下腺緊密連接結(jié)構(gòu)有關(guān)。

關(guān)鍵詞:缺血預(yù)處理;缺血再灌注;下頜下腺;下頜下腺移植;角膜干燥癥

重癥角膜干燥癥(干眼病)多采取血管化自體下頜下腺移植治療。研究顯示，缺血再灌注(I/R)損傷會(huì)導(dǎo)致下頜下腺分泌降低，而缺血預(yù)處理(IPC)對(duì)移植下頜下腺的分泌功能有一定保護(hù)作用［1］。為了探討IPC對(duì)下頜下腺I(mǎi)/R損傷大鼠的保護(hù)作用及其機(jī)制，2014年3～9月，我們進(jìn)行了如下研究。

1　材料與方法

1.1材料健康雄性Wistar大鼠48只，體質(zhì)量約200 g，由山東大學(xué)動(dòng)物中心提供。4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，Sigma公司) ;冰凍切片機(jī);激光共聚焦顯微鏡(Leica，TCS，SP2) ;透射電子顯微鏡H-7000(Hitachi，Tokyo，日本)。

1.2模型制作及干預(yù)方法將大鼠隨機(jī)分為模型組和觀察組，各24只，均制作右側(cè)下頜下腺I(mǎi)/R損傷模型，以左側(cè)下頜下腺作為對(duì)照組。腹腔注射10%水合氯醛麻醉，頸部正中切口分離肌肉、筋膜，尋找下頜下腺血管、神經(jīng)及下頜下腺導(dǎo)管束，游離并保護(hù)舌神經(jīng)支配下頜下腺的分支，保留副交感神經(jīng)的支配作用。夾閉頜外動(dòng)脈下頜下腺供血支90 min后行再灌注恢復(fù)血流。觀察組于制模前行IPC，夾閉頜外動(dòng)脈下頜下腺供血支3 min，再灌注3 min，重復(fù)3次。

1.3相關(guān)指標(biāo)觀察

1.3.1下頜下腺分泌量于再灌注1、12、24、72 h各取6只大鼠，于麻醉狀態(tài)下分離損傷側(cè)及對(duì)照側(cè)下頜下腺導(dǎo)管至口底并切斷，于斷端處插入直徑約0.5 mm的聚乙烯塑料小管，行Schirmer試驗(yàn)測(cè)定下頜下腺分泌量，以5 min內(nèi)濾紙條(35 mm×5 mm)濕潤(rùn)長(zhǎng)度表示，測(cè)量3次取均值。

1.3.2下頜下腺組織形態(tài)①組織學(xué)形態(tài):測(cè)定下頜下腺分泌量后，游離大鼠雙側(cè)下頜下腺并摘除，各取部分組織用10%中性甲醛固定，水洗、脫水、透明、包埋后切成5 μm厚切片，HE染色后封固，于光學(xué)顯微鏡下觀察腺體組織學(xué)形態(tài)。②緊密連接結(jié)構(gòu):另取腺體組織塊約1 mm3，2.5%戊二醛固定，切片后用醋酸雙氧鈾及枸椽酸鉛染色，于透射電子顯微鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野，觀察下頜下腺腺體細(xì)胞間緊密連接超微結(jié)構(gòu)，使用圖形測(cè)量軟件測(cè)量其寬度，取均值。

1.3.3下頜下腺組織M1、M3受體采用免疫熒光法檢測(cè)?？筂1、M3受體(1∶100)免疫標(biāo)記組織切片，4℃孵育過(guò)夜。次日取出后室溫下復(fù)溫30 min，滴加熒光FITC標(biāo)記二抗(1∶50) 37℃孵育30 min，滴加DAPI(著染細(xì)胞核)孵育3 min，0.01 mmol/L PBS漂洗，封片，使用激光共聚焦顯微鏡觀察。M1、M3受體定位于腺泡細(xì)胞細(xì)胞膜與細(xì)胞質(zhì)中，免疫熒光標(biāo)記顯示綠色熒光，以綠色熒光信號(hào)強(qiáng)度來(lái)衡量其表達(dá)強(qiáng)弱。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SAS9.1.3統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1三組下頜下腺分泌量對(duì)照組下頜下腺分泌量正常，各時(shí)間點(diǎn)均無(wú)明顯變化。I/R后1、12 h，模型組、觀察組腺體分泌量降低，模型組降低更為明顯著(P均＜0.05) ; I/R后24 h兩組下頜下腺分泌量開(kāi)始增加; I/R后72 h兩組恢復(fù)正常。見(jiàn)表1。

表1　三組I/R各時(shí)間段下頜下腺分泌量比較(mm，±s)

注:與對(duì)照組比較，*P＜0.05;與模型組比較，△P＜0.05。

組別　n 下頜下腺分泌量1 h　12 h　24 h　72 h觀察組　6 3.67±0.25*Δ3.00±0.18*Δ4.00±0.43　3.58±0.30模型組　6 1.75±0.21*1.92±0.24*　4.08±0.30　3.67±0.33對(duì)照組6 4.04±0.25　3.83±0.23　3.83±0.21　4.04±0.24

2.2三組下頜下腺組織形態(tài)學(xué)

2.2.1組織學(xué)形態(tài)對(duì)照組為正常腺泡及導(dǎo)管形態(tài)。I/R后1 h模型組腺體實(shí)質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)輕度萎縮，間質(zhì)水腫和充血，可見(jiàn)少量單核細(xì)胞;觀察組與對(duì)照組形態(tài)相近。I/R后12 h模型組腺泡細(xì)胞及導(dǎo)管細(xì)胞嚴(yán)重萎縮，組織水腫明顯，導(dǎo)管系統(tǒng)組織破壞，腺小葉及腺導(dǎo)管中炎癥反應(yīng)較輕，以早期中性粒細(xì)胞為主;觀察組少部分腺體組織出現(xiàn)模型組情況，但反應(yīng)較輕。I/R后24 h兩組均可見(jiàn)炎癥反應(yīng)，以少量單核—巨噬細(xì)胞為主，組織水腫減輕。I/R后72 h兩組腺體逐漸恢復(fù)，腺泡及導(dǎo)管形態(tài)恢復(fù)正常。

2.2.2緊密連接結(jié)構(gòu)對(duì)照組相鄰腺泡上皮細(xì)胞間靠近腺泡腔處存在完整、清晰的細(xì)胞間緊密連接。I/R后1 h，模型組相鄰腺泡上皮細(xì)胞間的緊密連接變模糊，結(jié)構(gòu)開(kāi)始崩塌，電子密度降低明顯，與對(duì)照組相比，細(xì)胞間緊密連接的寬度明顯減少(P＜0.05)，I/R后12 h更為明顯(P＜0.01)。觀察組I/R后1、12 h緊密連接寬度減少明顯，但是在電鏡下結(jié)構(gòu)仍較清晰，并且在I/R 后12、24 h與模型組相比P＜0.05。I/R后24 h觀察組與模型組細(xì)胞間緊密連接電子強(qiáng)度逐漸增加，至72 h兩組相鄰腺泡上皮細(xì)胞間緊密連接的超微結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)成正常的索狀結(jié)構(gòu)。三組細(xì)胞緊密連接結(jié)構(gòu)寬度比較見(jiàn)表2。

表2　三組I/R各時(shí)間段緊密連接結(jié)構(gòu)寬度比較(nm，±s)

注:與對(duì)照組比較，*P＜0.05;與模型組比較，#P＜0.05。

組別　n 緊密連接結(jié)構(gòu)寬度1 h　12 h　24 h　72 h觀察組　6　10.74±0.20*10.34±0.30* #12.80±0.22* #16.05±0.27模型組　6　9.64±0.16*　4.02±0.17*　8.66±0.26*　15.19±0.14*對(duì)照組　6　17.04±0.63　18.08±0.46　17.46±0.38　16.94±0.51

2.3三組M1、M3受體表達(dá)I/R后12 h，模型組M1、M3受體熒光信號(hào)信號(hào)較對(duì)照組明顯下降，觀察組熒光信號(hào)強(qiáng)度明顯高于模型組; I/R后24 h模型組與觀察組熒光信號(hào)開(kāi)始明顯升高，72 h時(shí)模型組與觀察組的M1、M3受體熒光信號(hào)強(qiáng)度逐漸接近對(duì)照組。

3　討論

自體下頜下腺移植治療重癥干眼病需經(jīng)歷I/R的過(guò)程，I/R后血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，組織滲出增多，白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞激活，導(dǎo)致多種趨化因子和細(xì)胞黏附分子大量生成、釋放，進(jìn)一步介導(dǎo)下頜下腺局部組織細(xì)胞的炎癥損傷。正常頜下腺的分泌主要由交感和副交感神經(jīng)調(diào)節(jié)，其中主要由副交感神經(jīng)末梢釋放的乙酰膽堿(Ach)通過(guò)激活M受體來(lái)調(diào)控水和電解質(zhì)分泌。M1、M3受體主要參與腺體水和電解質(zhì)的分泌，維持并保護(hù)腺體的分泌功能［2，3］。研究表明，M受體及其信號(hào)通路在I/R引起的腦血管、心臟等疾病表達(dá)中均下調(diào)，再灌注損傷的組織受到大量活性氧等自由基刺激而造成損害，IPC能有效緩解相應(yīng)組織損傷［4］。我們的前期研究證實(shí)，家兔下頜下腺移植早期M1與M3受體mRNA與蛋白表達(dá)及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路均下調(diào)。對(duì)M受體下游通路進(jìn)一步研究顯示，自由基清除劑金屬蛋白酶抑制劑(MPI)可阻斷Ach的保護(hù)作用，證實(shí)適量的活性氧是Ach作用于M受體預(yù)處理保護(hù)機(jī)制的第二信使［5］。唾液是通過(guò)旁細(xì)胞途徑形成的，研究顯示旁細(xì)胞途徑是體外灌注的家兔和大鼠下頜下腺水轉(zhuǎn)運(yùn)的主要方式［6］。旁細(xì)胞途徑由相鄰細(xì)胞之間的連接復(fù)合體和細(xì)胞間隙組成，緊密連接位于連接復(fù)合體的最頂端，是物質(zhì)通過(guò)旁細(xì)胞通路轉(zhuǎn)運(yùn)的限制因素，具有屏障和柵欄的功能［7］。緊密連接的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)是組織器官許多病理生理變化的基礎(chǔ)，如I/R損傷。大量研究發(fā)現(xiàn)，在大腦、肺、腸道等器官發(fā)生I/R，其相應(yīng)細(xì)胞間的緊密連接都會(huì)發(fā)生不同程度的損傷［8，9］。本研究觀察了I/R與IPC后大鼠下頜下腺組織在電鏡下緊密連接的超微結(jié)構(gòu)及緊密連接的寬度，結(jié)果顯示，I/R 后1、12 h，I/R大鼠下頜下腺腺泡細(xì)胞間的緊密連接結(jié)構(gòu)崩塌，緊密連接寬度降低，而IPC能相對(duì)改善緊密連接結(jié)構(gòu)、寬度。提示緊密連接蛋白結(jié)構(gòu)的改變參與了腺體的前期分泌降低，IPC可能通過(guò)調(diào)控M受體維持緊密連接蛋白固有結(jié)構(gòu)從而起到保護(hù)作用，從而改善下頜下腺的分泌功能。

本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠下頜下腺在保留神經(jīng)支配的情況下行I/R 1～12 h，腺體的分泌功能較正常側(cè)明顯降低，顯微鏡下觀察到腺泡細(xì)胞與導(dǎo)管細(xì)胞萎縮，間質(zhì)組織水腫及炎癥反應(yīng)明顯等組織學(xué)改變，這與I/R后腺體的分泌功能變化相符，證實(shí)I/R后的損傷—應(yīng)激反應(yīng)是移植下頜下腺早期分泌功能損傷低下的重要原因;而觀察組腺體組織損傷明顯減輕，I/R 12 h后下頜下腺的分泌量明顯提高。證明IPC能減輕I/R引起的早期下頜下腺損傷，改善早期移植下頜下腺的分泌功能。

綜上所述，I/R可能導(dǎo)致大鼠下頜下腺M(fèi)受體表達(dá)下降，引起下頜下腺組織損傷，從而影響下頜下腺的分泌功能;而IPC可有效改善上述變化，對(duì)下頜下腺I(mǎi)/R損傷具有保護(hù)作用。其機(jī)制與上調(diào)下頜下腺M(fèi)受體表達(dá)、保護(hù)下頜下腺緊密連接結(jié)構(gòu)有關(guān)。

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Protective effect and mechanism of ischemic preconditioning on rat submandibular gland after ischemia-reperfusion injury

SUN bin1，GAO Jun-tian，SHI Liang，SONG Dai-hui，WEI Feng-cai
(1 School of Stomatology，Shandong University，Shandong Provincial Key Laboratory of Oral Biomedicine，Jinan 250012，China)

Abstract:Objective To observe the protective effect of ischemic preconditioning (IPC) on the rat submandibular gland after ischemia-reperfusion (I/R) injury and to investigate the mechanism.Methods Forty-eight healthy male Wistar rats were randomly divided into the observation group and model group，24 in each group.The right glands of rats in both groups received the I/R injury to make the I/R injury models.The glands of the observation group were obtained by 3 min of ischemia，followed by 3 min of reperfusion，and we performed three times before modeling.The left glands were taken as the control group.Salivary secretion，histological changes，alternations of tight junctions (TJs) and mACh-receptor levels in 6 rats were detected at different time points (1 h，12 h，24 h and 72 h after I/R).Results In the control group，the salivary secretion，histological changes，alternations of tight junctions (TJs) and mACh-receptor expression levels were all normal.In the model group，the secretion of the glands significantly decreased after I/R 1 h and 12 h，and it showed a slightly lower in the observation group.The secretion of both groups gradually increased at 24 h and got back to normal at 72 h after reperfusion.Cellular atrophy，inflammatory cells infiltration，tissue edema，the collapse and reduced widths of TJs were observed especially after reperfusion for 12 h in the model group，a little part showed the status and the reaction was lighter in the observation group.The level of mACh-receptor exhibited the same tendency，and lower mAChreceptor levels at 12 h after reperfusion were observed in the model group; while in the observation group，it gradually returned to normal.ConclusionIPC has the protective effect on the rat submandibular gland after I/R injury，whose mechanism may be related with the down-regulation of mACh-receptor and protection of TJs.

Key words:ischemic preconditioning; ischemia-reperfusion; submandibular glands; transplantation of submandibular glands; keratoconjunctivitis sicca

(收稿日期:2014-12-04)

通信作者:宋代輝

基金項(xiàng)目:山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(ZR2010HM037)。

文章編號(hào):1002-266X(2015)18-0027-03

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類(lèi)號(hào):R322.2

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.18.009