外周血單核細(xì)胞miRNA-146a與冠狀動(dòng)脈病變復(fù)雜性的關(guān)系

陳麗媛，符春暉，嚴(yán)華，陸永光，黃軍章

(欽州市第二人民醫(yī)院，廣西欽州535000)

近年來研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs在包括細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、動(dòng)脈粥樣硬化以及腫瘤等多種生物學(xué)和疾病過程中發(fā)揮重要作用［1～4］。研究發(fā)現(xiàn)，miR-146a 在炎癥、免疫相關(guān)的疾病中均明顯上調(diào)，且與動(dòng)脈粥樣硬化性疾病密切相關(guān)［5，6］。因此，miR-146a 可能作為一種有臨床診斷價(jià)值的炎癥因子，為動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的診斷提供新的方法。到目前為止，國內(nèi)外研究尚無miR-146a與冠狀動(dòng)脈病變復(fù)雜程度之間相關(guān)性的研究。因此，本研究首次對(duì)miR-146a與SYNTAX積分之間的相關(guān)性進(jìn)行探討，以期找到新的預(yù)測(cè)冠狀動(dòng)脈病變復(fù)雜性的診斷因子，為冠心病的診斷及預(yù)后評(píng)價(jià)提供新的方法和思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2012年3月～2013年12月欽州市第二人民醫(yī)院心血管內(nèi)科住院接受冠狀動(dòng)脈造影術(shù)的患者90例，其中男47例、女43例，年齡(62.04±8.12)歲。根據(jù)臨床資料及造影結(jié)果將所有納入患者分為冠脈正常組、穩(wěn)定性心絞痛組、急性冠脈綜合征組，各30例。排除標(biāo)準(zhǔn):①全身各系統(tǒng)急、慢性感染;②嚴(yán)重肝腎功能不全;③風(fēng)濕性疾病;④自身免疫性疾病;⑥既往行血運(yùn)重建術(shù);⑦主動(dòng)脈夾層;⑧心包炎。本研究符合人體試驗(yàn)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，并得到倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)以及患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 入院次日早晨空腹情況下，采集患者外周靜脈血4 mL，肝素鈉抗凝，F(xiàn)icoll法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，PBS洗滌，－80℃儲(chǔ)存待檢。

1.2.2 miR-146a檢測(cè) 采用 Real-time PCR法檢測(cè)miR-146a，嚴(yán)格按照總RNA提取試劑盒(德國QIAGEN公司)說明書進(jìn)行RNA提取。取總RNA 10 μL，DEPC 水 2.5 μL，10 mmol/L dNTP 2.0 μL，RNase抑制劑 0.5 μL，miR-146a 逆轉(zhuǎn)錄引物 0.5 μL，cel-miR-146a逆轉(zhuǎn)錄引物 0.5 μL，5 × buffer 5.0 μL，M-MLV 1.0 μL，配成總體系后混勻 42 ℃孵育。將獲得的 cDNA按1∶20稀釋，取5 μL;2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，PCR Reverse primer 0.5 μL，PCR forward primer 0.5 μL，雙氧水4 μL混勻。按照95℃ 5 min→95℃ 15 s→65℃ 15 s→72℃ 32 s進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。結(jié)果以PCR管內(nèi)熒光信號(hào)達(dá)到最低可檢測(cè)值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)C(T)值表示。miR-146a與內(nèi)參 U6的相對(duì)表達(dá)量用2－ΔΔCT表示。

1.2.3 冠狀動(dòng)脈造影檢查 所有納入患者在住院期間完成冠狀動(dòng)脈造影檢查，給予至少4個(gè)體位觀察左冠狀動(dòng)脈病變情況，至少2個(gè)體位觀察右冠狀動(dòng)脈病變情況。冠狀動(dòng)脈病變情況通過SYNTAX積分［7］進(jìn)行評(píng)價(jià)。冠狀動(dòng)脈病變定義為直徑≥1.5 mm的血管目測(cè)的管腔直徑狹窄≥50%的病變。每個(gè)病變給予相應(yīng)積分，總的SYNTAX積分即為所有病變積分的總和。冠狀動(dòng)脈造影最終結(jié)果和總SYNTAX積分由我科兩個(gè)高級(jí)職稱醫(yī)師進(jìn)行評(píng)價(jià)并通過協(xié)商達(dá)成一致結(jié)論，最終計(jì)算并記錄所有患者的SYNTAX積分。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用±s表示，多組間比較采用One-way ANOVA分析，如果組間方差不齊，則采用Welch法進(jìn)行組間比較，組間多重比較采用Dunnetts'T3檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析。以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 各組mirRNA-146a RNA比較 冠脈正常組、穩(wěn)定性心絞痛組、急性冠脈綜合征組miR-146a相對(duì)表達(dá)量分別為 2.50 ± 0.85、2.84 ± 1.06、4.31 ±1.85，P ＜0.01。根據(jù) SNYTAX 積分，進(jìn)一步將冠心病患者分為低分組(＜23分)和高分組(≥23分)，高分組miR-146a相對(duì)表達(dá)量明顯高于低分組(4.92±1.41 vs 2.86 ±0.91，P=0.026)。

2.2 相關(guān)性分析 對(duì)miR-146a RNA相對(duì)表達(dá)量與SYNTAX積分進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，miR-146a相對(duì)表達(dá)量與SYNTAX積分呈正相關(guān)(r=0.588，P ＜0.01)。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，與穩(wěn)定性冠心病患者相比，急性冠脈綜合征患者的外周血單核細(xì)胞中miR-146a表達(dá)明顯升高，且與血漿 TNF-α呈正相關(guān)［8］。在本研究中，與冠脈正常組、穩(wěn)定性心絞痛組比較，急性冠脈綜合征患者外周血單核細(xì)胞中miR-146a相對(duì)表達(dá)量明顯升高，提示mic-146a參與的炎癥調(diào)控機(jī)制可能在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定中發(fā)揮作用。

SYNTAX積分是一種對(duì)冠狀動(dòng)脈病變嚴(yán)重程度進(jìn)行分層的有效方法。研究證實(shí)，隨著SYNTAX積分增加，冠心病患者再次血運(yùn)重建及遠(yuǎn)期不良心臟事件增加［7］。因此，本研究中將SYNTAX積分作為冠狀動(dòng)脈病變嚴(yán)重程度的指標(biāo)。在進(jìn)一步對(duì)miR-146a的研究發(fā)現(xiàn)，SYNTAX積分高的患者，miR-146a相對(duì)表達(dá)量明顯升高，且與SYNTAX積分呈明顯的正相關(guān)性，提示miR-146a可能對(duì)外周血管疾病的評(píng)價(jià)具有一定的臨床意義。本研究的創(chuàng)新之處在于首次探討并發(fā)現(xiàn)miR-146a與冠狀動(dòng)脈病變的復(fù)雜性之間存在明顯相關(guān)性，提示miR-146a在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮調(diào)控作用，且有可能作為診斷工具應(yīng)用于臨床，指導(dǎo)冠心病患者的危險(xiǎn)分層及預(yù)后評(píng)價(jià)。不足及局限之處在于，本研究?jī)H僅在miR-146a與冠狀動(dòng)脈病變之間的相關(guān)性進(jìn)行了簡(jiǎn)單分析，對(duì)其潛在的調(diào)控機(jī)制未進(jìn)行深入研究。此外，由于樣本量的限制，本研究并沒有進(jìn)一步對(duì)miR-146a診斷冠狀動(dòng)脈病變復(fù)雜性的特異性及敏感性進(jìn)行分析。

在今后的工作中，我們將通過在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)miR-146a在動(dòng)脈粥樣硬化中的機(jī)制進(jìn)行探討。同時(shí)在臨床研究中，通過納入更多的患者進(jìn)行診斷及隨訪，以進(jìn)一步評(píng)價(jià)miR-146a對(duì)冠狀動(dòng)脈病變復(fù)雜程度的診斷價(jià)值及提供更多的預(yù)后信息。

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