妊娠早期外周血白細(xì)胞線粒體DNA含量與妊娠糖尿病患病率的關(guān)系

陳旖鹛，張彤，李萬(wàn)根，陳勇霞，牛建民，王芳，李子昊(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，廣州060;南方醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院; 廣東省婦幼保健院;廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院; Alington Friends School)

妊娠早期外周血白細(xì)胞線粒體DNA含量與妊娠糖尿病患病率的關(guān)系

陳旖鹛1，張彤2，李萬(wàn)根1，陳勇霞1，牛建民3，王芳4，李子昊5
(1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，廣州510260;2南方醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院; 3廣東省婦幼保健院;4廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院;5 Alington Friends School)

摘要:目的觀察妊娠早期外周血白細(xì)胞線粒體DNA(mtDNA)含量是否與妊娠糖尿病(GDM)患病相關(guān)。方法選取妊娠＜12孕周者206例，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)研究對(duì)象外周血妊娠早期白細(xì)胞mtDNA含量的值，以mtDNA與核DNA(nDNA)含量比值(mtDNA/nDNA)表示;根據(jù)mtDNA含量中位數(shù)分為低mtDNA含量組(n=103)和高mtDNA含量組(n=103)。測(cè)定妊娠早期空腹葡萄糖、空腹胰島素等葡萄糖代謝指標(biāo)，計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR) ;妊娠24～28周行口服葡萄糖耐量試驗(yàn)，分別統(tǒng)計(jì)兩組GDM患病率。結(jié)果低mtDNA含量組和高mtDNA含量組妊娠24～28周GDM患病率分別為10.7%和6.8%，P＞0.05;兩組妊娠早期空腹葡萄糖、胰島素和HOMA-IR比較，P均＞0.05。結(jié)論妊娠早期外周血白細(xì)胞mtDNA含量與GDM無(wú)明顯相關(guān)性。

關(guān)鍵詞:妊娠并發(fā)癥;線粒體DNA含量;妊娠糖尿病;妊娠早期

妊娠糖尿病(GDM)指妊娠后首次出現(xiàn)的不同程度糖耐量減低的疾病，發(fā)生率各國(guó)報(bào)道為1%～21%［1，2］，近年有明顯增高趨勢(shì)。母體GDM不僅危害到母體本身及宮內(nèi)胎兒的成長(zhǎng)，也對(duì)胎兒出生后健康造成不利影響;因?yàn)樘洪L(zhǎng)時(shí)間暴露在高血糖的子宮內(nèi)環(huán)境中，其將來(lái)發(fā)生代謝性疾病的風(fēng)險(xiǎn)大大增高［3］，如易發(fā)生代謝綜合征等。找出GDM患病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)指標(biāo)并及時(shí)給予干預(yù)，對(duì)預(yù)防GDM發(fā)病有重要意義。有報(bào)道2型糖尿病(T2DM)及糖尿病前期患者的白細(xì)胞線粒體DNA(mtDNA)數(shù)量下降，推測(cè)mtDNA含量下降參與了T2DM發(fā)病過(guò)程［4］。因?yàn)镚DM和T2DM具有相似的發(fā)病機(jī)制［5］，所以本文通過(guò)檢測(cè)妊娠早期外周血白細(xì)胞中mtDNA含量和葡萄糖代謝指標(biāo)，分析mtDNA含量變化是否也參與GDM的發(fā)病過(guò)程。

1　資料與方法

1.1臨床資料選取2012年7月～2013年6月因停經(jīng)就診于廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院婦科門診確診妊娠者206例，年齡(27.5±3.9)歲，均為妊娠早期(＜12孕周)，并簽署知情同意書。排除糖尿病合并妊娠(第一次孕檢FPG≥7.0 mmol/L)，患有代謝綜合征、腫瘤、心肝腎和其他系統(tǒng)嚴(yán)重疾病等可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果者，抽煙史或規(guī)律服藥史。

1.2方法

1.2.1mtDNA檢測(cè)方法妊娠早期抽取研究對(duì)象空腹靜脈血2 mL，以EDTA抗凝;離心分離血漿后，于－80℃冰箱保存。使用天根生化(北京)科技有限公司的血液基因組提取試劑盒(離心柱型)提取血液基因組DNA，－80℃冰箱保存。采用實(shí)時(shí)定量PCR法測(cè)定研究對(duì)象外周血白細(xì)胞mtDNA相對(duì)含量，采用瑞士羅氏公司的LightCycler 480及原廠配套試劑SYBR GREEN I Master染料進(jìn)行檢測(cè)。引物序列參照文獻(xiàn)報(bào)道［6］，mtDNA的引物序列:正向引物為mtF3212(5'-CACCCAAGAACAGGGTTTGT-3')，反向引物為mtR3319(5'-TGGCCATGGGTATGTTGTTAA-3') ; 18 S RNA為核DNA(nDNA)內(nèi)參照，正向引物為18 S 1546F(5'-TAGAGGGACAAGTGGCGTTC-3')，反向引物為18 S 1650R(5'-CGCTGAGCCAGTCAGTGT-3')。mtDNA相對(duì)含量以mtDNA/nDNA表示。反應(yīng)體系(15 μL) : ddH2O 4.9 μL，SYBR Green I Master 7.5 μL，PCR正向引物(10 μmol/L) 0.3 μL，PCR反向引物(10 μmol/L) 0.3 μL，待測(cè)DNA模板2 μL。反應(yīng)條件: 95℃預(yù)變性10 min; 95℃變性10 s，60℃退火20 s和72℃延伸20 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本重復(fù)3次，設(shè)置無(wú)模板陰性對(duì)照以排除假陽(yáng)性。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用2－ΔCt進(jìn)行處理，ΔCt=Ct(mtDNA)－Ct(nDNA)，2－ΔCt表示mtDNA和nDNA起始拷貝數(shù)比值作為每個(gè)標(biāo)本的mtDNA相對(duì)含量，其中Ct為標(biāo)本擴(kuò)增到規(guī)定閾值時(shí)PCR循環(huán)數(shù)。

1.2.2葡萄糖代謝指標(biāo)檢測(cè)方法使用德國(guó)羅氏公司的COBAS8000全自動(dòng)生化分析儀及原廠配套試劑，采用葡萄糖氧化酶—過(guò)氧化物酶法檢測(cè)空腹葡萄糖，采用放射免疫分析法檢測(cè)空腹胰島素，計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)。HOMA-IR=空腹葡萄糖(mmol/L)×空腹胰島素(μU/L)/22.5。

1.2.3GDM判定方法妊娠24～28周時(shí)，行口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)，分析GDM患病率。GDM診斷參考2010年國(guó)際妊娠期糖尿病專家組制定的標(biāo)準(zhǔn)［7］:妊娠24～28周時(shí)，OGTT 0 h≥5.1 mmol/L 或1 h≥10.0 mmol/L或2 h≥8.5 mmol/L，任意一點(diǎn)血糖達(dá)到以上標(biāo)準(zhǔn)可診斷。

1.2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件。非正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)(最小值，最大值)表示，采用秩和檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以頻率表示，采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增效率為建立實(shí)時(shí)定量PCR合適的反應(yīng)條件，采用模板DNA倍比稀釋后進(jìn)行mtDNA和nDNA的擴(kuò)增;制作相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線后分析，顯示出良好的Ct值與起始模板各稀釋量的對(duì)數(shù)的直線相關(guān)關(guān)系;線粒體基因和參照基因的擴(kuò)增效率基本一致，可以應(yīng)用2－ΔCt進(jìn)行相對(duì)定量。研究中采用適當(dāng)?shù)腄NA模板濃度使各樣本的擴(kuò)增曲線都到達(dá)平臺(tái)期擴(kuò)增曲線均呈S形，同一份標(biāo)本多次擴(kuò)增曲線重疊，結(jié)果有可重復(fù)性，陰性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增(插頁(yè)Ⅳ圖11)。

2.2mtDNA檢測(cè)結(jié)果全體研究對(duì)象的mtDNA含量為3.5(0.1，12.9)，根據(jù)mtDNA合并中位數(shù)分為兩組，其中低mtDNA組(103例)為1.9(0.1，3.5)，高mtDNA組(103例)為5.3(3.5，12.9)，其年齡、妊娠時(shí)間具有可比性。

2.3兩組妊娠早期空腹血糖、胰島素及HOMR-IR比較見(jiàn)表1。

2.4兩組GDM發(fā)生情況比較追訪病例至28周，全體206例樣本中，流產(chǎn)56例，糖耐量正常132例，GDM 18例，低mtDNA組發(fā)生GDM 11例(10.7%)，高mtDNA為7例(6.8%)，P＞0.05。

3　討論

線粒體是細(xì)胞內(nèi)氧化磷酸化和合成ATP的主要場(chǎng)所，為細(xì)胞的活動(dòng)提供了能量。mtDNA是位于線粒體的DNA，因?yàn)榫€粒體的基因與線粒體的氧化磷酸化作用密切相關(guān)，因此，mtDNA質(zhì)量及數(shù)量的改變均關(guān)系到細(xì)胞內(nèi)的能量供應(yīng)。

骨骼肌或胰島的mtDNA質(zhì)變(突變或缺失)和量變?cè)斐删€粒體合成酶缺陷，導(dǎo)致ATP合成障礙、能量供應(yīng)不足，使細(xì)胞有氧處理葡萄糖的能力降低，導(dǎo)致骨骼肌的胰島素抵抗［8］或胰島的胰島素分泌缺陷［9］，參與T2DM與GDM的發(fā)生。mtDNA含量可作為線粒體功能狀態(tài)的觀測(cè)指標(biāo)［10］，外周血取材方便，所以白細(xì)胞mtDNA含量改變可作為T2DM與GDM等以胰島素抵抗和胰島素分泌缺陷為特征的疾病患病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)。

然而，我們的研究結(jié)果并不支持妊娠早期婦女外周血白細(xì)胞mtDNA含量改變是GDM的易感因素，也不支持其與同一時(shí)期的空腹胰島素、空腹血糖等葡萄糖代謝指標(biāo)有關(guān)聯(lián)。我們的總?cè)巳篏DM患病率為8.7%，與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致［1，2］。本研究結(jié)果不支持mtDNA含量改變與GDM及葡萄糖代謝指標(biāo)有關(guān)聯(lián)，分析其原因:①有研究在32～36孕周婦女中檢測(cè)到GDM組和非GDM組外周血白細(xì)胞mtDNA含量不同［11］，而我們測(cè)定的是＜12孕周的婦女，可能因?yàn)閙tDNA含量改變是多因素長(zhǎng)時(shí)間作用的結(jié)果，所以在妊娠早期尚未出現(xiàn)。②大齡、高脂血癥、高血壓等可影響mtDNA含量［12］，T2DM患者更傾向于這些易感因素的累積，而GDM特別是妊娠早期合并這些代謝紊亂的較少。③Lee等［4］發(fā)現(xiàn)，2 a內(nèi)發(fā)展為T2DM患者外周血白細(xì)胞mtDNA只比普通人群減少25%～35%，但T2DM患者的骨骼肌mtDNA含量可比普通人群減少50%［13］，說(shuō)明骨骼肌等其他代謝性組織的mtDNA含量改變對(duì)葡萄糖代謝的影響大于外周血白細(xì)胞的mtDNA含量改變對(duì)葡萄糖代謝的影響。④人群的差異。韓國(guó)多個(gè)研究得出mtDNA含量減少與T2DM患病有關(guān)［4，14］，而英國(guó)高加索人群的研究得出mtDNA含量在T2DM和非T2DM人群中無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的結(jié)論［15］，推測(cè)各人種之間對(duì)于mtDNA減少導(dǎo)致葡萄糖代謝紊亂的敏感性有差異。⑤兩組孕婦妊娠早期的空腹血糖、胰島素和HOMA-IR沒(méi)有區(qū)別，也可能是最后GDM患病率沒(méi)區(qū)別的原因之一。

總之，本研究證明妊娠早期外周血白細(xì)胞的mtDNA含量變化不影響GDM患病風(fēng)險(xiǎn)。

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·基礎(chǔ)研究·

Relationship between white blood cell mitochondrial DNA content in first trimester of pregnancy and prevalence of gestational diabetes mellitus

CHEN Yi-mei1，ZHANG Tong，LI Wan-gen，CHEN Yong-xia，NIU Jian-min，WANG Fang，LI Zi-hao
(1 The Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510260，China)

Abstract:Objective To investigate whether white blood cell mitochondrial DNA(mtDNA) content in the first trimester of pregnancy is associated with gestational diabetes mellitus(GDM).Methods Data and blood samples were collected from 206 females who were diagnosed as pregnancy within 12 weeks.The mtDNA quantification using nuclear DNA(nDNA) as a reference was analyzed by real-time quantitative polymerase chain reaction(PCR).According to the median value of the mtDNA/nDNA ratio，the subjects were divided into two groups: lower mtDNA content group(n=103) and higher mtDNA content group(n=103).The fasting glucose and fasting insulin were measured and homeostasis model assessment of IR(HOMA-IR) was calculated.Oral glucose tolerance test(OGTT) was taken between week 24 and 28 of gestation，and the prevalence of GDM in the two groups was observed.Results In the first trimester of pregnancy from week 24 to week 28，the prevalence of GDM in the lower mtDNA content group and higher mtDNA content group was 10.7% and 6.8%，respectively(P＞0.05).There was no statistical significance in fasting glucose，fasting insulin and HOMA-IR between thess two groups(all P＞0.05).ConclusionThe content of white blood cell mtDNA in the first trimester of pregnancy is not a risk factor for GDM.

Key words:pregnancy complications; mitochondrial DNA content; gestational diabetes mellitus; first trimester of pregnancy

(收稿日期:2015-03-03)

通信作者簡(jiǎn)介:李萬(wàn)根(1966-)，男，教授，廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院內(nèi)分泌科主任，主要研究方向?yàn)槿焉锾悄虿　-mail: liwg660@126.com

作者簡(jiǎn)介:第一陳旖鹛(1988-)，女，住院醫(yī)師，主要研究方向?yàn)槿焉锾悄虿?。E-mail: 512320401@ qq.com

基金項(xiàng)目:廣東省廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(12C22021649)。

文章編號(hào):1002-266X(2015) 20-0022-03

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類號(hào):R714.25

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.20.007