HPLC法測(cè)定芪月降脂片中兩種澤瀉醇的含量

姜南輝

芪月降脂片是利用現(xiàn)代中藥有效成分提取法提取澤瀉、黃芪、月見草油等中藥中的有效部位，再采用現(xiàn)代藥物制劑技術(shù)將其制成制劑的純中藥降脂新藥［1］。藥效學(xué)研究表明，芪月降脂片明顯降低高脂血癥大鼠血清膽固醇、甘油三酯及低密度脂蛋白含量，提高高密度脂蛋白的含量，同時(shí)降低肝臟中甘油三酯以及丙二醛含量［2］。澤瀉的主要成分為原萜烷型四環(huán)三帖類化合物即澤瀉醇類化合物［3，4］，其中澤瀉醇 A-24-乙酸酯、澤瀉醇B-23-乙酸酯為其利尿、降血脂等作用的主要有效成分［5］。本實(shí)驗(yàn)以澤瀉醇 A-24-乙酸酯、澤瀉醇B-23-乙酸酯作為芪月降脂片質(zhì)量控制的主要指標(biāo)，建立了HPLC含量測(cè)定方法，為芪月降脂片的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent-1100型高效液相色譜儀;G1314A紫外檢測(cè)器，N2000色譜工作站;CP225D型電子天平;澤瀉醇A-24-乙酸酯和澤瀉醇B-23-乙酸酯對(duì)照品均由本實(shí)驗(yàn)室自制，采用HPLC峰面積歸一化法測(cè)定，其純度均大于98%;芪月降脂片為自制，批號(hào)為121106、121118、121130;乙腈為色譜純，水為高純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Accurasil-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動(dòng)相為乙腈-水(78∶22);檢測(cè)波長208 nm;流速為0.8 ml/min;柱溫為室溫;進(jìn)樣量10 μl。

在此色譜條件下，澤瀉醇A-24-乙酸酯和澤瀉醇B-23-乙酸酯均具有良好的分離度，且與其鄰峰的分離度均大于1.5，基線噪音小。見圖1。

A.對(duì)照品;B.樣品;1.澤瀉醇A-24-乙酸酯;2.澤瀉醇B-23-乙酸酯圖1 對(duì)照品(A)及樣品(B)HPLC色譜圖

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取澤瀉醇A-24-乙酸酯、澤瀉醇B-23-乙酸酯對(duì)照品適量，加乙腈溶解，制成含澤瀉醇 A-24-乙酸酯、澤瀉醇 B-23-乙酸酯分別為152.6，166.8 μg/ml的對(duì)照品混合溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取芪月降脂片10片，研細(xì)，精密稱取0.50 g，置100 ml具塞錐形瓶中，精密加入乙腈100 ml，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，取出，放冷，再稱定重量，用乙腈補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4 線性關(guān)系考察 精密量取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液 5，10，15，20，25 μl，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積。以色譜峰面積(Y)對(duì)進(jìn)樣量(X)進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。澤瀉醇A-24-乙酸酯和澤瀉醇B-23-乙酸酯的回歸方程分別為:

Y=11.09 X+2.697，r=0.9998

Y=15.66 X+9.087，r=0.9996

結(jié)果表明，澤瀉醇A-24-乙酸酯和澤瀉醇B-23-乙酸酯分別在0.763～3.815 μg和0.834 ～4.170 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn) 取同一對(duì)照品溶液，在上述色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，每針進(jìn)樣10 μl，澤瀉醇A-24-乙酸酯和澤瀉醇 B-23-乙酸酯峰面積的 RSD分別為1.55%、0.97%。表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批樣品6份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下測(cè)定，計(jì)算澤瀉醇A-24-乙酸酯和澤瀉醇B-23-乙酸酯的平均含量分別為0.26%、0.43%;RSD分別為0.97%、1.65%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h測(cè)定。澤瀉醇 A-24-乙酸酯和澤瀉醇 B-23-乙酸酯峰面積的RSD分別為1.15%、1.85%。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的芪月降脂片細(xì)粉6份，每份約0.25 g。分別準(zhǔn)確加入澤瀉醇A-24-乙酸酯和澤瀉醇B-23-乙酸酯的對(duì)照品溶液適量，按“2.3供試品溶液的制備”項(xiàng)下方法進(jìn)行制備，即得供試液。在上述色譜條件下測(cè)定，記錄色譜峰面積。澤瀉醇A-24-乙酸酯和澤瀉醇B-23-乙酸酯的平均回收率分別為99.72%、99.53%;RSD分別為 0.50%、0.72%。表明方法的準(zhǔn)確度良好。見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.9 含量測(cè)定 取3個(gè)不同批號(hào)的芪月降脂片(121106、121118、121130)，按上述供試品溶液制備方法和色譜條件，制備供試品溶液并注入液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。計(jì)算澤瀉醇A-24-乙酸酯和澤瀉醇B-23-乙酸酯的含量。見表2。

表2 澤瀉醇A-24-乙酸酯和澤瀉醇B-23-乙酸酯含量

3 討論

3.1 提取時(shí)間的選擇 按“2.3供試品溶液的制備”項(xiàng)下操作，分別考察超聲提取10、20、30、40、50 min 對(duì)藥品測(cè)定結(jié)果的影響，結(jié)果表明提取時(shí)間30 min就可以達(dá)到基本提取完全。

3.2 檢測(cè)波長的選擇 澤瀉醇A-24-乙酸酯和澤瀉醇B-23-乙酸酯均為原萜烷型四環(huán)三萜類化合物，表現(xiàn)為紫外末端吸收，且在208 nm處有最大吸收峰。雖為紫外末端吸收，但其響應(yīng)較好，因此采用吸收波長208 nm作為檢測(cè)波長。

3.3 流動(dòng)相的選擇 澤瀉醇A-24-乙酸酯和澤瀉醇B-23-乙酸酯化學(xué)結(jié)構(gòu)十分接近，試驗(yàn)用過乙腈-水、甲醇-水、甲醇-乙腈-水等不同的流動(dòng)相體系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈-水流動(dòng)相系統(tǒng)可較好地滿足實(shí)驗(yàn)需求，經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，當(dāng)乙腈-水的比例為78∶22時(shí)，色譜圖有較好的分離度、峰形。

芪月降脂片中化學(xué)成分眾多，其中澤瀉醇A-24-乙酸酯和澤瀉醇B-23-乙酸酯含量都比較大，且性質(zhì)穩(wěn)定，可用于定性、定量研究。本實(shí)驗(yàn)首次建立了采用HPLC方法同時(shí)測(cè)定芪月降脂片中澤瀉醇A-24-乙酸酯和澤瀉醇B-23-乙酸酯的含量。該方法操作簡單，具有分離效果好、靈敏度高、準(zhǔn)確性好、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，可以用于芪月降脂片的質(zhì)量控制。

1 張善玉，金在久，康東周，等.高效液相色譜法測(cè)定芪月降脂片中金絲桃苷的含量.延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)學(xué)報(bào)，2004，27:177-179.

2 申英愛，張善玉，金在久.芪月降脂片對(duì)小鼠的急性毒性反應(yīng)實(shí)驗(yàn)研究.延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)學(xué)報(bào)，2004，27:29-30.

3 羅張炎，周愛存，張朝鳳，等.HPLC同時(shí)測(cè)定澤瀉中4種澤瀉醇成分的含.中國中藥雜志，2010，35:3306-3309.

4 易醒，黃丹菲，肖小年，等.澤瀉的研究現(xiàn)狀與展望.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2007，18:331-333.

5 陸霄鶴.HPLC法測(cè)定生澤瀉、鹽澤瀉中24-乙酰澤瀉醇A的含量.內(nèi)蒙古中醫(yī)藥，2013，32:43.