房顫患者miR-208及IL-18的表達(dá)及相關(guān)性研究

陳恩平 邱健 杜麗根

心房顫動(房顫)嚴(yán)重威脅人類的健康和生命，其發(fā)病率、致殘率高、危害大。目前其病理生理學(xué)機(jī)制尚未完全明確。目前miRNA與心臟的相關(guān)性成為研究的熱點(diǎn)之一［1，2］。新發(fā)現(xiàn)的 miRNA-208具有心肌表達(dá)特異性，在調(diào)節(jié)的心肌生長中起重要作用，與心肌纖維化密切相關(guān)［3，4］。IL-18 在炎性反應(yīng)中起重要作用［5，6］。本文研究通過觀察房顫患者miR-208及炎性因子IL-18的變化，分析miRNA-208與IL-18及房顫相關(guān)性，探討房顫的發(fā)生機(jī)制，這對于房顫未來的診療策略提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，提供新思路有重要臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年8月至2014年8月龍崗區(qū)第二人民醫(yī)院住院的房顫患者99例(房顫組)，男49例，平均年齡(56.5±5.6)歲;同期體檢中心體檢健康志愿者29例(對照組)，男15例，平均年齡(57.26±5.92)歲。按照2006年《美國心房顫動治療指南》將房顫組分為陣發(fā)性房顫、持續(xù)性房顫及永久性房顫3個亞組。排除標(biāo)準(zhǔn):房顫病史不明、惡性腫瘤、近期感染、結(jié)締組織病、自身免疫病、帕金森綜合征及嚴(yán)重肝、腎功能不全患者。所有研究對象均自愿參加并簽署了知情同意書。

1.2 方法 (1)臨床資料:完善所有研究對象心血管流行病學(xué)問卷及一般臨床資料，包括性別、年齡、既往史、吸煙史等。所有研究對象心臟彩超檢查由龍崗區(qū)第二人民醫(yī)院超聲科專人實(shí)施。(2)標(biāo)本采集:入院首日采晨時空腹12 h以上肘靜脈血，測定血脂、血糖等，并留取空腹血4 ml，按照美國MRC公司RNA提取試劑盒說明離心取血清，儲存于-80℃冰箱中待測血清miRNA濃度及酶聯(lián)免疫法檢測IL-18水平。(3)實(shí)驗(yàn)室檢測:應(yīng)用羅氏全自動生化儀(瑞士)測定血清總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、肌酐(Cr)、hs-CRP、B 型利鈉肽(BNP)。

1.3 血清miR-208表達(dá)水平檢測 以U6為內(nèi)參，采用染料法實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(日本Takara公司反轉(zhuǎn)錄及熒光定量試劑盒;廣州銳博公司特異性莖一環(huán)引物，上、下引物及U6;瑞士羅氏公司Light—CyclerSoftware 1.5熒光定量PCR儀)，所有樣本的檢測均采用同一批次試劑盒，并在同一臺儀器及相同的條件下進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，采用t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，對于偏態(tài)或方差不齊的多組樣本間比較采用多個獨(dú)立樣本的秩和檢驗(yàn)(日檢驗(yàn))。計數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，兩兩相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)分析以及偏相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組臨床一般資料及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較 2組年齡、性別比、冠心病、糖尿病、高血壓病和風(fēng)濕性心臟病者的比例、吸煙史、TC、TG、HDL-C水平方面2組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);而患者年齡及左心房內(nèi)徑、左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、IL-18水平方面，房顫組(除LVEF外)均高于對照組(P＜0.05)。在房顫患者的亞組分析中，年齡、左心房內(nèi)徑、LVEF水平方面差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

表1 2組一般臨床資料及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較±s

表1 2組一般臨床資料及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較±s

注:與對照組比較，*P＜0.05;與陣發(fā)性房顫比較，#P＜0.05

項(xiàng)目 對照組(n=29)陣發(fā)性房顫組(n=32)持續(xù)性房顫組(n=31)永久性房顫組(n=36)男/女(例)15/14 15/17 15/16 19/17年齡(歲，±s)57.5±5.859.5±6.261.3±6.562.6±6.8冠心?。劾?%)］ 0 5(15.6) 10(32.2)* 8(22.2)*糖尿病［例(%)］ 0 3(9.3) 6(19.3)* 2(5.5)*高血壓［例(%)］ 0 18(56.3) 15(48.4)* 12(33.3)*風(fēng)濕性心臟?。劾?%)］ 0 4(12.5) 8(25.8)* 13(36.1)*吸煙史［例(%)］ 6(20.7) 15(46.9) 14(45.2) 10(27.8)左心房內(nèi)徑(mm，±s)41.5±3.444.5±4.2*50.2±3.8*#50.6±4.3*#LVEF(%，±s)56.5±4.545.2±5.1*47.0±6.5*48.0±6.8*收縮壓(mm Hg，±s)132±15135±13138±14139±13舒張壓(mm Hg，±s)68±775±668±867±8 TC(mmol/L) 1.63±0.87 2.03±0.82 2.63±1.07 2.82±1.12 TG(mmol/L) 4.05±1.30 3.97±1.20 4.56±1.28 4.82±1.26 LDL-C(mmol/L) 3.29±0.90 3.29±0.80 4.43±1.16 5.06±0.88 HDL-C(mmol/L) 2.15±0.32 1.15±0.33 1.13±035 1.05±0.26血肌酐(μmol/L) 72.3±9.8 75.4±10.2 76.8±6.5 80.2±8.1 IL-18(pg/L) 71±14 99±16 115±20*# 146±23*#

2.2 實(shí)時熒光定量PCR相對定量檢測miR結(jié)果 采用2-△△Ct相對定量法，以對照組miR表達(dá)水平為1，房顫組miR-208表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。亞組分析中，陣發(fā)性房顫、持續(xù)性房顫及永久性房顫之間miR-328的表達(dá)水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，且隨房顫持續(xù)時間的延長而表達(dá)增加。見表2。

表2 2組miR-208檢測結(jié)果比較±s

表2 2組miR-208檢測結(jié)果比較±s

注:P值1:為對照組與房顫組之間比較;P值2:為房顫亞組之間的比較;△△Ct=［(房顫組miR-208 Ct值一房顫組內(nèi)參ct值)一(對照組miR-208 Ct值一對照組內(nèi)參Ct值)］;2-△△Ct:miR-208的相對表達(dá)量(說明:Ct值代表每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，不能直接用來比較，經(jīng)過2-△△Ct轉(zhuǎn)化為相對表達(dá)量，即房顫組與對照組的倍數(shù)關(guān)系后比較，需要用相關(guān)軟件進(jìn)行統(tǒng)計，如REST統(tǒng)計軟件)

項(xiàng)目 對照組(n=29) 房顫組(n=99)房顫亞組陣發(fā)性房顫(n=32)持續(xù)性房顫(n=31)永久性房顫(n=36)P 1 P2男/女(例)15/14 49/50 15/17 15/16 19/17 0.589 0.075 miR-208Ct值 37.56±0.85 32.52±1.02 33.25±0.96 32.56±1.05 31.32±1.12 MiR-208相對表達(dá)量(△Ct) -0.57±0.68 -1.62±1.02 -0.38±0.83 -1.68±0.54 -2.58±1.05-△△Ct 0 -2.25±1.05 0.65±0.32 -2.28±1，02 -3.25±1.12 2-△△Ct 1 7.52±1.23 2.02±9.05 6.32±2.35 12.58±3.58 0.000 0.000

2.3 相關(guān)性分析 (1)miR-328與其他指標(biāo)的Pearson相關(guān)分析:房顫組miR-328與已知房顫危險因素如年齡、左心房內(nèi)徑等呈正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為0.369(P＜0.05)、0.364(P＜0.05);(2)偏相關(guān)分析:調(diào)整性別、年齡、冠心病、糖尿病、風(fēng)濕性心臟瓣膜病、高血壓及吸煙等因素后，房顫組中血漿miR-208表達(dá)水平仍與左心房內(nèi)徑呈正相關(guān)(r=0.332，P＜0.05)。見表3。

表3 房顫組miR-328與各指標(biāo)相關(guān)分析

3 討論

房顫發(fā)生的病理生理機(jī)制非常復(fù)雜，包括鈣離子穩(wěn)態(tài)失調(diào)、離子通道改變、心房電生理及結(jié)構(gòu)重構(gòu)、炎性反應(yīng)等［7］。目前miRNA與心臟的相關(guān)研究成為研究的熱點(diǎn)之一［8］。miRNA類內(nèi)源性因子在房顫中的作用及機(jī)制尚未系統(tǒng)闡明。Lu等［9］通過microRNAs表達(dá)譜芯片篩查風(fēng)濕性心臟病合并房顫及心房快速起搏致犬房顫模型，發(fā)現(xiàn)microRNA-223、microRNA-328、microRNA-664表達(dá)都較對照組增高2倍以上。而關(guān)于miR-208是否參與了房顫的發(fā)展，目前筆者未見報道。

MiR-208由肌球蛋白重鏈(α-MHC)的內(nèi)含子編碼，特異性地表達(dá)于心肌組織，其功能主要在心肌細(xì)胞發(fā)育過程中調(diào)控肌球蛋白重鏈的生成。最新研究顯示，血清miR-208的表達(dá)水平與心肌損傷疾病有關(guān)，可能與心肌纖維化相關(guān)［10］。Ceylan-Isik 等［11，12］研究發(fā)現(xiàn)microRNA-208在心臟肥厚、心力衰竭中具有促纖維化作用，提示miR-208可能參與了房顫的發(fā)生發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，房顫組miR-208明顯高于對照組，miRNA208在永久性房顫組、持續(xù)性房顫組明顯高于陣發(fā)性房顫，提示miR208隨著房顫持續(xù)的時間而增加。提示miRNA-208與房顫密切相關(guān)。

近幾年炎癥在心房纖顫中的作用受到越來越多的關(guān)注。越來越多的研究表明:房顫與心臟或全身炎性反應(yīng)有關(guān)，炎性反應(yīng)在心房顫動的發(fā)生和維持中起重要作用。IL-18是一種新型白介素因子，是炎癥敏感標(biāo)志物，能夠?qū)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞激活，生成一系列細(xì)胞因子，促進(jìn)炎性反應(yīng)［13］。本研究發(fā)現(xiàn)，房顫組IL-18明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。提示炎性反應(yīng)與房顫關(guān)系密切，參與了房顫的發(fā)生發(fā)展。機(jī)制可能是炎癥過程中產(chǎn)生的IL-18等介質(zhì)可特異性的與磷脂酰膽堿結(jié)合，磷脂酰膽堿可形成長鏈酰基卡尼丁和溶血磷脂酰膽堿，兩者均可抑制肌質(zhì)網(wǎng)鈉鈣交換，影響膜的功能，引起鈣離子超載，心肌損傷，導(dǎo)致心肌間質(zhì)纖維化以及電傳導(dǎo)不均一，從而易于誘發(fā)心房內(nèi)及心房間的傳導(dǎo)阻滯或折返影響心肌細(xì)胞間電信號的傳導(dǎo)。因此心房細(xì)胞及間質(zhì)的炎性過程可直接引起膜電位的波動，導(dǎo)致心房顫動的發(fā)生與維持。

房顫的發(fā)病機(jī)制多而復(fù)雜，各發(fā)病機(jī)制之間可能相互關(guān)聯(lián)，相互影響。早在1994年Framingham研究中就已發(fā)現(xiàn)心房增大導(dǎo)致房顫的發(fā)生，左心房大小是發(fā)生房顫的獨(dú)立危險因素［14］。本研究房顫患者心房內(nèi)徑大于對照組，房顫組miR-328與左心房內(nèi)徑、IL-18等呈正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為r=0.3694(P＜0.05)，r=0.353(P＜0.05);偏相關(guān)分析:調(diào)整性別、年齡、冠心病、糖尿病、風(fēng)濕性心臟瓣膜病、高血壓及吸煙等因素后，房顫組中血漿miR-328表達(dá)水平仍與左心房內(nèi)徑、IL-18相關(guān)(r=0.332，P＜0.05)。提示房顫患者miR-208與心房大小及炎癥可能存在一定的關(guān)聯(lián)。機(jī)制可能為房顫導(dǎo)致心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載，引起心房肌細(xì)胞凋亡，在壞死、纖維化心肌細(xì)胞周圍有明顯的炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤，導(dǎo)致心房肌纖維化及心房擴(kuò)大，心肌纖維化，導(dǎo)致miR-208水平升高，同時過氧化物介導(dǎo)的蛋白硝基化增加，進(jìn)而通過折返機(jī)制使房顫得以維持。本研究樣本量少，有待大量樣本進(jìn)一步研究證實(shí)。因此，通過檢測房顫患者miR-208、IL-18水平可能有助于房顫的分類及風(fēng)險評估，對miR-208及IL-18相關(guān)性的進(jìn)一步研究能為房顫的診療提供新的思路。

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