梅毒螺旋體主要膜蛋白的免疫學研究進展

朱 蕓，連 石，張海萍，朱 威

梅毒是一種慢性、全身性性傳播疾病，其臨床表現(xiàn)復雜多樣，可累及全身多個器官系統(tǒng)，嚴重危害人類健康[1]。我國的梅毒發(fā)病率仍然在各類性傳播疾病中居于首位。據(jù)《中國預防與控制梅毒規(guī)劃（2010—2020）》（中華人民共和國衛(wèi)生部）統(tǒng)計，2009年全國新發(fā)病例達10 757例， 上一年增長49.2%，且繼續(xù)呈上升趨勢[2]。由于其病原體——梅毒螺旋體（Treponema pallidum，TP）的體外培養(yǎng)困難，至今尚未獲得成功，故限制了相關的基礎與臨床研究。隨著分子生物學技術的進步，近年來關于TP的研究不斷涌現(xiàn)出新的熱點，本文就相關的免疫學內(nèi)容綜述如下。

1 TP的主要膜脂蛋白

以往研究認為，TP的部分膜脂蛋白具有免疫原性，在激活炎癥細胞、誘發(fā)機體免疫反應等方面具有重大作用。Fraser等于1998年完成了TP DNA的全基因組測序，他們測定出TP全長為1 138 006 bp，含有1 041個開放閱讀框架（opening reading frames，ORF），并推測TP可能具有22種外膜脂蛋白[3]。McKevitt等認為這些脂蛋白中至少有12種與TP的致病性密切相關，完整膜脂蛋白的缺乏可能是造成TP免疫逃避的機制之一[4]。

在TP的眾多膜脂蛋白中，目前研究較多的有TpN47(Tp0574)、TpN17(Tp0435)、TpN15(Tp0171)以及TmpA(Tp0768)，這些脂蛋白具有強大的前炎癥活性，與TP引起的梅毒免疫反應密切相關[5,6]，其組合抗原已廣泛應用于檢測TP的試劑盒中[7]。此外，近年來研究較多的蛋白還有Tp0453、Tp92(Tp0326)、Gpd(TP0257)，以及Tp0655、Tp0993等。

Wesley等于2003年應用計算機軟件篩選的辦法推測出若干種可能的TP膜脂蛋白，并采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測重組蛋白的敏感性和特異性。結(jié)果發(fā)現(xiàn) Tp0453、Tp92(Tp0326)、Gpd(TP0257)均為可能的TP膜脂蛋白，其中Tp0453的敏感性和特異性最高（100%），后兩者的敏感性、特異性分別為98%、97%以及91%、93%，并認為此3種蛋白能夠單獨或混合用于梅毒的血清學診斷[8]。Tp0453長864 bp，編碼287個氨基酸，分子量約為31 900。Hazlett等[9]認為Tp0453是一種特殊的膜蛋白，其結(jié)構(gòu)域中富含α-螺旋而缺乏β-折疊，前者嵌入TP膜脂質(zhì)雙分子層中，但不暴露于TP表面，無法被免疫系統(tǒng)識別，這是TP逃避宿主免疫反應的可能機制之一。此外，Hazlett等[9]證實Tp0453能夠促進某種marker的經(jīng)膜釋放，這提示其可能與TP營養(yǎng)物質(zhì)的代謝密切相關。Liu等[10]利用基因工程技術成功制備出Tp0453重組蛋白，并用其免疫新西蘭家兔，證明具有良好的免疫原性；蛋白印跡法(Western-blot)和ELISA方法使其與患者血清反應，證明具有良好的免疫反應性。

Tp0655全長1 047 bp，編碼348個氨基酸。細菌中的膜脂蛋白往往具有參與信號轉(zhuǎn)導、物質(zhì)轉(zhuǎn)運，參與酶促反應，激活機體免疫應答等多方面的作用。Machius等[11]應用基因工程技術制備rTp0655，X線衍射技術測定其晶體結(jié)構(gòu)，并驗證功能。結(jié)果證實Tp0655為TP的膜脂蛋白，其結(jié)構(gòu)與E.coli的PotD具有同源性，是ATP-結(jié)合盒(ATP-binding cassette,ABC)的重要轉(zhuǎn)運蛋白，能夠優(yōu)先與腐胺特異性結(jié)合，其次與亞精胺結(jié)合，后兩者在維持細胞的生長、分化和死亡過程中具有重要作用。此外，由于TP缺乏鳥氨酸、精氨酸脫羧酶[2,12]，故Tp0655可能在細胞代謝過程中承擔著較為重要的作用。多胺在體液中濃度較低，而在宿主細胞內(nèi)濃度較高，Machius等[11]據(jù)此推測TP可能在發(fā)病過程中的某一階段侵入人體細胞中獲取代謝原料，這與傳統(tǒng)上TP不侵入細胞內(nèi)的觀念有所差異，具體情況有待進一步研究證實。

Tp0993全長957 bp，編碼318個氨基酸，分子量約為33 300。McKevitt等[13]于2005年利用基因工程技術重組表達了882種TP蛋白，并將其與TP感染后的新西蘭兔血清反應，發(fā)現(xiàn)其中106種蛋白具有較強的免疫反應性，包括22種已知蛋白和84種未知蛋白。Tp0993在此次實驗中首次被發(fā)現(xiàn)，并能夠與TP感染新西蘭兔后各個時期（第14天，28天，56天和84天）的血清產(chǎn)生免疫反應。McKevitt等認為Tp0993是一種含量較低的TP脂蛋白，推測其可能位于TP外膜上，這可能與其較好的免疫性相關。Brinkman等[14]于2006年用類似方法獲得908種TP重組蛋白，以梅毒患者血清代替新西蘭兔血清進行實驗，發(fā)現(xiàn)Tp0993能與各期患者血清發(fā)生良好的免疫反應（潛伏梅毒，早期、晚期梅毒），并且與正常對照組血清不反應，這提示Tp0993可以作為潛在抗原，對各期梅毒具有診斷價值。我國謝小平等[15]以Tp0993重組蛋白為抗原建立ELISA檢測系統(tǒng)，對480例臨床血清進行分析，證實其靈敏度及特異性均較高，可作為梅毒診斷的候選抗原之一。

2 TPrK蛋白

TprK是一種特殊的TP膜蛋白，屬于TprP重復蛋白家族的12種蛋白(TprA~L)之一，后者又可分為Ⅰ(TprC、D、F、I)、Ⅱ(TprE、G、J)、Ⅲ(TprA、B、H、K、L)3個亞家族。近年來研究認為TprK蛋白既能誘導機體產(chǎn)生保護性免疫反應，又是梅毒螺旋體發(fā)生免疫逃避的重要原因之一，故單獨綜述如下。

Centurion等[16]較早對TprK蛋白進行了報道，他們通過對TprK基因的ORF進行DNA測序，推測其包括若干個含有高度保守序列的恒定區(qū)及7個可變區(qū)（V區(qū)），可變區(qū)序列與TprP的Ⅰ、Ⅱ兩個亞家族缺乏同源性，可能具有較強的免疫特異性。LaFond等[17]對TprK蛋白V區(qū)的可變性進行了研究，他們用3種不同的TP菌株感染新西蘭兔，發(fā)現(xiàn)經(jīng)Chicago A株感染后獲得的血清對可變區(qū)V5、6、7產(chǎn)生免疫應答反應，經(jīng)Chicago B株感染后對V2、V4～7產(chǎn)生應答，而經(jīng)Chicago C株感染后則對V2～7產(chǎn)生應答，且各型菌株與血清之間幾乎不存在交叉反應。TprK基因的高度可變性可能在TP逃避宿主免疫反應中發(fā)揮作用，這是導致梅毒感染慢性化的可能機制之一。

TprK蛋白能誘導機體同時產(chǎn)生體液免疫和細胞免疫[16]。Morgan等[18]用TprK蛋白片段免疫新西蘭兔，并使其再次接觸同菌株TP后，發(fā)現(xiàn)家兔體內(nèi)的脾細胞出現(xiàn)增生反應，且兔血清能夠?qū)prK蛋白產(chǎn)生免疫應答反應。其中，TprK的恒定區(qū)具有T淋巴細胞識別表位，而V區(qū)則具有B淋巴細胞識別表位。同時，家兔體表潰瘍出現(xiàn)更晚，且潰瘍的面積和數(shù)量均小于正常對照組，這提示TprK誘導家兔產(chǎn)生的免疫反應具有保護性。Giacani等[19]對4種不同TP菌株免疫新西蘭兔后Tpr基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平進行了實時PCR定量測定，并測定了不同感染時期T淋巴細胞的反應情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)TprK基因的表達在4種菌株中均高于其他基因，但低于作為參照的47-KDa脂蛋白基因。各菌株免疫的家兔表現(xiàn)出不同強度的T淋巴細胞反應性，亞家族Ⅰ中的TprC、D能誘導家兔脾細胞增生，而TprK誘導的這一反應更為強烈。此外，T淋巴細胞對于TprK蛋白的反應性在各個時期的家兔中均維持在較高水平，這提示TprK基因可能在長期感染過程中一直處于轉(zhuǎn)錄狀態(tài)。

抗原變異是病原體逃避宿主免疫、引起感染慢性化的常見機制。免疫壓力(immune pressure)屬于生物進化過程中選擇壓力(selective pressure）的一種，是病原體變異的主要動力之一。最近，Giacani等[20]對免疫壓力作用下TP的抗原變異狀況及其原因進行了研究。他們將TP感染后的新西蘭兔分為免疫活性組和免疫抑制組（注射甲潑尼龍），6周后進行抗體檢測、基因測序及mRNA測序。結(jié)果發(fā)現(xiàn)免疫抑制組家兔的抗體產(chǎn)生時間晚、數(shù)量少，局部皮損的數(shù)目更多、面積更大。抑制組與對照組家兔的TprK基因V4~V7區(qū)分別于感染后第5、5、3、4周出現(xiàn)統(tǒng)計學差異，后者表現(xiàn)出更強的變異性。值得注意的是，隨著感染時間的延長，V6區(qū)基因多樣性的增加與抗-V6抗體數(shù)目的增長呈現(xiàn)出平行關系，這提示特異性抗-V6抗體在TprK的基因選擇及其導致的TP抗原變異種中可能起到一定作用。

3 應用

梅毒的實驗室檢測是診斷梅毒的重要手段之一，目前國內(nèi)外均已有多種商業(yè)化的成品試劑盒，但仍不能用于各期梅毒的檢測[7,21]。對于TP的免疫學研究，有助于為各期梅毒提供全面、有效的診斷方法，并使梅毒疫苗的研制成為可能。

目前常用的梅毒檢測方法是將TP重組膜蛋白Tp47、Tp15、Tp17、TmpA、Tp37中的2種以上作為混合抗原，應用ELISA、Western-blot、免疫層析法(ICA)等方法，通過檢測血清中的TP特異性抗體，達到診斷梅毒的目的[22]。這些檢測方法存在生物學假陽性、假陰性的可能，且對于TP感染早期、免疫功能低下患者以及晚期梅毒患者診斷效果不佳。隨著計算機及分子生物學技術的發(fā)展，學者們一方面利用生物信息學軟件分析、尋找其他具有潛在診斷價值的TP蛋白，另一方面通過基因重組技術獲得大量蛋白，隨后再驗證其免疫原性及免疫反應性。目前的研究熱點除上文提到的Tp0453、Tp92、Gpd、Tp0993等外，還有Tp0136、Tp0751、Tp0319[23-25]等重組蛋白。這些蛋白能夠與Tp47等蛋白聯(lián)合應用，作為混合抗原應用于梅毒的診斷。雖然目前關于這些蛋白的研究大多停留在實驗室階段，但其未來的應用前景仍然值得期待。

梅毒與HIV共感染的現(xiàn)象近年來越來越受到人們的關注。梅毒引起的生殖器潰瘍促進了HIV的傳播，其造成的短暫免疫功能異常又有可能引起HIV病毒載量的增加和CD4細胞數(shù)的下降[26,27]，因此，梅毒疫苗的研究具有切實的臨床意義和價值。由于TP無法在體外進行培養(yǎng)，且細胞結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定、不便于操作，故其重組亞單位疫苗的研制是目前主要的研究方向。梅毒發(fā)病的免疫學機制復雜，動物實驗僅證實Tp19、Tp36、Gpd等具有部分保護作用[28]，國內(nèi)外尚未研制出具有完全保護作用的疫苗[29]。上文中提到的TprK蛋白具有較強的免疫原性和免疫反應性，且能夠在TP感染后持續(xù)存在，可作為TP疫苗的候選抗原，但具體應用價值有待于進一步研究。

4 小結(jié)

梅毒是性病中危害較大的疾病，目前關于其致病機制、免疫應答等問題尚未完全明確，其診斷、治療及疫苗等課題有待進一步研究。隨著基因工程、蛋白質(zhì)組學等技術的發(fā)展，TP的免疫學研究必將進一步深入和細化，從而帶動梅毒領域的全方位研究，達到促進人類健康的最終目的。

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