糖尿病診斷和監(jiān)測的金標準
—HbA1c

沈　霞

糖尿病診斷和監(jiān)測的金標準
—HbA1c

沈霞

作者單位：200092上海市，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院檢驗科

糖化血紅蛋白是人體血液中葡萄糖與血紅蛋白鏈上的游離氨基酸之間非酶促糖化作用的產(chǎn)物。血紅蛋白A1c（hemoglobin A1c，HbA1c）是糖化血紅蛋白的主要成分，既不受胰島素水平的影響，也不受運動和飲食等因素的影響，能夠較準確的反映患者過去8-12 w的平均血糖水平。美國糖尿病學(xué)會、歐洲糖尿病研究委員會及國際糖尿病協(xié)會聯(lián)合組成的國際專家委員會推薦使用HbA1c作為診斷糖尿病的新指標，HbA1c還是世界衛(wèi)生組織和許多國家糖尿病協(xié)會推薦的糖尿病首選診斷標準。由于HbA1c的檢測方法眾多，不同實驗室間的檢測結(jié)果可因所用的原理、方法學(xué)不同，所測組分及Hb變異體的差異，均可影響實驗樣本的穩(wěn)定性、檢測結(jié)果的準確性及重復(fù)性，導(dǎo)致各實驗室之間檢測結(jié)果差異較大，缺乏可比性和溯源性。目前，國際較公認的HbA1c檢測標準化參考方法是由國際臨床化學(xué)聯(lián)合會（The International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine，IFCC）提出的，該方法已經(jīng)由包括歐洲、日本和美國在內(nèi)的11家IFCC參考實驗室驗證。我國也于2011年頒布了《糖化血紅蛋白實驗室檢測指南》，然而HbA1c檢測標準化工作仍處于起步階段，只有積極推動實驗室間HbA1c檢測標準化和質(zhì)量管理，才可使HbA1c定量檢測的實驗報告能達到結(jié)果互認，真正成為糖尿病診斷和監(jiān)測的金標準。

血紅蛋白；糖化血紅蛋白；糖尿??；標準化；金標準

doi：10.3969/j.issn.1674-7151.2015.01.001

根據(jù)國際糖尿病協(xié)會統(tǒng)計，2013年全球20～79歲成年人的糖尿病患病率為8.3%，患者人數(shù)達3.82億，到2035年該數(shù)字將上升至5.92億［1］。我國糖尿病的發(fā)病率也正呈明顯上升趨勢，由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院寧光教授團隊首次應(yīng)用國際最新臨床診斷標準，在全國范圍內(nèi)完成口服葡萄糖耐量試驗結(jié)合糖化血紅蛋白［即血紅蛋白A1c （hemoglobin A1c，HbA1c）］測定以明確診斷2型糖尿病的調(diào)查［2］數(shù)據(jù)表明，2010年中國18歲及以上成年人糖尿病患病率高達11.6%、糖尿病前期率為50.1%。根據(jù)研究樣本估測，我國成年人中約有1.139億糖尿病患者及4.934億糖尿病前期人群。

長期以來，糖尿病的診斷主要依據(jù)空腹血糖和口服葡萄糖耐量試驗，現(xiàn)在這種狀況將面臨改變。由美國糖尿病學(xué)會（American Diabetes Association，ADA）、歐洲糖尿病研究委員會及國際糖尿病協(xié)會聯(lián)合組成的國際專家委員會推薦使用HbA1c作為糖尿病診斷的新指標，HbA1c還是世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）和許多國家糖尿病協(xié)會推薦的糖尿病首選診斷標準［3-5］。本文就HbA1c的形成機制、檢測方法和標準化等方面做一淺析。

1　血紅蛋白（hemoglobin，Hb）及其變異體和糖化血紅蛋白（glycosylated hemoglobin，GHb）定義

1.1Hb成人Hb主要由HbA1（95.0%～97.0%，2α，2β）、少量的HbA2（2.5%～3.0%，2α，2δ）和HbF（0.5%～1.0%，2α，2γ）組成。HbA是由2條141個氨基酸組成的αA鏈和2條146個氨基酸組成的βA鏈構(gòu)成的四聚體2αA2βA。HbA中約90%為非 GHb（HbA0），5%～8%為 GHb（HbA1），其中HbA1經(jīng)色譜分析后又分為HbA1a1、HbA1a2、HbA1b和HbA1c四種成分，HbA1c約占80%，是HbA1的主要成分。

1.2Hb變異體20世紀60年代，Rahbar在篩查人群中可能存在的異常Hb時發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者體內(nèi)存在電泳速度非?？斓腍b成分，并被認為是一種異常的Hb。次年，Rahbar［6］研究小組證實這種異常Hb在結(jié)構(gòu)上與HbA1c相同。之后的研究報道顯示Hb變異體有數(shù)百種，大多數(shù)起源于Hb的α、β、γ、δ鏈的點突變。臨床最常見的Hb變異體是HbF、HbS和HbC。HbF是胚胎時期的Hb由兩條α鏈和兩條γ鏈組成。出生時，70%的Hb是HbF，6個月后降到5%以下。遺傳性HbF持續(xù)存在的個體其體內(nèi)濃度可達到總Hb的30%，而β地中海貧血和鐮狀細胞病患者體內(nèi)HbF的濃度占總Hb的2%～20%。HbS變異體有明顯的地區(qū)、種族差異。在美國，HbS是最常見的Hb變異體，尤其在純合子鐮狀細胞病患者體內(nèi)，有三分之一可檢測出HbS。HbC是一種α鏈異常的Hb，較正常的α鏈（141個氨基酸）多了31個氨基酸，共172個氨基酸。原因在于α基因的終止密碼突變?yōu)橛幸饬x的密碼子而形成異常Hb，由于突變使α鏈合成延緩，引起α珠蛋白合成障礙性貧血［7］。該病在東南亞和中國南方均有發(fā)現(xiàn)［8］。

1．3GHb定義GHb是葡萄糖對HbA的非遺傳修飾，是人體血液中葡萄糖與Hb鏈上的游離氨基酸之間非酶促糖化作用的產(chǎn)物。Hb鏈上有多個游離氨基酸，其中β鏈N-末端的纈氨酸氨基暴露于葡萄糖的程度最高，他們以共價鍵結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合物，其糖化產(chǎn)物是GHb的主要成分，稱為HbA1c［5，9，10］。未經(jīng)治療的糖尿病患者血液中葡萄糖濃度很高，多余的葡萄糖糖化血液中的Hb，從而形成HbA1c。

2　HbA1c的形成過程

葡萄糖進入紅細胞后，與HbA的β鏈N末端纈氨酸殘基縮合，先形成一種不穩(wěn)定的 Schiff堿（醛亞胺結(jié)構(gòu)），即前HbA1c，再解離或經(jīng)Amodori分子重排后形成HbA1c（醛酮結(jié)構(gòu)）。該反應(yīng)的過程是緩慢而不可逆的，并且由于紅細胞內(nèi)沒有分解醛酮的酶，因此HbA1c的形成過程存在于紅細胞的整個生命周期中，其形成速度與紅細胞內(nèi)的葡萄糖濃度有關(guān)，而與胰島素水平無關(guān)。所以，HbA1c水平只與紅細胞壽命和該時期體內(nèi)血糖的平均濃度有關(guān)，不受運動和飲食的影響，能反映過去8-12 w的平均血糖濃度，是目前國際上公認的用于評估糖尿病患者長期血糖狀況的理想指標。

3　常用的HbA1c測定方法及評價

到目前為止，有超過30種不同的方法用于定量檢測HbA1c［11-13］，其中常用的檢測方法及其性能如下。

3．1離子交換層析法基于電荷差異進行分析。葡萄糖與Hb的β鏈末端Val連接降低了等電點，導(dǎo)致HbA1c帶的正電荷比未糖化Hb少，與樹脂的附著力小?？梢苑謩e用不同離子濃度的緩沖液在不同的時間將HbA1c從陽離子交換柱中洗脫下來，再根據(jù)每個峰值下的面積來計算HbA1c占總Hb的比例。該方法中Hb變異體會隨HbA1c一起被洗脫下來，影響HbA1c值［12］。

3．2親和層析法基于糖化與非糖化Hb結(jié)構(gòu)不同，凡是糖基化的Hb均可以與硼酸鹽結(jié)合形成可逆的復(fù)合物，未糖化Hb先被洗脫后，再用山梨醇分離復(fù)合物，并將全部GHb洗脫出來，檢測結(jié)果是總GHb，通過換算得出HbA1c的量。但該法對于變異Hb和病理Hb的影響相對其他方法不敏感，易造成檢測結(jié)果不準確［11］。

3．3免疫法采用單克隆抗體特異識別GHb β鏈N末端最后4～6個氨基酸組成的抗原表位，在自動生化分析儀上利用抗原、抗體反應(yīng)的原理進行免疫比濁測定。以GHb為標準，測定HbA1c的含量，再測定Hb的含量，最后計算出HbA1c占總Hb的百分數(shù)。該方法具有良好的精密度及與其他方法良好的相關(guān)性。但當(dāng)Hb發(fā)生第6位氨基酸變異 （HbS和HbC）時將不會被識別。又因各廠家產(chǎn)品的單抗針對的抗原決定簇不同、親和力不同等因素將影響檢測結(jié)果的可比性［12］。

3．4均相酶法其原理是在蛋白酶的作用下，切斷GHb的β鏈N末端的糖化二肽在果糖基肽氧化酶的作用下生成過氧化氫，在過氧化氫的存在下與顯色劑產(chǎn)生顯色反應(yīng)，通過測定吸光度值求出HbA1c的百分濃度。此法是近幾年才推出的快速、均一的反應(yīng)體系。該方法精密度好，與高效液相色譜法和免疫法有良好的相關(guān)性。但其缺點是也不能識別Hb變異體［14］。

3．5電泳法由法國 Sebia公司推出的 CAPILLARYS 2 FLEX-PIERCING毛細管電泳分析儀，其檢測原理是利用不同蛋白分子在pH=9.4的緩沖條件下，儀器自動溶血，并通過毛細管的陽極端吸入進樣，然后在高電壓條件下，在電滲流和電場力的作用下的泳動速率不同而進行蛋白質(zhì)分離，屬液相電泳。并在毛細管陰極端以波長415 nm直接檢測Hb（415 nm是Hb特有的吸收峰，可以準確地對HbA1c以及其他Hb進行定量）。在使用堿性緩沖液條件下，正常和異常（或變異體）Hb按下列順序檢測出來，從陰極到陽極依次為HbA2、HbC、HbE、HbS、HbD、HbF、HbA0、其他Hb以及HbA1c。距陰極端最近的是含糖基最少的HbA1a和HbA1b，處于中間的是HbA1c，距陽極端最近的是Hb的主要成分、未糖化的HbA0和糖化的HbA2，同時其對HbA2的定量檢測又可用于β地中海貧血的篩查。該方法是已通過國際臨床化學(xué)聯(lián)合會（The International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine，IFCC）和美國糖化血紅蛋白標準化計劃組織（National Glycohemoglobin Standardization Program，NGSP）認證的HbA1c檢測方法［15-17］。

3．6即時檢驗（point-of-care testing，POCT）國內(nèi)目前使用較多的有兩種方法，一種是利用硼酸親和原理在顏色反射機上進行HbA1c的快速檢測；另一種是基于免疫反應(yīng)原理在熒光分光光度儀上檢測含HbA1c的熒光染料分子的斑點數(shù)，換算成HbA1c的百分濃度。POCT檢測HbA1c具有便攜、快速等優(yōu)點，但相當(dāng)一部分POCT方法的精密度尚不能滿足臨床要求，且對樣本中的Hb含量要求有較大限制［18］。

4　HbA1c的檢測結(jié)果報告和臨界值

HbA1c的檢測結(jié)果將在全球范圍內(nèi)標準化，實驗室的結(jié)果報告應(yīng)以傳統(tǒng)單位（%HbA1c）報告，并同時報告IFCC的國際單位（mmol/moL），再用NGSP單位換算公式進行換算后共同報告結(jié)果［5，13］。NGSP單位換算公式如下

NGSP HbA1c=0.0915（IFCC HbA1c）+2.15%

2009年，國際專家委員會一致同意推薦使用HbA1c診斷糖尿病，并發(fā)布了工作報告［3］。2010年，ADA對國際專家委員會的建議給予充分肯定，并正式確定將HbA1c作為糖尿病診斷的標準之一，臨界值為HbA1c＞6.5%，HbA1c水平在5.7%～6.4%的患者歸為“糖尿病高危人群”。2011年，WHO正式推薦以HbA1c＞6.5%作為診斷糖尿病的標準［4，10］。

5　HbA1c檢測的標準化和質(zhì)量管理

不同實驗室間的檢測結(jié)果可因所用的原理、方法學(xué)不同，所測組分（HbA1或HbA1c）的差異，再加上Hb變異體（HbS、HbC、HbE和HbF）的影響，而對實驗結(jié)果的準確性、重復(fù)性，甚至樣本的穩(wěn)定性均有影響，導(dǎo)致各實驗室之間結(jié)果差異較大，很難具有可比性和溯源性［19］。由于HbA1c測定的準確性直接關(guān)系到臨床對糖尿病的診斷和療效評估，因此，對HbA1c檢測的標準化和質(zhì)量管理已受全球關(guān)注。

5．1HbA1c檢測的國際標準化和質(zhì)量管理1993年，美國臨床化學(xué)協(xié)會建立的NGSP通過參考實驗室網(wǎng)絡(luò)的樣本比對來降低室間差異，要求檢測實驗室應(yīng)參加能力比對試驗。實驗室采用可溯源到糖尿病控制與并發(fā)癥試驗（diabetes control and complication trial，DCCT）參考物質(zhì)的方法，使報告的結(jié)果都能溯源到DCCT的結(jié)果。1995年，IFCC成立了HbA1c標準化工作組，旨在研究一個可供追溯的參照系統(tǒng)，研發(fā)HbA1c參考物質(zhì)和參考方法［8，13］。該工作組歷時5年的探索，經(jīng)過多家實驗室的努力，于2002年推出了一套HbA1c參考方法，即將待測標本溶血后經(jīng)胞內(nèi)蛋白酶酶解，然后應(yīng)用高效液相色譜串聯(lián)電噴霧質(zhì)譜儀或高效液相色譜串聯(lián)毛細管電泳儀，利用信號比例計算出糖基化的β鏈N末端六肽片段的比例，從而得出HbA1c在樣本中所占的百分比，是檢測HbA1c分子濃度的新方法，IFCC推薦的參考方法較NGSP參考方法特異性強，該方法已經(jīng)由包括歐洲、日本和美國在內(nèi)的11家IFCC參考實驗室驗證［11］。2011年，美國生化科學(xué)院發(fā)布的HbA1c檢測在糖尿病診斷和管理中的應(yīng)用與建議中指出，HbA1c的室內(nèi)CV＜2%，室間CV＜3.5%，并至少需要做兩個水平的質(zhì)控品。

5．2我國HbA1c檢測的標準化和質(zhì)量管理國內(nèi)各實驗室采用的HbA1c檢測試劑多達60余種，甚至很多實驗室仍采用非標準化的方法，缺乏相關(guān)的參考實驗室網(wǎng)絡(luò)及正確性驗證的途徑，檢測結(jié)果的可比性不容樂觀，全國范圍內(nèi)的HbA1c檢測標準化面臨嚴重挑戰(zhàn)［11］。2010年衛(wèi)生部臨檢中心HbA1c室間質(zhì)評不同儀器組內(nèi)CV為4.54%～21.03%［20］。2011年北京市臨檢中心HbA1c檢測室間質(zhì)評的結(jié)果顯示，相同儀器組內(nèi)CV基本在4%以下，雖顯示了很好的精密度，但是不同儀器組內(nèi)CV仍高達15.8%，檢測結(jié)果的可比性差，無法達到HbA1c檢測結(jié)果的互認［20］。2010年3月，中國HbA1c教育計劃在北京啟動，該計劃是國內(nèi)首次由內(nèi)分泌和檢驗醫(yī)學(xué)界專家共同參與的大型學(xué)術(shù)活動，旨在提高HbA1c檢測的標準化，以及在糖尿病管理中的地位，以加強臨床醫(yī)師對HbA1c的認識和重視［20］。上海臨床檢驗中心采用 IFCC HbA1c一級參考方法，于2010年完善并獲候選參考實驗室資格，2011年考核合格，2011年11月1日正式成為包括歐美日12家實驗室之后的第13家運行一級參考方法的參考實驗室網(wǎng)絡(luò)中的一員，為中國HbA1c標準化工作走上一個新的臺階［18］。

HbA1c因其在體內(nèi)存在時間長，水平較穩(wěn)定，不受運動或飲食影響的特點，已逐漸成為新的糖尿病診斷和監(jiān)測指標。目前，由衛(wèi)生部臨床檢驗中心、國家食品藥品監(jiān)督管理總局醫(yī)療器械檢驗所和糖尿病學(xué)專家根據(jù)我國HbA1c檢測現(xiàn)狀，結(jié)合國內(nèi)外相關(guān)研究進展，共同制定HbA1c實驗室檢測指南［5］，于2011年經(jīng)衛(wèi)生部組織專家討論并已通過。然而，HbA1c測定標準化工作在我國還處于起步階段，任重而道遠。希望通過我國HbA1c實驗室檢測指南的出臺和貫徹落實，推動HbA1c檢測標準化和質(zhì)量管理更加深入開展，使HbA1c定量檢測的實驗報告能達到結(jié)果互認，真正成為糖尿病診斷和監(jiān)測的金標準。

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（本文編輯：楊軍）

（2014-03-27）