實時熒光定量PCR對乙肝DNA檢測的影響及管理

□沈 剛SHEN Gang

乙型病毒性肝炎是我國傳播范圍最廣、危害性最大的一種感染性疾病，以肝臟炎性病變?yōu)橹饕憩F(xiàn)，容易在此基礎上繼發(fā)肝硬化、慢性肝炎和原發(fā)性肝細胞癌等嚴重疾病，危及患者生命安全[1]。乙肝病毒是乙型病毒性肝炎的感染病毒，當前對其檢測最為有效的方法即為實時熒光定量PCR（聚合酶鏈式反應）檢測技術，其將熒光標志技術與PCR技術相結(jié)合，在對乙肝病毒DNA的檢測中具有特異性強、靈敏度高等優(yōu)點[2]，但是HBV-DNA的檢測目前還沒有一個統(tǒng)一的標準，對于相同標本，使用不同儀器、不同試劑檢測所得出的結(jié)果差別較大。本研究對采用實時熒光定量PCR方法檢測乙肝DNA的影響因素進行分析，同時提出有針對性的管理建議，現(xiàn)報告如下。

資料與方法

1.臨床資料。選取2011年8月至2014年10月我院收治并已確診的395例乙型肝炎病毒感染患者為研究對象，其中男性184例，女性211例；患者年齡16～65歲，平均(49.75±9.53)歲。

2.方法。對395例患者進行血標本制作，空腹狀態(tài)下抽取肘靜脈血，置入黃蓋血清管，離心后取血清進行實時熒光定量PCR檢測乙肝DNA。核酸擴增條件：95℃條件下預變性3min，94℃(30sec) 60℃（15sec）循環(huán)40次，反應結(jié)束后，制作標準曲線，計算得出標本中的DNA模板量，根據(jù)試劑盒的陽性質(zhì)控標準進行標本的陽性質(zhì)控。本研究中所用試劑為艾康生物科技有限公司生產(chǎn)的乙肝DNA檢測試劑盒，所用儀器為美國ABI公司生產(chǎn)的StepOne實時熒光定量分析儀。以臨床診斷結(jié)果為對照標準，對比實時熒光定量PCR檢測乙肝DNA結(jié)果差異，并對導致兩者間差異的影響因素進行分析。

3.統(tǒng)計學分析。采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行分析，計數(shù)資料以頻率及百分率表示，組間比較采用配對卡方檢驗，檢驗水準а=0.05。當P＜0.05時，差異具有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1.檢測結(jié)果對比。通過實時熒光定量PCR技術檢測乙肝DNA確診374例，占94.7%，漏診誤診21例，占5.3%，兩者對比差異未見顯著性差異(P＞0.05)，說明該方法的診斷準確率較高。

2.影響因素分析。對影響檢測結(jié)果的因素進行分析，主要包括實驗室條件、標本操作（標本抗凝血操作、標本貯存與溶血和血脂影響）以及核酸提取方法等。見表1。

表1 影響因素分析

討論

1.實驗室條件影響因素。PCR技術的最大特點是具備極高的靈敏度，但同時極其微量的污染即可造成假陽性結(jié)果的產(chǎn)生[3]。因此，臨床基因擴增檢驗實驗室的技術驗收和規(guī)范化管理是在臨床上應用此項技術的基本前提。臨床基因擴增檢驗實驗室原則上應分為四個單獨的工作區(qū)域，包括試劑貯存區(qū)、標本制備區(qū)、擴增區(qū)及擴增產(chǎn)物分析區(qū)，另外對人員培訓和操作規(guī)程也有具體要求。本研究中，由于實驗室條件影響因素造成漏診誤診3例，占14.3%，說明實驗室的硬件建設與軟件規(guī)范均應有所加強。

2.標本因素影響。包括標本抗凝血因素、貯存因素及溶血和血脂因素等。

2.1 標本抗凝血因素。由于機體在感染乙肝病毒后會血液中會出現(xiàn)乙肝病毒DNA，因此HBV-DNA的檢測一般都以血清或血漿作為標本。正常情況下EDTA抗凝(紫管)血漿、枸櫞酸鈉(黑管)血漿都可以用于進行HBV-DNA PCR檢測。EDTA與枸櫞酸鈉雖然都能結(jié)合Mg2+，但由于水平充足，不會影響最終的檢測結(jié)果[4]。而肝素作為核酸檢測常用的血液抗凝劑，能抑制聚合酶的活性，被公認為PCR反應抑制劑，在使用肝素作為抗凝素時，會導致標本的裂解失效，實時熒光定量PCR無法對血漿和血清進行有效檢測，產(chǎn)生假陰性結(jié)果。因此在PCR檢測中，盡量避免使用肝素作為抗凝劑。

2.2 標本存儲的影響。由于標本量及檢測周期原因，大部分實驗室不會每天進行HBV-DNA檢測，因此標本的貯存相當重要。由于細胞內(nèi)的酶對DNA具有降解，如靜止時間超過3小時，或貯存溫度超過25℃時，會造成標本變性，影響檢測結(jié)果[5]。所以臨床貯存標本HBV-DNA應在及時分離血清或血漿的前提下，將其于-20℃以下環(huán)境貯存。

2.3 溶血及血脂因素。溶血和血脂會造成血液內(nèi)血紅蛋白變形，導致熒光信息強度發(fā)生變化，影響檢測結(jié)果。理論上講血紅素可以經(jīng)卟琳環(huán)與Taq酶發(fā)生不可逆的結(jié)合，從而抑制后者活性，因此標本發(fā)生溶血時會對HBV-DNA的檢測結(jié)果帶來明顯影響。但也有實驗證明，對發(fā)生溶血的HBV-DNA標本與未溶血標本之間檢測結(jié)果進行對比，差異并無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，其原因或許在于血紅蛋白經(jīng)100℃10分鐘后，已經(jīng)發(fā)生變性，喪失了結(jié)合Taq酶的活性，或者在提取核酸前，經(jīng)過高速離心沉淀HBV顆粒、棄去上清等處理，大大降低了血紅蛋白帶來的影響。血脂因素可導致熒光淬滅，降低熒光信號強度，同時脂肪或其代謝產(chǎn)物能抑制Taq酶的活性，降低擴增效率，導致檢測結(jié)果降低。但亦有實驗證明，高血脂對檢測結(jié)果并無顯著影響。尹琦和徐玉蟬等[6]研究發(fā)現(xiàn)，三酰甘油小于或等于45.96 mmol/L時，并不會對檢測結(jié)果產(chǎn)生影。

黃翔等[7]通過PEG沉淀煮沸法發(fā)現(xiàn)，在膽固醇未高于12mmol/L情況下同，HBV-DNA的檢測結(jié)果與膽固醇水平間并無顯著相關性，說明PEG沉淀煮沸法能有效地去除標本中的膽固醇，提高擴增效率。

3.核酸提取方法的影響。采用不同的核酸提取方法對于采用實時熒光定量PCR技術檢測血清HBV-DNA結(jié)果差異較大[8]。李金明等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在應用PCR技術對HBV-DNA進行檢測時，使用煮沸裂解法處理血清標本的效果較差，而應采用核酸純化方法。陳曉東等[10]認為，磁珠核酸提取法應作為PCR技術中檢測中的首選方法，其檢測結(jié)果與沉淀煮沸裂解法和直接煮沸裂解法均存在顯著性差異(P＜0.05)，其中直接煮沸裂解法的提取效率最低，少于磁珠核酸提取法兩個數(shù)量級。

通過上述分析，我們認為在應用實時熒光定量PCR對HBV-DNA進行檢測時，需注意以下幾點：首先要嚴格規(guī)范實驗室硬件與軟件建設，規(guī)范實驗室檢查條件，嚴格遵循分區(qū)原則，實驗室人員要嚴格單向走動，避免跨區(qū)操作，同時在室內(nèi)安裝通風設備，注意對空氣有可能會引起檢查誤差的物質(zhì)進行及時排除。其次，嚴格進行試劑盒的選擇；采集標本時要防止污染，避免表皮、體液細胞及頭發(fā)等成分的混入；處理標本采用帶濾芯吸頭，并保證一人一個吸頭，防止發(fā)生氣溶膠污染；在標本貯存時采用專用冰箱，對于拆封及未拆封的試劑分開放置，認真登記有效期；最后，對實驗室人員進行培訓，以提高專業(yè)技能，掌握儀器必要的使用和維護技術，定期對儀器及用具進行嚴格消毒。

綜上所述，實時熒光定量PCR在HBV-DNA的檢測中準確率較高，具有較高應用價值，但仍有一定的漏診和誤診率，需加強管理，在多方面進行綜合預防。

1 郭楠，李寶萍，李慧萍，等. 反應體系對熒光定量PCR檢測乙肝核酸結(jié)果影響的分析[J].中國實驗診斷學，2013,17(5)：877-879

2 范公忍，韓聚強，胡學玲，等.兩種核酸提取方法對血清HBV DNA熒光定量檢測結(jié)果的影響[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2013,23(9)：2110-2112,2114

3 郝維敏，劉杰，楊曉春.標本因素對熒光定量PCR檢測HBV DNA的影響[J].蚌埠醫(yī)學院學報，2011,36(3)：295-297

4 高國生，姜俊，翁彭劍.不同標本因素對熒光定量PCR法測定HBV DNA結(jié)果的影響[J].現(xiàn)代實用醫(yī)學，2010,22(1)：37-38

5 胡玉弘，陳玲玲，馮軍.標本存放時間對熒光定量PCR檢測HBV-DNA結(jié)果的影響[J].中國醫(yī)學創(chuàng)新，2010,7(24)：7-8

6 尹琦，徐玉蟬.影響HBV DNA測定的標本因素[J].臨床檢驗雜志，2008,26(2)：133-134

7 黃翔，王暉，周志明，等.溶血和脂血標本中乙肝病毒DNA提取方法的選擇與評價[J].華中醫(yī)學雜志，2004,28(2)：123-124

8 梅玉峰，黃敏，危艷順.濃縮裂解煮沸法在熒光定量PCR測定HBV DNA中的應用[J].檢驗醫(yī)學與臨床，2009,6(5)：359-360

9 李金明，王露楠，鄧巍.標本處理對聚合酶鏈反應測定乙肝病毒核酸的影響[J].中華檢驗醫(yī)學雜志，2000,23(6)：337-339

10 陳曉東，陶志華，周武.核酸提取方法在聚合酶鏈反應測定乙肝病毒核酸中的評價[J].中華檢驗醫(yī)學雜志，2002,25(4)：212-214