1 株產(chǎn)纖維素酶真菌的篩選鑒定及其產(chǎn)酶條件優(yōu)化

楊培新， 鄭銳東， 羅集豐， 謝桂勉， 鄭鋼勇， 方培煒， 蔡佳維

(1.揭陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程系，廣東 揭陽522000;2.揭陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院實(shí)訓(xùn)中心，廣東 揭陽522000;3.揭陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院師范教育系，廣東 揭陽522000)

纖維素是地球上分布最廣、數(shù)量最大的可再生資源［1-5］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，僅中國每年即產(chǎn)生約6.9 ×108t農(nóng)作物秸稈和纖維素廢棄物［6］，然而受限于化學(xué)、生物轉(zhuǎn)化技術(shù)，大量纖維素廢棄物只能通過堆積、焚燒等落后方式直接進(jìn)入環(huán)境，造成嚴(yán)重的污染和資源浪費(fèi)。隨著微生物資源的逐步開發(fā)、微生物技術(shù)的日趨成熟，利用微生物降解纖維素進(jìn)而轉(zhuǎn)化成高附加值產(chǎn)品成為可能［7］，中國科學(xué)院、山東大學(xué)等機(jī)構(gòu)先后對(duì)此領(lǐng)域開展了大量研究，并取得突破［6］。目前，微生物轉(zhuǎn)化因具有經(jīng)濟(jì)、高效、節(jié)約等優(yōu)點(diǎn)而成為開發(fā)利用纖維素資源的熱門課題［8-10］。隨著研究的推進(jìn)，大規(guī)模纖維素微生物轉(zhuǎn)化工藝的發(fā)展，將有效解決糧食危機(jī)、資源危機(jī)、環(huán)境污染等全球性難題。但纖維素酶用量大、成本高是限制其應(yīng)用的一個(gè)重要因素［11］，因此選育出產(chǎn)酶高、生長快的合適菌株，優(yōu)化發(fā)酵條件，提高纖維素酶產(chǎn)量具有重要的意義［8］。

自然界中存在能夠降解纖維素的眾多微生物資源。近些年關(guān)于產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選研究也很多，但真正高產(chǎn)量的菌株并不多見。本研究從常年堆積廢氣竹筍殼的土壤中篩選產(chǎn)纖維素酶真菌，并在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上對(duì)其發(fā)酵產(chǎn)酶條件進(jìn)一步優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 采自廣東省揭陽市埔田鎮(zhèn)長期堆積竹筍殼廢棄物的土壤。

1.1.2 培養(yǎng)基［1］CMC-Na(羧甲基纖維素鈉)培養(yǎng)基、纖維素剛果紅培養(yǎng)基、赫奇遜培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離與篩選［1］樣品用無菌水進(jìn)行系列稀釋并涂布于纖維素剛果紅培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)，菌落呈紅色且能在周圍形成透明水解圈的菌株即為能產(chǎn)纖維素酶的菌株。挑出其中生長快、顏色深且水解圈直徑大的菌落，分別接種于含濾紙條的赫奇遜培養(yǎng)基中，30 ℃，140 r/min培養(yǎng)5 d。挑選濾紙條崩解充分的菌株，并于CMC-Na 培養(yǎng)基上涂板、劃線，反復(fù)篩選純化菌株。

1.2.2 菌株的鑒定 形態(tài)鑒定:菌株在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d 后，進(jìn)行菌落形態(tài)觀察，同時(shí)取少量菌絲于顯微鏡下觀察菌絲及孢子形態(tài)。ITS 分析:采用CTAB 法抽提菌株基因組DNA，以其為模板，以通用引物ITS1(5'-AGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3')、ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGCTTAA-3')為擴(kuò)增引物。PCR 反應(yīng)條件:95 ℃5 min，95 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃1 min 30 s，24 個(gè)循環(huán)，72 ℃10 min，10 ℃。PCR 產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)合格后進(jìn)行測(cè)序(由上海美吉生物公司完成)。將所得序列通過Blast 程序和GenBank 核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，采用ClustalW 進(jìn)行多序列匹配排列，通過MEGA6.06軟件包中的Kimura 2-parameter 方法計(jì)算進(jìn)化距離，用N-J 法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.3 纖維素酶活測(cè)定方法 采用DNS 法［12］。酶活定義:在pH5.0、50 ℃下每1 ml 酶液在1 min 內(nèi)水解CMC-Na 生成1 μg 葡萄糖的酶活性為1 個(gè)纖維素酶活性(CMC 酶活)單位(IU)。酶活的計(jì)算:CMC 酶活性=［(G×B)/(2.5×30)］×103，式中G 為樣品中葡萄糖含量(μg)，B 為酶液稀釋倍數(shù)，2.5 為吸取酶液的體積(ml)，30 為糖化時(shí)間(min)。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線 標(biāo)準(zhǔn)曲線參照文獻(xiàn)［13］。

1.2.5 單因素試驗(yàn)［14］在前期培養(yǎng)基各組分、各發(fā)酵條件單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取其中對(duì)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶影響較明顯的3 個(gè)因素(初始pH 值、CMCNa 濃度和酵母膏濃度)作為重點(diǎn)研究對(duì)象。以CMC-Na 培養(yǎng)基為基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量為10%，發(fā)酵溫度為30 ℃，以纖維素酶活為指標(biāo)，分別研究不同初始pH 值(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)、CMC-Na濃度(5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L)和酵母膏濃度(0.5 g/L、1.0 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L、2.5 g/L)對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶活性的影響。

1.2.6 優(yōu)化方法 根據(jù)前期單因素試驗(yàn)所篩選的最佳初始pH 值、CMC-Na 和酵母膏濃度，應(yīng)用3 因素3 水平的Box-Behnken 設(shè)計(jì)［15］，以纖維素酶活性為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面法進(jìn)行分析，試驗(yàn)因素及水平見表1。響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果運(yùn)用Design Expert7.0 分析軟件進(jìn)行方差分析。為了驗(yàn)證所得結(jié)果的可靠性，結(jié)合實(shí)際試驗(yàn)條件，在優(yōu)化條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，做3 次平行試驗(yàn)，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選結(jié)果

從埔田地區(qū)長期堆放竹筍殼廢棄物土壤中經(jīng)過剛果紅透明圈法篩選分離到1 株具有較強(qiáng)降解纖維素能力、生長速度較快且長勢(shì)旺盛的產(chǎn)纖維素酶真菌(暫定名為cel403)。該菌株在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d，菌落呈圓形，邊緣平整，有白色菌絲，表面粗糙，布滿一層孢子粉，孢子呈暗綠色(圖1)。在纖維素剛果紅培養(yǎng)基平板上有透明圈(圖2)。

表1 Box-Behnken 試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments

圖1 產(chǎn)纖維素酶真菌cel403 在PDA 斜面上的生長Fig.1 Growth of cellulase-producing fungus cel403 on PDA medium

圖2 cel403 在纖維素剛果紅培養(yǎng)基平板上形成的透明圈Fig.2 Transparent zones of cel403 on the congo red plates

通過顯微鏡觀察，菌體呈絲狀，菌絲發(fā)達(dá)，多分枝，菌叢呈黑褐色，頂囊球形，小梗雙層，分生孢子梗從膨大的菌絲細(xì)胞上垂直生出(圖3)，分生孢子為球形(圖4)。根據(jù)菌落形態(tài)觀察及顯微鏡鏡檢結(jié)果，參考《真菌鑒定手冊(cè)》［16］，初步確定該菌為曲霉屬。

2.2 ITS 分析結(jié)果

圖3 cel403 菌絲形態(tài)(×1 000)Fig.3 Mycelium morphology of cel403(×1 000)

圖4 cel403 孢子形態(tài)(×1 000)Fig.4 Spore morphology of cel403(×1 000)

提取菌株cel403 基因組DNA 并進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果如圖5。PCR 擴(kuò)增獲得1 條約550 pb 的亮帶。測(cè)序后，使用BIOEDIT 軟件進(jìn)行拼接，得到該菌的ITS 序列，長度為564 pb，序列如下:TCCGTAGGGGAACCTGCGGAAG GATCATTACTGAGTGCGGGCTGCCTCCGGGCGCCCA ACCTCCCACCCGTGAATACCTAACACTGTTGCTTCG GCGGGGAACCCCCTCGGGGGCGAGCCGCCGGGGAC TACTGAACTTCATGCCTGAGAGTGATGCAGTCTGAG TCTGAATATAAAATCAGTCAAAACTTTCAACAATGG ATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGA ACTGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGA ATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGG CATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCT GCCCATCAAGCCCGGCTTGTGTGTTGGGTCGTCGTC CCCCCCGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGC ACCGTGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCA CCCGCTCGACTAGGGCCGGCCGGGCGCCAGCCGAC GTCTCCAACCATTTTTCTTCAGGTTGACCTCGGATCA GGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAA GCGG。

圖5 電泳檢測(cè)ITS PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.5 Electrophoresis of PCR product of ITS rDNA

將該序列提交GenBank，登錄號(hào)為KM233157。采用Blast 軟件比對(duì)，同源性高(98%以上)的均為Aspergillus(曲霉屬)。根據(jù)序列同源性從高到低順序選取6 株菌株，利用Mega6.06 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖6)，結(jié)果顯示菌株cel403 與Aspergillus versicolor NRRL58999 處于同一分支，親緣性最近，由此判斷該菌為Aspergillus versicolor(雜色曲霉)。

2.3 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 發(fā)酵時(shí)間 發(fā)酵時(shí)間的長短直接影響纖維素酶活性。發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶活性的影響如圖7 所示。纖維素酶活性隨發(fā)酵時(shí)間的延長而提高，至發(fā)酵第6 d 達(dá)到最高點(diǎn)，之后逐漸下降。為減少發(fā)酵成本，降低染菌概率，選擇6 d 為最佳發(fā)酵時(shí)間。

圖6 菌株cel403 ITS 系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.6 Phylogenetic tree of strain cel403 and related strains based on ITS

圖7 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株cel403 發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶活性的影響Fig.7 Influence of different fermentation time durations on the activity of cellulase produced by strain cel403

2.3.2 碳源和氮源含量及初始pH 值 由圖8、9、10 可直觀看出，不同的初始pH、CMC-Na 濃度和酵母膏濃度均會(huì)對(duì)菌株cel403 發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶產(chǎn)生影響，其中以初始pH、CMC-Na 濃度尤為顯著。在選取的范圍內(nèi)，分別在pH7、CMC-Na 濃度15 g/L、酵母膏濃度1.0 g/L時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶活性出現(xiàn)峰值，故以上述數(shù)值為中心值，并圍繞該值選擇自變量范圍進(jìn)行Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

2.3.3 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果與分析［17-18］綜合分析單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定初始pH、CMC-Na濃度和酵母膏濃度3 個(gè)因素為自變量，根據(jù)Box-Behnken 設(shè)計(jì)原理，以纖維素酶活性為響應(yīng)值設(shè)計(jì)試驗(yàn)。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

圖8 不同培養(yǎng)基初始pH 值對(duì)菌株cel403 產(chǎn)纖維素酶活性的影響Fig.8 Effects of different initial pH values of the medium on the activity of cellulase produced by strain cel403

圖9 不同CMC-Na 濃度對(duì)菌株cel403 產(chǎn)纖維素酶活性的影響Fig.9 Effects of different CMC-Na concentrations on the activity of cellulase produced by strain cel403

圖10 不同酵母膏濃度對(duì)菌株cel403 產(chǎn)纖維素酶活性的影響Fig.10 Effects of different yeast extract concentrations on the activity of cellulase produced by strain cel403

采用Design-Expert7.0 軟件對(duì)表2 試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，獲得發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶活性對(duì)初始pH、CMC-Na 濃度和酵母膏濃度的二次多項(xiàng)回歸方程:Y = 81.92 + 5.75X1+4.75X2+ 2.23X3+。方差分析結(jié)果表明，該模型顯著(P=0.001 3)，失擬項(xiàng)不顯著(P =0.086 8)。該模型確定系數(shù)R2= 0.944 3，校正系數(shù) Radj2=0.872 6，說明模型與實(shí)際情況擬合較好，可有效預(yù)測(cè)Aspergillus cel403 發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶活性情況。對(duì)回歸方程取一階偏導(dǎo)等于0 并整理可得模型極點(diǎn)坐標(biāo)為:X1=7.11，X2=15.60 g/L，X3=1.09 g/L。此時(shí)，模型預(yù)測(cè)最大纖維素酶活性為83.44 IU/ml。從初始pH、CMC-Na 濃度和酵母膏濃度交互影響纖維素酶活的響應(yīng)面圖(圖11)可直觀看出各因素對(duì)響應(yīng)值影響的變化趨勢(shì)。

表2 Box-Behnken 設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

經(jīng)過上述響應(yīng)曲面優(yōu)化，得到菌株cel403 發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的最優(yōu)方案如下:培養(yǎng)基組成為CMCNa 15.60 g、KH2PO41.00 g、MgSO4·7H2O 0.50 g、NaCl 0.10g、NaNO32.50 g、FeCl31 mg、CaCl20.10 g、酵母膏1.09 g，H2O 1 000 ml，pH7.1;30 ℃、140 r/min搖床培養(yǎng)6 d。以未經(jīng)優(yōu)化的發(fā)酵條件作為對(duì)照，進(jìn)行方案驗(yàn)證。結(jié)果表明發(fā)酵條件未經(jīng)優(yōu)化和優(yōu)化后獲得纖維素酶活性分別為77.95 U/ml 和89.66 U/ml，通過優(yōu)化酶活性提高了15.02%。

3 結(jié)論

圖11 初始pH、CMC-Na 濃度和酵母膏濃度交互影響纖維素酶活性的響應(yīng)面圖Fig.11 Response surface of cellulase activity produced by cel403 affected by the interaction between initial pH，CMC-Na concentration and yeast extract concentration

從長期堆放竹筍殼廢棄物土壤中經(jīng)過剛果紅透明圈法篩選分離到1 株具有較強(qiáng)降解纖維素能力并生長速度較快且長勢(shì)旺盛的產(chǎn)纖維素酶真菌。經(jīng)形態(tài)特征觀察、ITS 分析，并構(gòu)建該菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹，初步鑒定該菌為曲霉屬，暫定名為Aspergillus cel403。采用單因素試驗(yàn)研究了初始pH、CMC-Na濃度和酵母膏濃度對(duì)菌株cel403 發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶活性的影響，在此基礎(chǔ)上運(yùn)用響應(yīng)面分析得出最佳發(fā)酵條件:培養(yǎng)基組成為CMC-Na 15.60 g、KH2PO41.00 g、MgSO4·7H2O 0.50 g、NaCl 0.10g、NaNO32.50 g、FeCl31 mg、CaCl20.10 g、酵母膏1.09 g，H2O 1 000 ml，pH7.1;30 ℃、140 r/min搖床培養(yǎng)6 d。在該條件下，菌株cel403 發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶活性為89.66 IU/ml，比石文卿等［12］分離到的纖維素酶真菌D1 產(chǎn)酶活性(CMC 酶活31.12 IU/ ml)高，具備進(jìn)一步開發(fā)潛能。

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