馬鈴薯StPYL1 和StPYL8 基因的分子克隆與表達(dá)分析

徐玉偉， 印敬明， 白 瀟， 史 珂， 楊 清

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京210095)

植物激素脫落酸(Abscisic acid，ABA)參與了多個(gè)植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，如促進(jìn)葉、花、果脫落，側(cè)芽生長(zhǎng)，塊莖休眠以及葉片衰老，抑制種子發(fā)芽，植株生長(zhǎng)等［1］。作為“脅迫激素”，ABA 在植物應(yīng)對(duì)生物脅迫與非生物脅迫過(guò)程中也起著關(guān)鍵作用［2-3］。在干旱和高鹽脅迫下，植物體內(nèi)ABA 的含量迅速增加，調(diào)節(jié)氣孔關(guān)閉，減少蒸騰，保護(hù)光合作用，并調(diào)控大量相關(guān)基因的表達(dá)［4-5］。

ABA 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，ABA 受體是ABA 信號(hào)通路最上游的信號(hào)調(diào)節(jié)因子，承擔(dān)著識(shí)別ABA 信號(hào)和啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)原初過(guò)程的使命［6］。在過(guò)去的研究中，一共發(fā)現(xiàn)了4 種ABA 受體，最先報(bào)道的是從蠶豆和擬南芥中分離的葉綠體蛋白ABAR/CHLH，該蛋白既是ABA 的受體(ABAR)，同時(shí)也是鎂螯合酶H 亞基(CHLH)，參與葉綠素的合成和質(zhì)體-核反向信號(hào)傳導(dǎo)［7-8］。WRKY 類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子負(fù)調(diào)控ABA 信號(hào)，它能夠抑制ABI5 等響應(yīng)ABA 的基因在細(xì)胞中正常表達(dá)［9］。ABAR 通過(guò)下調(diào)WRKY 類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，消除其對(duì)ABI5 等基因的抑制作用，向下釋放ABA 信號(hào)，但缺少其能與ABA 直接結(jié)合的結(jié)構(gòu)證據(jù)［10］。第二種G 蛋白偶聯(lián)受體GCR2，GCR2 是ABA 在細(xì)胞膜上的一種受體［11］。對(duì)將該蛋白定義為G 蛋白偶聯(lián)受體及它在種子發(fā)芽和幼苗形態(tài)建成過(guò)程ABA 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用一直存有爭(zhēng)議［1］。第三種G 蛋白偶聯(lián)受體GTG1 和GTG2，是位于細(xì)胞膜上的一類(lèi)ABA 受體，最近的藥理學(xué)和遺傳學(xué)證據(jù)表明GTG1 和GTG2 確實(shí)參與了ABA 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［12］。盡管上述三種蛋白都被認(rèn)為是ABA 受體，并在ABA 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中起著重要作用，但是它們?cè)谏砗头肿由吓c重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子如PP2C 和SnRK2 等之間的聯(lián)系是不清楚的。2009年，Ma 和Park 兩個(gè)獨(dú)立的研究小組分別利用酵母雙雜交和篩選突變體方法在擬南芥中篩選出一種新的ABA受體 PYR/PYLs/RCARs (Pyrabactin Resistance/Pyrabactin Resistance Likes，PYR/ PYLs，Regulatory Components of ABA Receptors，RCARs，后 面 統(tǒng) 稱(chēng)PYLs)蛋白［13-14］。在這種新發(fā)現(xiàn)的ABA 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中有3 種核心組份:ABA 受體PYLs 蛋白、負(fù)調(diào)控因子2C 類(lèi)蛋白磷酸酶PP2Cs(Type 2C protein phosphatases)和正調(diào)控因子SNF1 相關(guān)的蛋白激酶2 SnRK2s (Subfamily 2 of SNF1-related kinases)，三者共同組成了一個(gè)雙重負(fù)調(diào)控系統(tǒng)［13-15］。PYL 是一類(lèi)含有START(STAR-RELATED LIPID-TRANSFER)特征區(qū)域的蛋白質(zhì)，并且具有此結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)都含有疏水性的配體結(jié)合區(qū)，并通過(guò)該區(qū)域與ABA 結(jié)合。PYL 與ABA 結(jié)合后可抑制PP2C 活性，以阻止PP2C 脫去SnRK2 上的磷酸基團(tuán)［16-18］。然后，有活性的SnRK2 可磷酸化下游轉(zhuǎn)錄因子，如ABFs/AREBs 等，通過(guò)它們進(jìn)一步激活A(yù)BA應(yīng)答基因［19-20］。在擬南芥中PYL 蛋白家族有14 個(gè)成員，被命名為PYR1 和PYL1 ～PYL13，它們廣泛地分布于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)。PYL 可以直接與ABA 結(jié)合，但是每個(gè)PYL 家族成員與ABA 結(jié)合的能力以及對(duì)ABA 立體構(gòu)型的選擇性卻不完全相同［21］。

目前，對(duì)PYL 的研究主要集中在擬南芥、大豆等有限的幾種植物及其結(jié)構(gòu)特征上［13-15，18，22］，在馬鈴薯上鮮有相關(guān)報(bào)道。本研究根據(jù)擬南芥與大豆PYL 序列信息及馬鈴薯基因組數(shù)據(jù)庫(kù)信息設(shè)計(jì)引物，從馬鈴薯栽培品種Désirée 幼苗葉片中克隆PYL 基因cDNA，分析該基因的結(jié)構(gòu)特征、親源關(guān)系以及在外源ABA 處理及兩種逆境下的表達(dá)模型。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)材料為馬鈴薯(Solanum tuberosum L.)栽培品種Désirée，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

Trizol 試劑、PCR 相關(guān)試劑、M-MLV 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNaseI 試劑盒及克隆載體pMD-19T 均購(gòu)自TaKaRa 公司;凝膠回收試劑盒購(gòu)自Axygen 公司;引物合成由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成;大腸桿菌DH5a 為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 基因克隆

首先采用Trizol 法從組培苗中提取總RNA，參照DNaseI 試劑盒說(shuō)明消除微量DNA 污染，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit)合成cDNA 第1 鏈，作為后續(xù)PCR 擴(kuò)增模板。然后根據(jù)已有擬南芥(Arabidopsis thaliana)和大豆(Glycine max)PYL 基因序列，及馬鈴薯基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，分別設(shè)計(jì)出擴(kuò)增StPYL1 和StPYL8 cDNA 全長(zhǎng)序列引物:StPYL1-F(5'-CCTTCCTCTCTCTATTTCTT-3')、StPYL1-R (5'-TCACCTGTGACTTACATCAC-3')、StPYL8-F(5'-GGTTAAAAAGTTGGAAATTT-3')和StPYL8-R(5'-ACAGGATACACCATACACGC-3')，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)?94℃5 min;94 ℃40 s，50 ℃30 s，72 ℃50 s，30 個(gè)循環(huán);72 ℃10 min。PCR 產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳，按凝膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)回收目的片段，然后將其連接到pMD19-T 載體，熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，經(jīng)藍(lán)白斑篩選和PCR 檢測(cè)，陽(yáng)性克隆送華大基因公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3 生物信息學(xué)分析

序列同源性比對(duì)由NCBI 的BLAST 程序(http://www.ncbi. nlm. nih. gov/blast/)進(jìn)行。開(kāi)放閱讀框架預(yù)測(cè)由NCBI 的ORF finder (http://www.ncbi.nih.gov/gorf/gorf.html)程序完成。蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)(等電點(diǎn)、分子量)的預(yù)測(cè)由ProtParam (http://www.expasy. org/tools/protparam. html)完成。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)由PSIPRED v3.3 Predict Secondary Structure (http://bioinf. cs. ucl. ac. uk/psipred/)完成。蛋白質(zhì)序列區(qū)域(domains)分析由InterProScan 4 (http://www. ebi. ac. uk/Tools/pfa/iprscan/)完成。蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)由Swiss Model Server (http://swissmodel.expasy.org/)完成。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)由Clustalx1.83 和MEGA5. 0 程序構(gòu)建，采用鄰接法(Neighbor Joining Method)作圖，重復(fù)計(jì)算次數(shù)設(shè)為1000。氨基酸序列比對(duì)和一致性分析使用DNAMAN 5.2 軟件。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)和蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果編輯由ESPript 3(http://espript. ibcp. fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi)完成。

1.4 基因的表達(dá)分析

基因組織表達(dá)分析使用大棚內(nèi)生長(zhǎng)材料。在生長(zhǎng)期分別取其莖、葉，經(jīng)液氮速凍后，在－70 ℃保存，用于不同組織中基因的表達(dá)分析。在采收期分別取馬鈴薯的起始匍匐莖、延伸匍匐莖、膨大匍匐莖、初始?jí)K莖，液氮速凍后，置于－70 ℃保存，用于塊莖形成過(guò)程中的基因表達(dá)分析。

外源ABA 處理、鹽脅迫處理、PEG 模擬干旱處理的材料均來(lái)自于用MS 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)45 d 左右的組培苗。外源ABA 處理:用20 mmol/L的ABA 噴施后0 h、6 h、12 h、24 h、48 h 和72 h 取葉樣。鹽脅迫:用含有200 mmol/L NaCl 的MS 培養(yǎng)0 h、6 h、12 h、24 h、48 h 和72 h 后取葉樣。PEG 模擬干旱處理:用含有30% PEG-6000 的MS 培養(yǎng)0 h、6 h、12 h、24 h、48 h 和72 h 后取葉樣。

采用半定量RT-PCR 進(jìn)行基因表達(dá)分析，內(nèi)參基因?yàn)镋F-1α，引物分別為EF-1α-F:5'-ATTCAAGTATGCCTGGGTGCT-3' 和 EF-1α-R:5'-GTGGTGGAGTCAATAATGAGGAC-3'，PCR 條件為:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃40 s，55 ℃20 s，72 ℃20 s，24 個(gè)循環(huán);72 ℃10 min。利用引物StPYL1 R/F、StPYL8 R/F 進(jìn)行半定量RT-PCR 分別檢測(cè)基因StPYL1 和StPYL8 在馬鈴薯不同組織中的表達(dá)。PCR 擴(kuò)增條件為94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃40 s，50 ℃30 s，72℃50 s，28 個(gè)循環(huán);72 ℃10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 StPYL1 和StPYL8 的克隆及序列分析

以馬鈴薯cDNA 第一鏈為模板，用引物StPYL1 R/F;StPYL8 R/F 分別進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增，得到兩個(gè)大小約750 bp 片段(圖1)。測(cè)序顯示，StPYL1 和StPYL8 長(zhǎng)度分別為718 bp 和738 bp，基因StPYL1的ORF 長(zhǎng)度為696 bp，編碼一個(gè)由231 個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白，該蛋白的分子量為25 280，理論等電點(diǎn)為5.12;StPYL8 基因的ORF 長(zhǎng)度為561 bp，編碼一個(gè)由186 個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白，該蛋白的分子量為20 790，理論等電點(diǎn)為6.30。利用在線(xiàn)工具PSIPRED v3.3 分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)StPYL1蛋白含有3 個(gè)α 螺旋、3 個(gè)β 折疊，StPYL8 蛋白含有2 個(gè)α 螺旋、4 個(gè)β 折疊(圖2)。InterProScan 4 分析發(fā)現(xiàn)，StPYL1 和StPYL8 蛋白都含有START-like 結(jié)構(gòu)域(圖3)，利用基于同源建模的分析工具SWISSMODEL 進(jìn)行3D 結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，在提交序列進(jìn)行模板識(shí)別后，從蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)(PDB)中選擇3nef.1. A 為模板，運(yùn)用自動(dòng)同源建模方式，通過(guò)X-射線(xiàn)晶體衍射比較發(fā)現(xiàn)，StPYL1 與擬南芥PYL1 基因編碼ABA 受體蛋白3nef(AtPYL1)相似性為73.98%［18］。同樣的方法，以3oqu.1.A 為模板建模，通過(guò)X-射線(xiàn)晶體衍射比較發(fā)現(xiàn)，StPYL8 與擬南芥PYL9 基因編碼ABA 受體蛋白3oqu(AtPYLP)相似性為78.79%［22］(圖4)。

圖1 馬鈴薯StPYL1(A)和StPYL8(B)基因cDNA 擴(kuò)增條帶Fig.1 Agarose gel electrophoresis of amplification product of StPYL1(A)and StPYL8(B)cDNA from potato

圖3 馬鈴薯StPYL1 和StPYL8 結(jié)構(gòu)域分析Fig.3 Analysis of StPYL1 and StPYL8 domains

圖4 StPYL1(A)、StPYL8(C)與AtPYL1(B)、AtPYL9(D)三級(jí)結(jié)構(gòu)模型Fig.4 Tertiary structure models of StPYL1(A)，StPYL8(C)，AtPYL1(B)and AtPYL9(D)

StPYL1 與StPYL8 蛋白一致性是37. 02%，StPYL1 與其他23 種PYL 的氨基酸序列相似性為33% ～62%，其中與擬南芥AtPYL1 同源性最高。StPYL8 與其他23 種PYL 的氨基酸序列相似性為37% ～72%，其中與苜蓿MtPYL9 同源性最高(圖2)。進(jìn)化分析結(jié)果顯示，24 種PYL 蛋白具有相同的進(jìn)化起源，StPYL1 與苜蓿MtPYR1 進(jìn)化親緣關(guān)系最近，StPYL8 與擬南芥AtPYL8 的進(jìn)化親緣關(guān)系最近。在擬南芥中，PYL 家族被分成3 個(gè)亞家族，根據(jù)這種分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)，StPYL1 和StPYL8 分別屬于亞家族Ⅲ、亞家族Ⅰ［14-15］(圖5)。

2.2 基因StPYL1 和StPYL8 組織表達(dá)分析

利用半定量RT-PCR 方法檢測(cè)了馬鈴薯植株不同部位的StPYL1 和StPYL8 mRNA 水平。在莖、葉中，均能檢測(cè)到StPYL1 和StPYL8 表達(dá)，但是，StPYL1 在莖中表達(dá)較為強(qiáng)烈，且略強(qiáng)于StPYL8，在葉中有微弱表達(dá);而StPYL8 在葉中的表達(dá)水平高于其在莖的表達(dá)水平，且強(qiáng)于StPYL1 在葉中表達(dá)水平。在塊莖分化與發(fā)育過(guò)程中，StPYL1 和StPYL8均有不同程度的表達(dá)，然而，整個(gè)發(fā)育過(guò)程中StPYL8 表達(dá)強(qiáng)于StPYL1;StPYL1 在起始匍匐莖中表達(dá)略強(qiáng)于延伸匍匐莖、膨大匍匐莖和初始?jí)K莖;StPYL8 在起始匍匐莖、膨大匍匐莖和初始?jí)K莖中表達(dá)量大于延伸匍匐莖(圖6)。

2.3 基因StPYL1 和StPYL8 對(duì)外源ABA、鹽脅迫與干旱脅迫的表達(dá)響應(yīng)

外源ABA 處理以后，StPYL1 與StPYL8 表達(dá)量均上調(diào)，一段時(shí)間后達(dá)到峰值，隨后逐漸下降。30%PEG-6000 處理后，隨著時(shí)間變化，StPYL1 表達(dá)量變化不明顯，StPYL8 表達(dá)量逐漸增加，24 h 達(dá)到峰值，隨后表達(dá)量逐漸下降。200 mmol/L NaCl 處理后，StPYL1 表達(dá)量沒(méi)有發(fā)生明顯變化，StPYL8 基因上調(diào)表達(dá)，48 h 表達(dá)量達(dá)到峰值，隨后下降(圖7)。

3 討論

圖5 StPYL1 和StPYL8 的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.5 Phylogenetic analysis of StPYL1 and stPYL8

圖6 StPYL1 和StPYL8 的組織表達(dá)分析Fig.6 Expression analysis of StPYL1 and StPYL8 in different tissues

植物內(nèi)源激素ABA 具有廣泛的生物學(xué)功能，參與植物生長(zhǎng)發(fā)育各個(gè)階段以及植物應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫的分子調(diào)控過(guò)程。大量的研究結(jié)果表明，PYL、PP2C和SnRK2 這3 種信號(hào)組份在ABA 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中相互聯(lián)系，共同組成一個(gè)雙重負(fù)調(diào)控系統(tǒng)，通過(guò)調(diào)節(jié)下游的作用元件而形成一條完整的ABA 信號(hào)通路［13-14，23］。根據(jù)PYL 蛋白家族在擬南芥中的分類(lèi)，本試驗(yàn)克隆得到的StPYL1 和StPYL8 兩個(gè)基因分別屬于Ⅲ類(lèi)和Ⅰ類(lèi)。進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)StPYL1 與Mt-PYR1、StPYL8 與AtPYL8 有較近的親緣關(guān)系。結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)StPYL1 與StPYL8 都含有START-like結(jié)構(gòu)域，這與已知的PYL 蛋白結(jié)構(gòu)特點(diǎn)相一致［13-15，18，22］。3D 結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析表明，StPYL1 與At-PYL1、StPYL8 與AtPYL9 結(jié)構(gòu)相似性較高。上述分析結(jié)果都證明StPYL1 和StPYL8 可能是ABA 受體蛋白。

圖7 ABA、干旱和NaCl 處理對(duì)StPYL1 和StPYL8 基因表達(dá)影響Fig.7 StPYL1 and StPYL8 genes expressions in potato exposed to ABA，drought and NaCl treatments

在組織表達(dá)特性上，StPYL1 和StPYL8 在同一組織中表達(dá)量有所差異，在葉片中，StPYL1 有微弱表達(dá)，而StPYL8 表達(dá)較為強(qiáng)烈;在莖中，StPYL1 表達(dá)強(qiáng)于StPYL8。這點(diǎn)與擬南芥AtPYR1 和AtPYL8基因在莖和葉中的表達(dá)特征相似［24］。在擬南芥中還發(fā)現(xiàn)，PYR1，PYL1，PYL2，PYL4，PYL5 和PYL8 等基因在葉片和莖中表達(dá)集中在維管束組織，值得一提的是，維管束是許多植物逆境應(yīng)答的傳導(dǎo)通道，并且免疫學(xué)研究結(jié)果證實(shí)維管束薄壁組織細(xì)胞中含有大量的NCED3，ABA2 和AAO3 等ABA 合成相關(guān)酶［24-25］。在馬鈴薯塊莖形成過(guò)程中，StPYL1 表達(dá)水平變化不明顯，且表達(dá)量較低;相對(duì)而言，StPYL8 表達(dá)量較高，并且不同塊莖發(fā)育時(shí)期，表達(dá)量有所變化。表明基因StPYL8 可能參與了馬鈴薯的塊莖發(fā)育過(guò)程但機(jī)理尚需要進(jìn)一步研究。

馬鈴薯幼苗經(jīng)過(guò)外源ABA 處理后，StPYL1 與StPYL8 表達(dá)量增加，表明二者均受外源ABA 誘導(dǎo)。研究發(fā)現(xiàn)，外源ABA 處理擬南芥幼苗，隨時(shí)間延長(zhǎng)，PYR1、PYL1、PYL4、PYL5、PYL6、PYL8 表達(dá)量逐漸下調(diào)，PYL2、PYL3 表達(dá)量逐漸上調(diào)，PYL7、PYL9 表達(dá)量上調(diào)至峰值后逐漸下降［26］。StPYL1 與AtPYR1、AtPYL1;StPYL8 與AtPYL8 氨基酸序列一致性較高，但是它們?cè)诓煌锓N中受ABA 誘導(dǎo)表達(dá)特征的不同之處值得深入探討。干旱和鹽脅迫處理后，StPYL1 表達(dá)量沒(méi)有發(fā)生顯著性的變化，StPYL8 表達(dá)量上調(diào)，表明StPYL8 參與了上述逆境調(diào)控。與野生型相比較，擬南芥pyr1/pyl1/pyl2/pyl4/pyl5/pyl8 6突變體植株生長(zhǎng)遲緩、植株矮小，氣孔開(kāi)放度明顯增大，葉片氣體交換速度加快，干燥環(huán)境下失水較快［27］?；駻tPYL8 受鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，并且PYL8過(guò)表達(dá)植株對(duì)鹽脅迫和甘露醇滲透脅迫表現(xiàn)的更加敏感，相對(duì)于野生型植株，RAB18、P5CS1、RD29A 和RD29B 等已知的ABA 應(yīng)答基因在過(guò)表達(dá)植株中表達(dá)量顯著增加［28］。上述結(jié)果都證明PYL 基因參與了植物應(yīng)激反應(yīng)，在逆境調(diào)控中發(fā)揮著重要作用［29］。在馬鈴薯中StPYL1 與StPYL8 雖同為ABA受體蛋白，但是參與環(huán)境脅迫響應(yīng)的調(diào)節(jié)方式可能不同。

在對(duì)擬南芥的研究中發(fā)現(xiàn)，pyr1/pyl1/pyl2/pyl4/pyl5/pyl8 6 突變體對(duì)ABA 超不敏感，PYL9、PYL5 和PYL8 的過(guò)表達(dá)植株在種子萌發(fā)、營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、基因表達(dá)和氣孔運(yùn)動(dòng)等多種生理過(guò)程中都表現(xiàn)出對(duì)ABA 更加敏感，且植株的耐旱能力顯著增強(qiáng)［13，28-30］，這些都表明PYL 在ABA 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的起著重要作用。

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