應(yīng)用熒光原位雜交技術(shù)檢測54例胚胎停育患者絨毛染色體數(shù)目異常的分析

馬 濤，岳 軍，林 鶴，謝 蘭

(四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，四川 成都 610072)

應(yīng)用熒光原位雜交技術(shù)檢測54例胚胎停育患者絨毛染色體數(shù)目異常的分析

馬 濤，岳 軍，林 鶴，謝 蘭

(四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，四川 成都 610072)

目的 應(yīng)用熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)方法對胚胎停育的絨毛組織進行分析，明確胚胎停育與染色體數(shù)目異常的情況。方法 選擇針對 13、16、18、21、22、X、Y染色體特異性熒光探針，應(yīng)用 FISH 方法，對154例胚胎停育的絨毛組織中的染色體數(shù)目進行分析，并了解胚胎停育患者絨毛染色體數(shù)目異常情況及其與患者年齡及流產(chǎn)次數(shù)的差異。結(jié)果 ①154例胚胎停育患者染色體數(shù)目異常56例(36.4%)，其中，常染色體三體40例(71.4%)，多倍體4例(7.1%)，45，XO 12例(21.4%)。②絨毛染色體數(shù)目異常患者的年齡[(32.14±5.21) 歲]與染色體數(shù)目正?；颊叩哪挲g[(29.49±4.07)歲]比較，差異有統(tǒng)計學意義(u=2.145，P< 0.05)。③流產(chǎn)次數(shù) 2 次及以上的染色體數(shù)目異常發(fā)生率(44.8%) 高于流產(chǎn)次數(shù)為 1 次的發(fā)生率(25.4%)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=6.19，P< 0.05)。結(jié)論 染色體數(shù)目異常是胚胎停育的重要發(fā)病因素，其中常染色體三體最多見；對2 次及以上的流產(chǎn)患者，更應(yīng)關(guān)注是否有染色體異常的發(fā)生。

胚胎停育；熒光原位雜交；染色體異常

胚胎停育指胚胎或胎兒已經(jīng)停止發(fā)育，部分或全部組織殘留于宮腔內(nèi)未排出，B超檢查表現(xiàn)為妊娠囊形態(tài)欠規(guī)則、無胎心搏動或表現(xiàn)為枯萎囊等。引起該病的因素很多，主要包括染色體異常、內(nèi)分泌異常、感染因素、免疫因素、環(huán)境因素等，其中染色體異常是胚胎停育的重要因素[1]。熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)技術(shù)是近年來興起的分子細胞遺傳生物學方法中的一種，應(yīng)用特殊熒光素標記的染色體DNA探針，對未培養(yǎng)的絨毛組織進行原位雜交，經(jīng)免疫顯色，能快速、準確地檢測染色體異常[2]。本文收集我院2012 年 5 月至2014年10 月婦產(chǎn)科診斷為過期流產(chǎn)住院治療的154例患者的FISH資料，分析不同年齡及流產(chǎn)次數(shù)的胚胎停育患者絨毛染色體數(shù)目異常情況，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 我院2012 年 5 月至2014年10 月婦產(chǎn)科診斷為過期流產(chǎn)住院治療的患者154例，年齡 19～39 歲[(29.77±4.41)歲]，終止妊娠的天數(shù)(68.07±18.35)天，均為單胎。

1.2 方法 所有患者手術(shù)終止妊娠中無菌取絨毛組織，用冷磷酸鹽緩沖液(PBS) 對絨毛組織標本進行認真沖洗，洗去污染的母血細胞。在倒置體視顯微鏡下用眼科鑷挑選絨毛組織，避免蛻膜組織的混入。視標本量的不同，用組織剪剪碎后用 0.075 mol/L KCl 低滲 30 分鐘，3∶1 液經(jīng)過預固定、固定后，沉淀在同一張載玻片上分別滴 3 個雜交區(qū)。處理后的薄片應(yīng)用北京金菩嘉試劑有限公司生產(chǎn)的 GLP16/22、GLP13/21、CSP18/X/Y 熒光探針進行熒光原位雜交實驗，觀察流產(chǎn)組織中染色體數(shù)目的異常改變。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用 SPSS 17.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)處理。計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用u檢驗；計數(shù)資料比較采用卡方檢驗。P< 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

154例胚胎停育患者染色體數(shù)目異常56例(36.4%)，其中常染色體三體40例(71.4%)，包括22-三體10例(17.9%)、16-三體14例(25.05)、21-三體8例(14.3%)、18-三5例(8.95)及13-三體3例(5.4%)；多倍體4例(7.1%)，45，XO 12例(21.4%)。

絨毛染色體數(shù)目異常患者的年齡[(32.14±5.21)歲]與染色體數(shù)目正常(98例)患者的年齡[(29.49±4.07)歲]比較，差異有統(tǒng)計學意義(u=2.145，P< 0.05) ；流產(chǎn)次數(shù)2次及以上的染色體數(shù)目異常發(fā)生率44.8%(39/87)，高于流產(chǎn)次數(shù)為 1 次的發(fā)生率25.3%(17/67)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=6.19，P< 0.05)。

3 討論

發(fā)生胚胎停育及自然流產(chǎn)的原因包括遺傳學因素、內(nèi)分泌因素、免疫因素及環(huán)境因素等。有研究表明，發(fā)生早期胚胎停育及自然流產(chǎn)的患者中胚胎染色體異常是導致流產(chǎn)的主要原因，發(fā)生率約占 50% 左右，而反復自然流產(chǎn)患者中胚胎染色體異常率高達 70.7%[3]。染色體核型分析技術(shù)可以準確檢出流產(chǎn)物或胎兒染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目的異常，是明確病因或產(chǎn)前診斷的金標準。但對于流產(chǎn)物組織在收集處理等過程中易受污染而導致培養(yǎng)失敗。FISH 技術(shù)的出現(xiàn)彌補了這些缺陷。

FISH 技術(shù)利用己知核酸序列作為探針，以熒光素直接標記或以非放射性物質(zhì)標記后與靶 DNA 進行雜交，在熒光顯微鏡下觀察雜交信號從而對標本中待測的核酸進行定性、定位和定量分析。本研究采用 FISH 技術(shù)對 154 例胚胎停育患者的絨毛染色體進行檢測，結(jié)果示 154 例患者的絨毛中，染色體數(shù)目異常共56例(36.4%)，提示染色體數(shù)目異常是胚胎停育的主要發(fā)病因素。有文獻報道，染色體數(shù)目異常的主要發(fā)生源自雙親之一的配子形成時或妊娠初期受精卵卵裂時出現(xiàn)染色體不分離，則導致該染色體增多或減少1 條，亦即導致三體性或單體性[4]。21-三體在活產(chǎn)兒中最常見，13-三體、18-三體也可見，而其他常染色體三體大多導致流產(chǎn)。性染色體的三體在活產(chǎn)兒可見，性染色體的單體性不僅見胚胎停育，也見于兒童或成人。

在本組資料胚胎停育絨毛染色體分析中，常染色體三體40例(71.4%) 是最多見的數(shù)目畸變，包括 13-三體、16-三體、18-三體、21-三體和22-三體，這也是造成人類胚胎低著床率和早期丟失的一個重要原因。文獻報道在自然流產(chǎn)絨毛中染色體異常的檢出率為 55% ～ 66%[5]。由于染色體數(shù)目異常，阻礙了胚胎的正常發(fā)育，大多數(shù)遭遇自然淘汰而流產(chǎn)，雖然少數(shù)染色體異?；純嚎梢宰阍路置?，但常常智力障礙。因此對停止發(fā)育的胚胎進行染色體檢查十分重要。本研究在胚胎停育患者絨毛染色體數(shù)目異常情況及其與患者年齡及流產(chǎn)次數(shù)之間的關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn)：絨毛染色體數(shù)目正常組與異常組在患者年齡方面差異有統(tǒng)計學意義，說明胚胎停育絨毛染色體數(shù)目異?？赡芘c孕婦年齡有關(guān)，年齡越大妊娠發(fā)生染色體異常的概率升高。本組資料表明，流產(chǎn)次數(shù)2 次及以上的染色體數(shù)目異常發(fā)生率高于流產(chǎn)次數(shù)為1 次的發(fā)生率，說明對有2 次及以上流產(chǎn)史的患者，染色體異常的發(fā)生率升高。

染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常是胚胎停育的主要原因，絨毛染色體檢查可對胚胎停育的原因及時作出判斷，由于胚胎停育是異常生命體自然淘汰的過程，因此胚胎絨毛的遺傳學檢查不僅能夠?qū)ε咛ネＳM行病因?qū)W診斷，同時為患者進行合理治療和再生育的優(yōu)生指導有重要意義。如患者要求再次妊娠，建議夫妻雙方對其自身染色體進行檢查，再次懷孕時加強孕期監(jiān)測，或生育正常兒概率偏低，建議通過輔助生殖技術(shù)植入前診斷得到健康的孩子。

[1] 王容，凡偉.稽留流產(chǎn)臨床相關(guān)因素的研究進展[J].中國婦幼保健，2013，28(8)：1366-1368.

[2] Norton ME，Brar H，Weiss J，et al.Non-invasive chromosomal evalua- tion(nice) study：results of a multicenter prospective cohort study for detection of fetal trisomy 21 and trisomy 18[J].Am J Obstet Gynecol，2012，207(2)：137.e1-e8.

[3] Ji Hyae Lim，Min Hyoung Kim，You Jung Han，et al.Cell-free fetal dna and cell-free total dna levels in spontaneous abortion with fetal chromosomal aneuploidy[J].PLoS One，2013，8(2)：e56787.

[4] 朱改變，張林愛，石秀文.稽留流產(chǎn)患者118例絨毛染色體及熒光原位雜交技術(shù)檢測結(jié)果分析[J].中國藥物與臨床，2014，6(1)：818-820.

[5] 廖梅旭.胚胎碎片的形成機制和影響因素[J].實用醫(yī)院臨床雜志，2012，9(2)：161-164.

Chorionic villus karyotyping in 154 embryo arrest cases with a FISH technique

MATao，YUEJun，LINHe，XIELan

(DepartmentofGynecologyandObstetrics，SichuanAcademyofMedicalSciences&SichuanProvincialPeople’sHospital，Chengdu610072，China)

XIELan

Objective To investigate the relationship between embryo arrest and abnormal chorionic villus by using a fluorescence in situ hybridization(FISH) technique.Methods Chorionic villus karyotyping in 154 embryo arrest cases was conducted by using a FISH technique with specific immuno-fluorescent markers targeting chromosome No.13，16，18，21，22，X and Y.The associations of abnormal chromosome karotype with age of pregnancy and history of abortions were analyzed.Results ①Chromosomal abnormality was identified in 56 cases(36.4%)，in which 40 cases were antosomal triploid(71.4%)，4 cases were multiploid(7.1%) and 12 cases were 45，X0(21.4%).②Median age of the cases with chromosomal abnormality was(32.14±5.21) years old that was older than cases with normal chromosomes(29.49±4.07 years old)(u= 2.145，P< 0.05).Detection rate of chromosomal abnormality in cases with 2 or more abortions was 44.8% that was significantly higher than that in cases with only 1 abortion(25.4%)(χ2=6.19，P< 0.05).Conclusion Embryo chromosomal abnormality is a major cause of embryo arrest，in which antosomal triploid is the most common abnormality.It should pay attention to examine whether there is abnormal chromosome in cases with 2 or more abortions.

Embryo arrest； FISH； Chromosomal abnormality

謝 蘭

R173

A

1672-6170(2015)03-0042-02

2014-12-25；

2015-01-18)