質(zhì)譜技術(shù)在臨床微生物實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用進(jìn)展

韓志勇 劉媛媛

目前，在醫(yī)院臨床微生物實(shí)驗(yàn)室鑒定細(xì)菌主要依賴于傳統(tǒng)的生物化學(xué)反應(yīng)、分子生物學(xué)和形態(tài)學(xué)等方法，培養(yǎng)分純出單個(gè)細(xì)菌菌落的鑒定耗時(shí)長(zhǎng)，即使使用自動(dòng)化細(xì)菌鑒定儀器，在時(shí)間上還是不能滿足臨床對(duì)檢測(cè)結(jié)果時(shí)效性的要求；而基于分子生物學(xué)方法進(jìn)行微生物鑒定大大地提高了靈敏度和時(shí)效性，但對(duì)工作人員技術(shù)要求高，檢測(cè)成本高，只能針對(duì)某些特定菌株，還是難以滿足臨床常規(guī)要求。自80年代初，基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix assisted laser desorption ionization－time of flight－mass spectrometry，MALDI－TOF－MS）技術(shù)就已經(jīng)成為一個(gè)用于研究與分析蛋白質(zhì)特征的有利工具，以其操作簡(jiǎn)便、自動(dòng)化、快速、高通量等優(yōu)勢(shì)受到青睞，并開始應(yīng)用于醫(yī)院微生物實(shí)驗(yàn)室，成為了一種新的微生物鑒定方法。然而由于儀器昂貴，一次性投入成本高，MALDI－TOF－MS在國(guó)外臨床微生物實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用尚未普及，在國(guó)內(nèi)臨床微生物檢驗(yàn)中的應(yīng)用也剛剛起步。但是，MALDI－TOF－MS質(zhì)譜技術(shù)以其固有的優(yōu)勢(shì)進(jìn)入臨床微生物診斷，發(fā)展迅速，并預(yù)計(jì)在將來徹底改變微生物實(shí)驗(yàn)室的面貌。本文就國(guó)內(nèi)外對(duì)MALDI－TOF－MS技術(shù)用于臨床微生物鑒定臨床分離菌株及細(xì)菌耐藥性研究的最新進(jìn)展做一綜述。

1 MALDI－TOF－MS 技術(shù)

MALDI－TOF－MS分析法是通過對(duì)被測(cè)樣品離子質(zhì)荷比的測(cè)定來進(jìn)行分析的一種分析方法，其基本原理是使樣品中的分析物在離子源中發(fā)生電離，生成不同質(zhì)荷比的帶電荷的離子，經(jīng)加速電場(chǎng)的作用，形成離子束，進(jìn)入質(zhì)量分析器。質(zhì)量分析器將同時(shí)進(jìn)入其中的不同質(zhì)量的離子按質(zhì)荷比大小分離。分離后的離子依次進(jìn)入離子檢測(cè)器，采集放大離子信號(hào)，經(jīng)計(jì)算機(jī)處理，繪制成質(zhì)譜圖。這些原理使MALDI－TOFMS能完成多種成分（包括蛋白質(zhì)、脂類、脂多糖和脂寡糖、DNA、多肽及其他能被離子化的分子）的分析［1，2］。同時(shí)具有樣本制備方便、實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、數(shù)據(jù)庫可不斷擴(kuò)展等優(yōu)點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)樣本微量化、高通量檢測(cè)和結(jié)果自動(dòng)分析，檢測(cè)過程從上樣到結(jié)果報(bào)告可在數(shù)分鐘內(nèi)完成。

2 在臨床微生物細(xì)菌鑒定中的應(yīng)用

2.1 細(xì)菌鑒定 近年來，用MALDI－TOF－MS鑒定細(xì)菌的報(bào)道不斷增加，由于分析所需細(xì)菌的樣本量小，只需要將菌株培養(yǎng)24 h后就可分析，分析每個(gè)樣本孔需1 min左右的時(shí)間，顯示出這一技術(shù)在臨床病原菌鑒定中廣闊的應(yīng)用前景。2010年，Bizzini等［3］對(duì)使用 MALDI－TOF－MS 方法和傳統(tǒng)方法鑒定臨床分離細(xì)菌進(jìn)行了比較，用MALDI－TOF－MS鑒定1371株已用傳統(tǒng)方法鑒定完成的臨床分離株，其中1278株（93.2%）可以鑒定到種的水平，73 株（5.3%）可以鑒定到屬的水平，不能夠準(zhǔn)確鑒定的有20株（1.5%）；在被鑒定到種的水平的1278株菌中，有63（4.9%）株的鑒定結(jié)果與傳統(tǒng)方法的鑒定結(jié)果不一致，其中絕大多數(shù)（42／63）不一致的結(jié)果是由系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫相關(guān)分類的差異造成的，14株是由質(zhì)譜儀的分辨率較低造成的，另外的7株是由于傳統(tǒng)方法的鑒定錯(cuò)誤。van Veen等［4］也對(duì)980株臨床分離細(xì)菌進(jìn)行了前瞻性實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果表明MALDI－TOF－MS對(duì)菌株進(jìn)行鑒定的準(zhǔn)確性要高于傳統(tǒng)的生化方法（92.2%和83.1%）。MALDI－TOF－MS 可以準(zhǔn)確鑒定 97.7%的腸桿菌科，92.0%發(fā)酵型革蘭陰性桿菌，94.3%的葡萄球菌，84.8%的鏈球菌及 85.2%的酵母菌。

隨著研究不斷深入，各種細(xì)菌的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫逐步完善。目前，已經(jīng)有經(jīng)食品藥品監(jiān)督管理局和國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的質(zhì)譜儀及相應(yīng)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，可覆蓋包括革蘭陰性菌、革蘭陽性菌等臨床常見細(xì)菌以及真菌的不同菌屬及菌種。2011年，Benagli等［5］用 MALDI－TOF－MS與Phoenix、API和16SrDNA序列分析方法對(duì)1019株菌進(jìn)行比較研究，證明加德納菌、屎腸球菌和糞腸球菌等與其他常規(guī)方法的鑒定一致率分別為 97.4%、100.0%和100.0%，其結(jié)果與16SrDNA 序列分析幾乎完全吻合。但是鶉雞腸球菌和鏈球菌屬的鑒定一致率較低，分別為 44.4%和78.9%。國(guó)內(nèi)鮑春梅等［6］用 MALDI－TOF－MS鑒定27個(gè)菌屬和73個(gè)菌種共計(jì)1665株革蘭陰性菌，在屬和種水平上與Vitek2鑒定結(jié)果的符合率埃希菌屬為99%和99%，克雷伯菌屬為95%和90%，假單胞菌屬為94%和89%，沙雷菌屬為93%和88%，腸桿菌屬為93%和73%，并將細(xì)菌鑒定時(shí)間由16－18 h縮短到3－5 min。而鑒定氣單胞菌、弧菌和沙門菌在種的水平結(jié)果不理想，符合率僅為37%、27%和0%。

呂佳等［7］研究發(fā)現(xiàn)直接涂抹法雖操作簡(jiǎn)便，可重復(fù)性好，但相對(duì)而言，其質(zhì)譜峰的質(zhì)量易受涂抹均勻性、雜質(zhì)（如脂質(zhì)和多糖）峰等背景峰干擾，造成信噪比降低，直接影響鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。提取法能有效提取細(xì)菌表面蛋白，降低背景峰干擾，信噪比良好，是值得推薦使用的處理方法。

MALDI－TOF－MS技術(shù)對(duì)有些微生物，如鏈球菌屬和嗜麥芽窄食單胞菌的鑒定不盡如人意，可能與細(xì)菌之間的親緣關(guān)系相近或特殊蛋白指紋圖譜峰的特征性不明顯有關(guān)，需要在實(shí)際臨床應(yīng)用中不斷探索［4］。

2.2 真菌鑒定 采用MALDI－TOF－MS技術(shù)對(duì)真菌進(jìn)行檢測(cè)的研究相對(duì)較晚。2000年，Welham 等［8］首次對(duì) MALDI－TOFMS技術(shù)在青霉菌、小柱孢菌和紅色毛癬菌等真菌檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)行了初步研究。之后很多學(xué)者對(duì)MALDI－TOF－MS在致病性酵母菌和絲狀真菌檢測(cè)中的準(zhǔn)確性、檢測(cè)條件以及應(yīng)用范圍等方面進(jìn)行了更為深入地研究。

2011年，Putignani等［9］對(duì) 303 株臨床分離的酵母菌和酵母樣菌采用MALDI－TOF－MS進(jìn)行檢測(cè)，與傳統(tǒng)方法鑒定的符合率為84.8%，經(jīng)基因分型校正后，鑒定準(zhǔn)確率為91.7%，其中20株由于數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)缺乏而未得到鑒定。2012年，Seyfarth 等［10］采用 MALDI－TOF－MS與API系統(tǒng)兩種方法檢測(cè)83株酵母菌，二者準(zhǔn)確率分別達(dá)到94.0%和84.3%，而MALDI－TOF－MS參考數(shù)據(jù)庫的更新較API系統(tǒng)要方便許多。McTaggart等［11］對(duì) 160株酵母菌（包括137株隱球菌和23株非隱球菌）進(jìn)行了MALDI－TOF－MS檢測(cè)，鑒定到種水平的準(zhǔn)確率為100%，而新生隱球菌鑒定到亞種水平的準(zhǔn)確度也高達(dá) 98.8%（85／86）。2012年，F(xiàn)iracative 等［12］利用 MALDI－TOFMS技術(shù)對(duì)164株新生隱球菌和格特隱球菌進(jìn)行檢測(cè)，能夠100% 準(zhǔn)確鑒定到種，而且能夠區(qū)分8個(gè)主要的分子類型。

2012年，國(guó)內(nèi)靳穎等［13］對(duì) MALDI－TOF－MS 鑒定臨床常見的酵母菌株進(jìn)行了評(píng)價(jià)，目的是確定其是否適合酵母菌的快速鑒定。實(shí)驗(yàn)中MALDI－TOF－MS對(duì)150株臨床酵母菌在屬的水平上100%可以被正確鑒定出來，在種的水平上的鑒定符合率為94%。

張明新等［14］對(duì)60株臨床分離的酵母菌研究時(shí)，用MALDI－TOF－MS鑒定的結(jié)果與Vitek compact全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)比對(duì)，鑒定符合率為95%（57／60），他們認(rèn)為質(zhì)譜分析前準(zhǔn)備階段是鑒定的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其中培養(yǎng)條件和菌落處理溶劑是重要影響因素。

MALDI－TOF－MS在絲狀真菌檢測(cè)中的應(yīng)用由于絲狀真菌具有多種形態(tài)如菌絲、分生孢子等，使得蛋白質(zhì)譜可能會(huì)因真菌的生長(zhǎng)狀況和樣本部位的不同而發(fā)生變化，因此MALDI－TOF－MS對(duì)絲狀真菌的檢測(cè)相對(duì)落后于細(xì)菌和酵母菌，但近年來亦有不少學(xué)者對(duì)此進(jìn)行了從基礎(chǔ)到臨床應(yīng)用方面的研究。Alshawa等［15］對(duì)360株臨床分離的皮膚癬菌和21株小柱孢屬菌進(jìn)行MALDI－TOF－MS檢測(cè)，鑒定到種的準(zhǔn)確率分別為 91.9%（331／360）和85.7%（18／21），27 株皮膚癬菌和3株小柱孢屬菌沒有得到鑒定是因?yàn)闆]有獲得質(zhì)譜信號(hào)，而只有2株（0.5%）皮膚癬菌鑒定錯(cuò)誤。

2.3 厭氧菌鑒定 厭氧菌感染常見于臨床深部組織及血液感染，隨著臨床對(duì)厭氧菌感染的日益重視以及細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)的提高，其培養(yǎng)陽性率也逐漸提高。厭氧菌對(duì)培養(yǎng)條件及鑒定條件要求苛刻。傳統(tǒng)生化鑒定技術(shù)易受到環(huán)境影響，且鑒定周期長(zhǎng)，已不能滿足臨床實(shí)驗(yàn)室快速準(zhǔn)確鑒定厭氧菌的需求。厭氧菌16SrRNA基因序列法雖然有快速、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，但操作復(fù)雜、成本較高，不適合作為臨床實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目開展。MALDI－TOF－MS是一種新型的軟電離生物質(zhì)譜，具有靈敏、準(zhǔn)確、分辨率高的特點(diǎn)，而且操作簡(jiǎn)單、成本低廉，可高通量檢查樣本，為臨床微生物檢驗(yàn)提供了一種新型的有效手段。

2014年，袁梁等［16］對(duì) 56 株厭氧菌的研究表明，MALDITOF－MS與16SrRNA基因序列法鑒定的符合率為94.6%；傳統(tǒng)生化Vitek32 ANI鑒定卡與16SrRNA基因序列法鑒定結(jié)果的符合率為80.4%。MALDI－TOF－MS技術(shù)鑒定的符合率高于傳統(tǒng)生化鑒定技術(shù)。MALDI－TOF－MS儀器操作簡(jiǎn)單，即使批量鑒定也可在1－2 h完成，16SrRNA基因序列法至少需要4－6 h才能完成一個(gè)檢測(cè)周期，而Vitek32 ANI鑒定卡則需要24－72 h才能獲得結(jié)果。在快速檢測(cè)與高通量檢測(cè)方面，MALDI－TOF－MS 優(yōu)勢(shì)明顯，而且 MALDI－TOF－MS 所使用試劑價(jià)格低廉，成本也具有一定優(yōu)勢(shì)。該研究中，4株厭氧菌的鑒定結(jié)果分值小于 1.7 的占 7.1%（4／56），其中 3 株的結(jié)果與16SrRNA基因序列法的鑒定結(jié)果不一致。有學(xué)者［4］認(rèn)為這與Biotyper軟件數(shù)據(jù)庫不完善有關(guān)，Biotyper 3.0軟件包含212種厭氧菌質(zhì)譜數(shù)據(jù)，涵蓋大部分臨床常見厭氧菌，但如果希望進(jìn)一步提高鑒定成功率及擴(kuò)大使用范圍，仍需完善MALDI－TOF－MS 的數(shù)據(jù)庫。

2.4 血液及體液標(biāo)本的培養(yǎng)鑒定 部分研究人員對(duì)MALDI－TOF－MS檢測(cè)血培養(yǎng)中病原菌的方法學(xué)進(jìn)行了評(píng)價(jià)。盡管研究者們使用了不同的血培養(yǎng)系統(tǒng)，但尚無證據(jù)表明血培養(yǎng)系統(tǒng)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。2009年，在1項(xiàng)為期5個(gè)月的回顧性研究中，研究者［17］對(duì)584份陽性血培養(yǎng)標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，其中562份為單一菌感染，22份為混合菌感染。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示可鑒定94%的革蘭陰性桿菌，但只能鑒定67%的革蘭陽性球菌，尤其是鏈球菌無法鑒定。通過比較不同的溶劑，發(fā)現(xiàn)使用乙腈作為前處理的溶劑不利于革蘭陽性球菌的鑒定。另一項(xiàng)為期 9 w 的研究［18］發(fā)現(xiàn)，122 份陽性血培養(yǎng)標(biāo)本中，98.55%的標(biāo)本可鑒定至種屬水平，發(fā)生鑒定錯(cuò)誤的細(xì)菌主要見于鏈球菌和葡萄球菌。10株肺炎鏈球菌中有8株無法鑒定，2株雖可鑒定至種，但其所獲鑒定評(píng)分較低（1.7～2）。

通過上述研究可見，MALDI－TOF－MS快速、可靠，但對(duì)肺炎鏈球菌的鑒定尚存在一定困難，必須用其他方法確認(rèn)。如使用鏈球菌膠乳凝集試劑可成功地將肺炎鏈球菌與緩癥鏈球菌區(qū)分。

Lee 等［19］用 MALDI－TOF－MS 直接對(duì)尿液樣本鑒定腐生葡萄球菌，并與目前通用的鑒定系統(tǒng)包括BD公司的Phoenix鑒定儀、梅里埃公司的Vitek2鑒定儀和MicroScan鑒定系統(tǒng)進(jìn)行比較。通過16SrRNA和rpoB基因測(cè)序確定，鑒定正確率分別為 100%、86.7%、86.7%和93.3%。

Ferreira 等［20］用 MALDI－TOF－MS 聯(lián)合 UF－1000I流式細(xì)胞儀直接對(duì)220份細(xì)菌含量大于105 CFU／mL的尿路感染標(biāo)本進(jìn)行細(xì)菌鑒定，結(jié)果對(duì)最常引起尿路感染的大腸埃希菌在種的水平上的鑒定正確率分別為91.8%和92.7%。該研究表明，當(dāng)患者為單一菌感染且菌落計(jì)數(shù)達(dá)105 CFU／mL時(shí)，MALDI－TOF－MS的種屬鑒定準(zhǔn)確率可以達(dá)到90%以上，而對(duì)于混合性細(xì)菌感染尿液標(biāo)本的鑒定，其鑒定正確率會(huì)大大降低。

盡管 Nyvang 等［21］報(bào)道了用 MALDI－TOF－MS 在 30 min內(nèi)快速鑒定出1例患者腦脊液標(biāo)本中肺炎鏈球菌的結(jié)果，然而目前該技術(shù)對(duì)胸水、腹水、腦脊液、膿液等標(biāo)本的直接檢測(cè)的相關(guān)報(bào)道還比較少，應(yīng)用于這些無菌部位體液中病原的直接鑒定還有待于進(jìn)一步探索。

3 在耐藥性篩查中的應(yīng)用

MALDI－TOF－MS對(duì)耐藥細(xì)菌的檢測(cè)潛能正在被逐漸挖掘。多數(shù)研究采用以下方法：①尋找耐藥菌株與敏感菌株間的特征性蛋白和圖譜峰；②通過耐藥菌株與抗生素共培養(yǎng)，然后檢測(cè)分解產(chǎn)物。2000年，Edwards等［22］在對(duì)金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）的耐藥研究中發(fā)現(xiàn)，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin－resistant Staphylococcus aureus，MRSA）的質(zhì)譜圖中多個(gè)峰值（82～209）顯著高于甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌（methicillin sensitive Staphylococcus aureus，MSSA）（37～67）的峰值，且 MRSA和MSSA 都有各自的特征峰，MRSA菌株蛋白質(zhì)指紋圖譜特征峰主要位于500～2000 質(zhì)荷比的小分子量范圍內(nèi)。2006年，Majcherczyk 等［23］研究顯示，MALDI－TOF－MS能夠區(qū)分基因型相同的不同耐藥性菌株，主要就是根據(jù)不同耐藥性菌株所具有不同的特征性圖譜。Wolters等［24］對(duì)MRSA中的青霉素結(jié)合蛋白PBP2a檢測(cè)的研究結(jié)果表明，通過尋找耐藥菌株的特征性蛋白也可以確定耐藥菌，以及迅速確認(rèn)SA中的甲氧西林耐藥表型。MALDI－TOF－MS用于檢測(cè)產(chǎn)β－內(nèi)酰胺酶和碳青霉烯酶的耐藥菌，通過耐藥菌株與酶抑制劑抗生素共培養(yǎng)1－3 h，產(chǎn)生足以被質(zhì)譜儀檢測(cè)到的酶切產(chǎn)物，然后檢測(cè)分解產(chǎn)物，從而間接證明耐藥酶的存在。采用此方法已成功檢測(cè)到對(duì)氨芐西林、哌拉西林、頭孢曲松和頭孢他啶耐藥的腸桿菌科細(xì)菌及產(chǎn)NDM－1、VIM－1、KPC、OXA－48和OXA－162 型碳青霉烯酶的細(xì)菌［25］。

2003年，國(guó)內(nèi)杜宗敏等［26］研究發(fā)現(xiàn)，在76株試驗(yàn)菌株中有7株菌株鑒定結(jié)果與聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)果不符，進(jìn)一步的表型耐藥性鑒定表明，有2株為甲氧苯青霉素耐藥株，其他5株為敏感株。mecA陰性的金黃色葡萄球菌也可以表現(xiàn)出耐藥表型。這可能是由于青霉素結(jié)合蛋白的基因有突變，或是β－內(nèi)酰胺酶過度表達(dá)，導(dǎo)致SA對(duì)甲氧苯青霉素耐藥的特點(diǎn)呈不均一性，另外，培養(yǎng)條件和所使用的抗生素濃度和種類都會(huì)影響到耐藥性的表型。耐藥性實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)條件和MALDI－TOF－MS鑒定時(shí)所使用的培養(yǎng)條件不同，可能會(huì)導(dǎo)致耐藥性表型的不同表現(xiàn)。

石桂英等［27］發(fā)現(xiàn)，MALDI－TOF－MS 對(duì)不同細(xì)菌耐藥性檢測(cè)能力不同，對(duì)葡萄球菌可有效鑒別其耐藥株與標(biāo)準(zhǔn)株，而對(duì)革蘭陰性桿菌尤其是腸桿菌的檢測(cè)效果較差。MALDITOF－MS將為葡萄球菌屬細(xì)菌耐藥性檢測(cè)提供一種快速鑒定方法。此外，葡萄球菌屬細(xì)菌耐藥株與標(biāo)準(zhǔn)株表面成分的差異還需進(jìn)一步研究。

2013年，王利君等［28］以125株泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌及110株碳青霉烯類敏感鮑曼不動(dòng)桿菌為研究對(duì)象，應(yīng)用質(zhì)譜儀的ClinProTool軟件分析各個(gè)峰的ROC曲線顯示358質(zhì)荷比質(zhì)譜峰與380質(zhì)荷比質(zhì)譜峰的ROC曲線下面積均為0.99，表明無論不完全水解的質(zhì)譜圖多么復(fù)雜，只要水解反應(yīng)后出現(xiàn)了質(zhì)譜峰358質(zhì)荷比與380質(zhì)荷比，即可判斷鮑曼不動(dòng)桿菌產(chǎn)OXA－23，此時(shí)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析也顯示檢測(cè)靈敏度及特異度均為100%。通過此方法能快速準(zhǔn)確地檢測(cè)產(chǎn)OXA－23鮑曼不動(dòng)桿菌，從而快速檢測(cè)不動(dòng)桿菌的碳青霉烯酶。

綜上所述，在早期和現(xiàn)階段的研究中，MALDI－TOF－MS不能正確地鑒定菌株是因?yàn)閿?shù)據(jù)庫中標(biāo)準(zhǔn)菌株的圖譜有限，質(zhì)譜峰數(shù)據(jù)不充分導(dǎo)致得分較低，以及細(xì)菌庫中沒有這些菌株，而通過國(guó)內(nèi)外不斷研究補(bǔ)充數(shù)據(jù)庫后，所有的分離株將逐步被明確地鑒定出來。MALDI－TOF－MS技術(shù)具有快速、準(zhǔn)確、高通量的特點(diǎn)，隨著國(guó)內(nèi)外臨床實(shí)驗(yàn)室的廣泛應(yīng)用及數(shù)據(jù)庫的進(jìn)一步完善，必將在微生物鑒定、分型、耐藥監(jiān)測(cè)等多方面發(fā)揮更大作用。

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