辛伐他汀通過(guò)抑制RhoA/Rho激酶活性預(yù)防冠狀動(dòng)脈痙攣機(jī)制研究

劉驊增 謝蓮娜

冠脈痙攣可引起變異型心絞痛、不穩(wěn)定型心絞痛、急性心肌梗死等缺血性心臟病，其中，血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙及血管平滑肌細(xì)胞收縮反應(yīng)增強(qiáng)被認(rèn)為是冠脈痙攣的主要機(jī)制。RhoA/Rho激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是血管平滑肌細(xì)胞鈣離子敏感性的主要調(diào)節(jié)機(jī)制，其參與血管痙攣、動(dòng)脈硬化及缺血再灌注損傷的病理生理過(guò)程，具有緩解血管平滑肌痙攣及改善內(nèi)皮功能的作用，已經(jīng)成為心血管病治療的新靶點(diǎn)。他汀類藥物是一種Rho激酶抑制劑，除降膽固醇作用外，還具有抑制炎性反應(yīng)、改善內(nèi)皮功能、抗氧化等作用［1，2］。本研究探討辛伐他汀改善大鼠冠脈痙攣的作用機(jī)制，為拓展冠脈痙攣治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 40只12周齡Wistar大鼠(體重250～300 g)隨機(jī)分為4組(n=10):對(duì)照組、辛伐他汀組、Rho激酶抑制劑(法舒地爾)組和聯(lián)合用藥組(辛伐他汀+法舒地爾組)。所有大鼠實(shí)驗(yàn)前置于室溫18～22℃、濕度60% ～70%、通風(fēng)良好的清潔飼養(yǎng)室內(nèi)飼養(yǎng)1周。

1.2 動(dòng)物給藥及冠脈痙攣模型構(gòu)建 所有動(dòng)物在冠脈痙攣模型構(gòu)建前分為以下4組進(jìn)行給藥處理:空白對(duì)照組:不用藥;他汀組:5 mg·kg－1·d－1辛伐他汀灌胃;Rho激酶抑制劑組:15 mg·kg－1·d－1法舒地爾腹腔注射;聯(lián)合用藥組:5 mg·kg－1·d－1辛伐他汀灌胃+15 mg·kg－1·d－1法舒地爾腹腔注射，所有用藥連續(xù)7 d。第8天，將大鼠仰臥固定在鼠板上，麻醉采用腹腔注射麻醉，按照40 mg/kg給予1%戊巴比妥鈉進(jìn)行腹腔注射。動(dòng)物麻醉后，連接體表心電圖，然后分別從大鼠尾動(dòng)脈注射0.1 U/kg精氨酸加壓素(AVP)，用以制備冠脈痙攣模型。之后持續(xù)監(jiān)測(cè)心電圖變化，觀察心電圖S-T段變化;如果空白對(duì)照組S-T段持續(xù)偏移，則提示冠脈痙攣模型制作成功，如果藥物處理組S-T段不出現(xiàn)明顯偏移，則提示藥物發(fā)揮預(yù)防作用。

1.3 RhoA/Rho激酶活性的測(cè)定 所有大鼠采用大劑量苯巴比妥鈉處死，放血開(kāi)胸暴露心包，迅速取出心臟，將標(biāo)本制成勻漿，冰浴、離心，取上清液在液氮中速凍后置于－80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。然后采用?shí)時(shí)熒光定量PCR分析Rho激酶基因在冠脈痙攣大鼠用辛伐他汀和法舒地爾處理后的相對(duì)表達(dá)量。采用Western blot檢測(cè) RhoA、GTP-RhoA、肌球蛋白磷酸酶靶亞基(MYPT1)和磷酸化MYPT1(p-MYPT1)蛋白的表達(dá)，并計(jì)算RhoA蛋白的相對(duì)活性和Rho激酶的相對(duì)活性。計(jì)算公式:RhoA蛋白的相對(duì)活性=GTP－RhoA蛋白表達(dá)量/總RhoA蛋白表達(dá)量;Rho激酶的相對(duì)活性=p－MYPT1蛋白表達(dá)量/MYPT1蛋白表達(dá)量。Realtime PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)QIAGEN公司;RhoA活性檢測(cè)應(yīng)用RhoA活性分析試劑盒(NewEast Biosciences，美國(guó))進(jìn)行，試劑盒內(nèi)含anti-GTP-RhoA和anti-RhoA抗體;anti-MYPT1和anti-p-MYPT1抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。引物序列見(jiàn)表1。

表1 PCR引物序列表

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，兩樣本均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較用單因素方差分析檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 辛伐他汀保護(hù)大鼠心臟功能 在誘導(dǎo)大鼠冠脈痙攣后，心電圖監(jiān)測(cè)結(jié)果在空白對(duì)照組，S-T壓低，上下均偏移超過(guò)0.9 mV;在他汀組，大鼠心肌功能所受影響不大，S-T壓有輕微的偏移，結(jié)果與Rho激酶抑制劑組相似;聯(lián)合用藥組，S-T段接近于等電位線，無(wú)明顯偏移，提示聯(lián)合辛伐他汀和法舒地爾可有效預(yù)防大鼠心臟功能。見(jiàn)圖1。

圖1 大鼠冠脈痙攣模型誘導(dǎo)后心電圖改變情況

2.2 Rho激酶mRNA相對(duì)表達(dá)量 大鼠心臟組織用于提總RNA，real-time PCR檢測(cè)Rho激酶mRNA相對(duì)表達(dá)量。他汀組中Rho激酶基因表達(dá)有一定程度下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);Rho激酶抑制劑組中Rho激酶基因表達(dá)顯著下降，與空白對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但與他汀組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);聯(lián)合用藥組Rho激酶基因表達(dá)顯著減少(P＜0.05)。提示聯(lián)合辛伐他汀和法舒地爾可有效降低Rho激酶基因的表達(dá)，可能與辛伐他汀能預(yù)防大鼠冠脈痙攣相關(guān)。見(jiàn)表2。

表2 大鼠用藥后Rho激酶mRNA相對(duì)表達(dá)量 ±s

表2 大鼠用藥后Rho激酶mRNA相對(duì)表達(dá)量 ±s

注:與空白對(duì)照組比較，*P ＜0.05

組別 Rho激酶mRNA 相對(duì)表達(dá)量空白對(duì)照組1.00 ±0.00他汀組 0.81 ±0.04 Rho激酶抑制劑組 0.43 ±0.03*聯(lián)合用藥組 0.37 ±0.03*

2.3 RhoA蛋白活性和Rho激酶活性 大鼠心臟組織用于提總蛋白，RhoA活性分析試劑盒檢測(cè)RhoA蛋白的相對(duì)活性，Western blot檢測(cè)Rho激酶的相對(duì)活性。他汀組和Rho激酶抑制劑組中RhoA蛋白的相對(duì)活性和Rho激酶的相對(duì)活性均有一定程度下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);但在聯(lián)合用藥組，RhoA蛋白的相對(duì)活性和Rho激酶的相對(duì)活性均顯著下降(P＜0.05)，提示兩種藥物可協(xié)同作用抑制RhoA/Rho激酶活性，來(lái)治療冠脈痙攣大鼠模型。由于Rho激酶的活性是通過(guò)其特異性下游底物MYPT1的磷酸化程度來(lái)檢測(cè)的，Western blot結(jié)果也可見(jiàn)p-MYPT1表達(dá)在聯(lián)合用藥組顯著下降。見(jiàn)表3、圖2。

表3 RhoA蛋白和Rho激酶的相對(duì)活性n=10，±s

表3 RhoA蛋白和Rho激酶的相對(duì)活性n=10，±s

注:與聯(lián)合用藥組比較，*P ＜0.05

組別 RhoA蛋白相對(duì)活性 Rho 激酶相對(duì)活性他汀組 0.75 ±0.19* 0.68 ±0.16*Rho激酶抑制劑組 0.71 ±0.11* 0.50 ±0.13*聯(lián)合用藥組0.52 ±0.13 0.40 ±0.17

圖2 Western blot檢測(cè)p-MYPT1和MYPT1蛋白的表達(dá)

3 討論

研究表明，他汀類藥物具有降脂、抑制炎性反應(yīng)、改善內(nèi)皮功能、抗氧化等多種生理作用，其多效性與RhoA/Rho激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)系密切［3］。RhoA是類異戊二烯介質(zhì)的主要靶點(diǎn)，他汀類藥物通過(guò)抑制類異戊二烯的生成而影響Rho的膜定位功能及其對(duì)下游效應(yīng)分子Rho激酶的激活作用［3，4］。已知Rho蛋白是小GTP結(jié)合蛋白，控制多重生物信號(hào)途徑，在血管平滑肌細(xì)胞的增殖、細(xì)胞形態(tài)的維持、平滑肌的細(xì)胞收縮、細(xì)胞的黏附以及血小板集聚方面發(fā)揮著重要作用。Rho激酶是一種分子量約為160 kD的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。Rho激酶有ROCK1和ROCK2兩種異構(gòu)體;Rho激酶主要存在于細(xì)胞漿及細(xì)胞核，是調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的重要激酶之一，Rho激酶的過(guò)度激活或高表達(dá)均可引起疾病的產(chǎn)生［5，6］。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在大鼠冠脈痙攣模型中Rho激酶活性會(huì)增高，表明模型構(gòu)建成功。

已知Rho激酶抑制劑鹽酸法舒地爾是一種新型異喹啉磺胺衍生物，可以有效緩解腦血管痙攣，最初主要應(yīng)用于腦血管疾病。近年來(lái)，其相關(guān)研究不斷深入，其臨床應(yīng)用不斷拓展，也被認(rèn)為是一種新型高效的心血管保護(hù)藥物［7］。本研究在建立大鼠冠狀動(dòng)脈痙攣動(dòng)物模型前采用辛伐他汀、法舒地爾以及聯(lián)合辛伐他汀和法舒地爾處理大鼠，以期通過(guò)藥物預(yù)防大鼠冠脈痙攣，結(jié)果發(fā)現(xiàn)辛伐他汀在改變RhoA蛋白的相對(duì)活性、Rho激酶的相對(duì)活性等方面，其作用效果與法舒地爾組相當(dāng)，進(jìn)一步研究顯示，二者聯(lián)合用藥加強(qiáng)了對(duì)Rho激酶的抑制作用，提示他汀類藥物能夠有效預(yù)防冠脈的痙攣，可明顯改善缺血心肌的血供，并提高運(yùn)動(dòng)耐力，從而有效降低心臟事件的發(fā)生率，與相關(guān)研究結(jié)果［8－10］一致。

綜上所述，辛伐他汀具有預(yù)防冠脈痙攣的作用，并且通過(guò)抑制RhoA/Rho激酶活性而作用的，其可能在防治冠脈痙攣方面具有重要的作用。但目前在臨床實(shí)踐中他汀類藥物具有預(yù)防冠脈痙攣的作用尚沒(méi)有得到廣泛的認(rèn)可，相關(guān)的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步做深入的研究，相信隨著對(duì)其研究的不斷深入，為拓展冠脈痙攣的治療提供新的思路。

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