FoxM1、Cep55和c-Myc蛋白在基底細胞樣乳腺癌中的表達及臨床意義

馬秋雙 周炳娟 張金庫 趙文明 趙亞飛

基底細胞樣乳腺癌(basal-like breast carcinoma，BLBC)是指具有基底細胞基因表型并伴有不同程度基底細胞角蛋白和(或)肌上皮標記物表達的乳腺癌。BLBC約占全部乳腺癌的8%～20%，具有獨特的組織形態(tài)特點、易發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移、對傳統(tǒng)的內(nèi)分泌治療無效、無病生存期與總體生存率均較其他類型的乳腺癌差［1］。目前，對于BLBC的發(fā)病機制及影響預后的相關因素尚不清楚。癌癥發(fā)生重要的環(huán)節(jié)之一是對轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)，本研究通過免疫組化方法檢測細胞周期中重要的轉(zhuǎn)錄因子FoxM1及其下游基因Cep55在BLBC中的表達情況，以探討其在BLBC發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集保定市第一中心醫(yī)院病理科2007至2012年手術(shù)及會診的乳腺癌存檔蠟塊450例，全部標本均經(jīng)病理證實。所有乳腺癌患者均為女性，術(shù)前均未行新輔助化療和放射治療。標本均常規(guī)取材，10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片。根據(jù)目前公認的BLBC的免疫表型診斷標準［ER/PR、HER-2陰性，CK5/6 和(或)EGFR 陽性］，篩選出BLBC病例66例［年齡24～71歲，平均年齡(48±12)歲］及癌旁正常癌旁乳腺組織(距腫瘤邊緣5 cm)66例，NON-BLBC 70例［年齡22～85歲，平均(51±18)歲］。

1.2 試劑 兔抗人FoxM1多克隆抗體購自美國Abcam公司，兔抗人Cep55多克隆抗體購自北京博奧森公司，兔抗人c-Myc多克隆抗體，兔抗人ER、兔抗人PR、兔抗人HER2、鼠抗人 CK5/6、鼠抗人 EGFR、即用型快捷免疫組化MaxVisionTM檢測試劑盒和對氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒均購自福州邁新公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化:采用免疫組化方法(EnVision二步法)檢測BLBC、NON-BLBC及癌旁乳腺組織中FoxM1、Cep55的表達情況，所有操作步驟均依據(jù)產(chǎn)品說明書進行，采用檸檬酸修復液(pH值6.0)高溫高壓修復抗原，以FoxM1、Cep55及c-Myc陽性的胃癌組織作為陽性對照，以磷酸鹽緩沖液(PBS)替代一抗作為陰性對照，對氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木精復染，中性樹膠封固。

1.3.2 結(jié)果判定:FoxM1陽性表達顯示棕黃色均勻細顆粒位于細胞核，少量出現(xiàn)于胞漿，Cep55陽性表達顯示棕黃色均勻細顆粒位于細胞漿，c-Myc陽性表達棕黃色均勻細顆粒位于細胞核。免疫組化結(jié)果由兩位高年資病理醫(yī)師采用盲法高倍鏡下對每張切片隨機選擇5個視野，每個視野計數(shù)100個細胞，采用半定量計分方法，根據(jù)著色強度(A)和陽性細胞所占比例(B)兩者乘積來判定。(A)著色強度按下列標準評定記分:無色0分，淡棕色1分，棕黃色2分，棕褐色3分;(B)陽性細胞所占比例按下列標準評定記分:＜25%為1分，26% ～50%為2分，51% ～75%為3分，＞75%為4分。兩項得分相乘(A×B)，將結(jié)果分為4個等級:陰性(0～1分)、弱陽性(2～4分)、中度陽性(5～8分)、強陽性(9～12分)，＞2分視為陽性結(jié)果［2］。

1.4 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，F(xiàn)oxM1、Cep55及c-Myc蛋白的表達及其與BLBC的臨床病理因素的分析采用χ2檢驗，F(xiàn)oxM1、Cep55及c-Myc相關性分析采用spearman相關分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 FoxM1、Cep55及c-Myc蛋白在 BLBC和癌旁正常乳腺組織中的表達情況

2.1.1 FoxM1蛋白免疫組化的陽性表達顯示棕黃色均勻細顆粒，主要位于細胞核，少量出現(xiàn)于胞漿。FoxM1蛋白在BLBC、NON-BLBC及癌旁正常乳腺組織中的陽性表達率分別為77.3%(51/66)、60.0%(42/70)和13.6%(9/66)。BLBC中FoxM1蛋白的陽性表達率明顯高于NON-BLBC和正常組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。而基底細胞樣乳腺癌組與非基底細胞樣乳腺癌組相比，c-Myc的陽性率差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表1，圖 1。

圖1 FoxM1在BLBC中的陽性表達(IHC×100)

2.1.2 Cep55蛋白免疫組化的陽性表達顯示棕黃色均勻細顆粒，位于細胞漿。Cep55蛋白在BLBC、NONBLBC及癌旁正常乳腺組織中的陽性表達率分別為74.2%(49/66)、57.1%(40/70)和 16.7%(11/66)。BLBC中Cep55蛋白的陽性表達率明顯高于NONBLBC和正常組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。而基底細胞樣乳腺癌組與非基底細胞樣乳腺癌組相比，c-Myc的陽性率差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表1，圖2。

圖2 Cep55在BLBC中的陽性表達(IHC×100)

2.1.3 c-Myc蛋白免疫組化的陽性表達顯示棕黃色顆粒，主要位于細胞核。c-Myc蛋白在 BLBC、NONBLBC及癌旁正常乳腺組織中的陽性率分別為71.2%(47/66)、64.3%(45/70)和 22.7%(15/66)。BLBC中c-Myc的陽性率高于NON-BLBC和正常組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。而基底細胞樣乳腺癌組與非基底細胞樣乳腺癌組相比，c-Myc的陽性率差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表1，圖3。

表1 FoxM1、Cep55及c-Myc在3組中的表達情況 例(%)

圖3 c-Myc在BLBC中的陽性表達(IHC×100)

2.2 FoxM1、Cep55 及 c-Myc蛋白的關系

2.2.1 FoxM1蛋白與 Cep55蛋白在BLBC中的表達呈正相關關系(r=0.259，P＜0.05)。見表2。

表2 FoxM1、Cep55在BLBC中的表達關系 例

2.2.2 FoxM1蛋白與c-Myc蛋白在 BLBC中的表達呈正相關關系(r=0.294，P＜0.05)。見表3。

表3 FoxM1、c-Myc在BLBC中的表達關系 例

2.2.3 Spearman相關分析檢驗得出，Cep55蛋白與c-Myc蛋白在BLBC中的表達無相關性(r=0.221，P＞0.05)。見表4。

表4 c-Myc、Cep55在BLBC中的表達關系 例

2.3 FoxM1、Cep55及c-Myc蛋白的表達與 BLBC臨床病理因素的關系 FoxM1蛋白、Cep55蛋白及c-Myc在BLBC中的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(P＜0.05)，而與年齡、絕經(jīng)與否、腫瘤大小無關(P＞0.05)。見表5。

表5 FoxM1、Cep55及c-Myc的表達與BLBC臨床病理特征的關系

3 討論

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，嚴重影響著女性的生存及生活質(zhì)量，目前根據(jù)cDNA組織芯片基因表型將乳腺癌分為5種分子亞型，即管腔A型(luminal subtype A)、管腔B型(luminal subtype B)、正常乳腺樣型(normal breast-like subtype)、HER-2過表達型(HER-2 over-expression subtype)以及基底細胞樣型(basal-like subtype)［3］。作為新近發(fā)現(xiàn)的乳腺癌亞型，基底細胞樣乳腺癌以其獨特的組織學形態(tài)、較差的生物學行為越來越多的引起醫(yī)學界的關注，本研究采用免疫組化的方法初步探討了與BLBC發(fā)生、發(fā)展密切相關的因素，以期為BLBC尋找特異性的基因治療靶點提供理論依據(jù)。

轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是癌癥發(fā)生的一個重要方面，同時也是基因靶向治療的一個方向［4］。FoxM1是Forkhead Box(Fox)轉(zhuǎn)錄因子家族的重要成員之一，位于染色體12p13.3，全長約 25kb，具有 A、B、C3 個亞型［5］。FoxM1在多種惡性腫瘤組織中過表達，如胃癌［6］、胰腺癌［7］、肝癌［8］、大腸癌［9］和宮頸癌［10］等。其可能機制為參與細胞周期的調(diào)控，促進G1/S的過渡導致腫瘤細胞增殖［11］;調(diào)節(jié)VEGF的信號通路，促進腫瘤新生血管的形成［12］;激活參與 ECM 降解酶(如 MMPs)的轉(zhuǎn)錄促進腫瘤的浸潤與遷移［7］;參與并維持干細胞多能性等［13］。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxM1蛋白在BLBC中的陽性表達率明顯高于癌旁正常乳腺組織及NON-BLBC，提示FoxM1可能與BLBC的發(fā)生、發(fā)展有關，同時數(shù)據(jù)顯示FoxM1蛋白的表達與BLBC的TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關，表明FoxM1的過表達與BLBC的侵襲能力密切相關，可能是BLBC預后不良的原因之一。

中心體是哺乳動物細胞內(nèi)的微管組織中心，參與紡錘體的裝配，在胞質(zhì)分裂中起重要調(diào)控作用。最新發(fā)現(xiàn)的中心體相關蛋白Cep55(centrosomal protein，55 kD)屬于卷曲螺旋(coiled-coil)蛋白質(zhì)家族成員，其基因定位于人染色體 10q23.33［14，15］。該蛋白質(zhì)在多種正常組織及腫瘤細胞中均有表達。Cep55參與細胞周期中的中心體和中間體偶聯(lián)，被Erk2、Cdk1及Plk1共同磷酸化后發(fā)揮細胞周期調(diào)控作用［16］。本研究結(jié)果顯示，Cep55蛋白在BLBC中的陽性表達率明顯高于癌旁正常乳腺組織及NON-BLBC，同時，Cep55蛋白的表達與BLBC的TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關，提示Cep55蛋白的過表達可能參與BLBC的發(fā)生、發(fā)展。

Cep55是FoxM1的下游靶基因，與FoxM1共同參與調(diào)節(jié)細胞的分化、增殖、細胞凋亡以及維持干細胞多能性等生理過程［16］。Erk2是Ras-MAPK信號通路的信號分子，F(xiàn)oxM1使Ras-MAPK信號通路持續(xù)激活而影響Erk2的激活狀態(tài)，Erk2和Cdk1，Plk1在細胞周期中可依次將Cep55蛋白的S425/S428、S436磷酸化使其激活而發(fā)揮作用［17］。由此可見，F(xiàn)oxM1不但調(diào)控著Cep55的轉(zhuǎn)錄與生成，還通過Ras-MAPK信號通路影響其活性，這可能是FoxM1促進細胞增殖的機制之一。本研究結(jié)果顯示FoxM1與Cep55在BLBC中的表達呈正相關性，進一步支持FoxM1與Cep55之間的相互作用關系，并推測可能由于FoxM1的過表達增加了Cep55的穩(wěn)定性，過表達的FoxM1單獨或與Cep55協(xié)同促進BLBC的侵襲、轉(zhuǎn)移。

c-Myc基因是一種序列特異性轉(zhuǎn)錄因子，其定位于染色體8q24.12-13，主要包括3個成員:c-Myc1、c-Myc2 和 c-MycS［18，19］。該基因主要激活方式是基因擴增、重排或過度表達［20］。其編碼蛋白定位于細胞核內(nèi)，具有轉(zhuǎn)錄因子活性，有調(diào)節(jié)細胞周期、促進細胞增殖、刺激血管生成、抑制細胞分化、參與細胞凋亡等作用［21］。在肺癌、胃癌、肝癌等多種惡性腫瘤［22］中均異常表達。Rummukainen等［23］發(fā)現(xiàn)c-Myc基因擴增水平增高與乳腺癌中的組織學級別較高、PR陰性、DNA非整倍體、較高的S期指數(shù)等因素有關。張宏武［24］還發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中c-Myc的基因擴增及蛋白過表達均與ER陰性顯著相關。另有研究發(fā)現(xiàn)c-Myc基因在luminal型和Her-2過表達型表達量低，而在基底細胞樣乳腺癌中表達水平較高［25，26］。本研究結(jié)果顯示，基底細胞樣乳腺癌組織中c-Myc蛋白的表達明顯高于正常乳腺組織及non-BLBC，且與BLBC的TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(P＜0.05)，提示c-Myc表達水平升高可能與基底細胞樣乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展具有相關性，并且可能參與BLBC的侵襲。

同時c-Myc亦是FoxM1的下游靶基因，與FoxM1共同參與調(diào)節(jié)細胞的分化、增殖、細胞凋亡等生理過程。Guney等［27］現(xiàn)在受到FoxM1siRNA干擾的胃癌細胞中c-Myc的mRNA和蛋白表達水平都發(fā)生下調(diào)。本研顯示FoxM1與c-Myc在BLBC中的表達呈正相關性，說明FoxM1與c-Myc在基底細胞樣乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中存在協(xié)同關系，其相互作用的可能機制為:(1)作為一個常規(guī)的轉(zhuǎn)錄因子，通過與靶基因核心啟動子上游結(jié)點的結(jié)合(5’-A-C/TAAA-C/T-AA-3’)而發(fā)揮作用［28］;(2)FoxM1直接結(jié)合TATA盒框，轉(zhuǎn)錄活化人類c-MycP1和P2啟動子［29］過MEK/Erk1/2信號途徑抑制c-Myc的表達后，c-Myc通過與FoxM1啟動子序列的E-box元件相互作用下調(diào)FoxM1表達，降低c-Myc及其靶基因hTERT在內(nèi)的下游基因的表達，構(gòu)成了c-Myc-FoxM1的正反饋環(huán)，介導腫瘤細胞的生長抑制［30］。

Cep55與c-Myc之間的相互作用沒有文獻報道，而本實驗研究結(jié)果顯示二者之間沒有相關關系，說明兩者可能通過不同的作用途徑對基底細胞樣乳腺癌的發(fā)生發(fā)展及浸潤轉(zhuǎn)移產(chǎn)生影響，相關機制有待進一步實驗研究。

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