濁點(diǎn)萃取法在脫脂月見草子中抗氧化成分提取中的應(yīng)用

劉學(xué)，邱香，曹光群，姜曉燕

(江南大學(xué) 化學(xué)與材料工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

月見草(Oenothera biennis L.)又名夜來香、山芝麻等，為柳葉菜科月見草屬一年生或二年生草本植物［1］。月見草種子含脂肪油20% ～28%，月見草油被譽(yù)為“世紀(jì)的功能性食品的主角”，受到醫(yī)藥、食品保健、美容健膚等領(lǐng)域的廣泛重視［2］。

近年來，從月見草屬植物中分離出脂質(zhì)、類黃酮、單寧酸、類固醇、三萜烯等化學(xué)成分，另外其中還含多酚、生物堿、氨基酸、皂苷等成分［3-5］。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，油性成分被提取后的月見草子殘?jiān)泻袕?qiáng)抗氧化性物質(zhì)，具有很好的開發(fā)利用價(jià)值［6］。

濁點(diǎn)萃取法(CPE)是一種以表面活性劑的水溶液代替有機(jī)溶劑作為萃取劑的新型液-液萃取技術(shù)，它利用表面活性劑的增溶和濁點(diǎn)現(xiàn)象而實(shí)現(xiàn)高效提?。?］。目前，CPE 已較多的應(yīng)用于金屬離子、多環(huán)芳烴、大分子類物質(zhì)的富集和分析領(lǐng)域，在天然植物活性成分提取方面的研究相對(duì)較少［8-9］。CPE 操作步驟簡(jiǎn)單、應(yīng)用范圍廣、不使用有機(jī)溶劑、表面活性劑可回收、活性成分在提取過程中不易變性，且具有易于放大、對(duì)環(huán)境友好的特點(diǎn)［10-11］。在提取過程中，如果選擇水為主要提取溶劑，同時(shí)利用CPE 的這些特性，將有利于開發(fā)更具生物活性的產(chǎn)品以及進(jìn)一步的工業(yè)化應(yīng)用。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

月見草子，河北安國(guó)市百味堂藥店;Triton X-110、1，1-二苯-2-苦基肼(DPPH)為阿拉丁試劑;脂肪酸聚醚酯PGPL、EO8 均為自制;氯化鈉、無水乙醇、石油醚(60 ～90 ℃)均為分析純;實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。

TG1650-WS 離心機(jī);KH-100B 超聲波清洗儀;YLJYE-100 數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋;TU-1901 雙光束紫外可見分光光度計(jì);DFY-300 搖擺式高速萬能粉碎機(jī);FA1604 上皿電子天平。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品脫脂 將月見草子用粉碎機(jī)粉碎，過40 目標(biāo)準(zhǔn)篩，置于錐形瓶中，加入15 倍量(V/m)的石油醚，超聲提取30 min，常壓過濾。在濾渣中再加入15 倍量的石油醚，重復(fù)提取1 次。濾渣40 ℃干燥12 h，得脫脂月見草子粉末。

1.2.2 CPE 提取 準(zhǔn)確稱取脫脂月見草子粉末1.0 g于50 mL 錐形瓶中，加入表面活性劑溶液，混合均勻，超聲提取2 次，每次30 min。提取溶液以8 000 r/min轉(zhuǎn)速離心30 min。將上清液小心轉(zhuǎn)移至干凈的容器中，合并2 次上清液，加入適量NaCl，再次混合均勻，置于50 ℃水浴中恒溫保持一定時(shí)間。繼以6 000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心10 min，溶液清晰分為兩層:下層為水相，上層為表面活性劑富集相。去除水相，表面活性劑富集相中加入15 mL 無水乙醇，充分振蕩搖勻后以6 000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至25 mL 容量瓶中，定容，待測(cè)。

1.3 抗氧化活性

1.3.1 清除DPPH 自由基(DPPH·)的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線測(cè)定 在10 mL 離心管中依次加入1.0 mL待測(cè)樣品溶液和3.0 mL 0.125 mmol/L 的DPPH 溶液，立刻混勻，倒入比色皿中。以1.0 mL 待測(cè)樣品溶液和3.0 mL 無水乙醇為參比，在517 nm 處測(cè)吸光值隨時(shí)間的變化曲線，確定最佳反應(yīng)時(shí)間。

1.3.2 DPPH·清除率測(cè)定 (1)在10 mL 離心管中 依 次 加 入 1.0 mL 無 水 乙 醇 和 3.0 mL 0.125 mmol/L的DPPH 溶液，遮光混勻，待反應(yīng)穩(wěn)定后，以無水乙醇為參比，在517 nm 處測(cè)吸光值，記為A0。

(2)在10 mL 離心管中依次加入1.0 mL 待測(cè)樣品溶液和3.0 mL 0.125 mmol/L 的DPPH 溶液，遮光混勻，待反應(yīng)穩(wěn)定后，以無水乙醇為參比，在517 nm 處測(cè)吸光值，記為A1。

(3)在10 mL 離心管中依次加入1.0 mL 待測(cè)樣品溶液和3.0 mL 無水乙醇，遮光混勻，待反應(yīng)穩(wěn)定后，以無水乙醇為參比，在517 nm 處測(cè)吸光值，記為A2。

自由基清除率(X)，按下式計(jì)算:

2 結(jié)果與討論

2.1 CPE 提取物清除DPPH·反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

為了解DPPH 反應(yīng)體系在加入樣品溶液之后的吸光值隨時(shí)間的變化規(guī)律，可用高濃度和低濃度樣品溶液反應(yīng)體系進(jìn)行測(cè)定。高濃度體系是指提取物質(zhì)量濃度在10 ～100 mg/mL，此時(shí)清除率均在95%～98%之間波動(dòng);低濃度體系是濃度在0.33 ～2 mg/mL，此時(shí)清除率隨濃度的增大而升高，呈正向相關(guān)性。因此在低濃度范圍內(nèi)選定一個(gè)濃度，比較該樣品濃度下的DPPH·清除率的不同，從而可以以提取物的清除DPPH·能力為指標(biāo)來判斷萃取能力的高低。動(dòng)力學(xué)曲線反映了CPE 提取物中活性成分與DPPH·反應(yīng)隨時(shí)間的變化趨勢(shì)，通過動(dòng)力學(xué)曲線可找出反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)所需的時(shí)間，結(jié)果見圖1。

圖1 CPE 提取物溶液清除DPPH·動(dòng)力學(xué)曲線Fig.1 Kinetic curve of DPPH· scavenging by CPE extract

由圖1 可知，在CPE 提取物溶液作用下，反應(yīng)體系的吸光度在最初的20 min 內(nèi)下降較快;20 ～50 min變化趨于平緩;60 min 后吸光度相對(duì)穩(wěn)定，故選擇反應(yīng)時(shí)間為60 min。

2.2 表面活性劑選擇

PGPL 和EO8 分別為在本實(shí)驗(yàn)室以月桂酸和不同比例的環(huán)氧丙烷和環(huán)氧乙烷反應(yīng)所得脂肪酸聚氧乙烯酯，具有較低的濁點(diǎn)。以PGPL、EO8 和Triton X-100 三種表面活性劑溶液(40 g/L)進(jìn)行CPE 提取，各表面活性劑溶液以及所得到提取物的DPPH·清除率的結(jié)果見表1。

表1 不同表面活性劑和CPE 提取物的DPPH·清除率Table 1 DPPH· scavenging rates of different surfactants and extracts

由表1 可知，表面活性劑PGPL、EO8 和Triton X-100 清除DPPH·能力極弱，不會(huì)對(duì)樣品清除DPPH·能力產(chǎn)生干擾。同樣萃取條件下，Triton X-100表面活性劑的DPPH·清除率最高。因此，以下實(shí)驗(yàn)中均選用Triton X-100 作表面活性劑，同時(shí)，Triton X-100 作為濁點(diǎn)萃取劑具有濁點(diǎn)溫度低，密度較高，有利于離心分離，價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)。

2.3 提取工藝的優(yōu)化

2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn) 各單因素實(shí)驗(yàn)條件下所得提取物的DPPH·清除率見圖2。

由圖2A 可知，隨著平衡時(shí)間增長(zhǎng)，DPPH·清除率隨之上升，但超過30 min，DPPH·清除率略微下降。這可能是由于當(dāng)平衡時(shí)間過長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致濁點(diǎn)萃取向反方向變化，表面活性劑相逐漸消失。故平衡時(shí)間30 min 較佳。

由圖2B 可知，隨著液固比的增大，DPPH·清除能力增強(qiáng)，固液比超過30 ∶1 mL/g 后，DPPH·清除率基本穩(wěn)定。這有可能是因?yàn)闃悠分械幕钚晕镔|(zhì)的量一定，或者受表面活性劑的官能團(tuán)的種類和數(shù)量的限制，再繼續(xù)增加萃取液的量，DPPH·的清除率也不會(huì)再上升。所以液固比為30 ∶1 較佳。

本實(shí)驗(yàn)選用氯化鈉作為電解質(zhì)，因其陽離子Na+無鹽溶效應(yīng)，故陰離子鹽析效應(yīng)使?jié)狳c(diǎn)降低。由圖2C 可知，隨著離子強(qiáng)度的增大，DPPH·的清除率也變大。這是由于對(duì)像Triton X-100 這一類的非離子型表面活性劑而言，電解質(zhì)的加入可以使形成的膠束發(fā)生氫鍵斷裂，導(dǎo)致脫水，減小凝聚相體積，并改變主體水相的密度而影響分相速度，從而使?jié)狳c(diǎn)溫度降低，表面活性劑分子沉降發(fā)生相分離。氯化鈉易溶解，它的加入使Triton X-100 體系在低溫下即能完成相分離。但是當(dāng)NaCl 的加入量接近飽和溶液時(shí)，繼續(xù)增大氯化鈉的量對(duì)萃取率無影響。所以，實(shí)驗(yàn)中所用離子強(qiáng)度為3.4 mol/L。

圖2 各因素對(duì)DPPH·清除率的影響Fig.2 Effects of various factors on DPPH· scavenging rate

由圖2D 可知，隨著表活濃度的增大，DPPH·的清除率增大，40 g/L 時(shí)達(dá)最大;繼續(xù)增大表活濃度，反而會(huì)使DPPH·清除率顯著降低，當(dāng)表活濃度達(dá)到55 g/L 時(shí)，DPPH·的清除率降低到40%。這可能是由于Triton X-100 的濃度大小不僅決定萃取分離的效果，而且決定富集膠束相體積的大小，同時(shí)影響分相過程。濁點(diǎn)萃取率隨表面活性劑中官能團(tuán)的種類和數(shù)量的增多而增大，隨溶液的粘度的增大而減小，當(dāng)表活濃度＜40 g/L 時(shí)，前者起主要作用;當(dāng)表活濃度＞40 g/L 時(shí)，后者起主要作用，故表活濃度在40 g/L 時(shí)較優(yōu)。

2.3.2 正交實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，篩選最佳提取工藝條件，結(jié)果見表2。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiments

由表2 可知，液固比對(duì)清除DPPH·能力影響最大，最后影響因素是表活濃度。最優(yōu)組合為A2B2C2D3，即平衡時(shí)間30 min，液固比30 ∶1 mL/g，離子強(qiáng)度3.1 mol/L，表活濃度45 g/L。

2.4 CPE 提取物與VC 清除DPPH·能力比較

根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)最優(yōu)組合的提取條件，提取脫脂月見草子中抗氧化活性物質(zhì)，定容至10 mL 的容量瓶中，分別稀釋樣品溶液質(zhì)量濃度至0，0.33，0.67，1.33，2，2.67，4，8，10 mg/mL，測(cè)定吸光度，每組濃度都進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)，求取平均值并計(jì)算自由基清除率。精密稱取10 mg VC 定容至10 mL，分別稀釋至質(zhì)量濃度為0.01，0.015，0.02，0.025，0.03，0.035，0.04，0.06，0.10 mg/mL，按上述方法進(jìn)行測(cè)定。

不同濃度CPE 提取物與VC 清除DPPH·能力見圖3。

由圖3 可知，DPPH·清除率隨著溶液濃度的增加而提高，當(dāng)DPPH·清除率達(dá)到1/2 時(shí)，待測(cè)樣品半抑制濃度(IC50)為1.065 mg/mL，VC 溶液的IC50為0.017 mg/mL?？梢娒撝乱姴葑覥PE 提取物有較好的抗氧化活性，與強(qiáng)抗氧化劑VC 相比有一定差距，抗氧化成分仍需后續(xù)分離純化。

圖3 不同質(zhì)量濃度VC 和CPE 提取物溶液對(duì)DPPH·清除率Fig.3 DPPH· scavenging rate of different concentrations of VC and CPE extracts

3 結(jié)論

優(yōu)化濁點(diǎn)萃取法對(duì)脫脂月見草子中抗氧化活性物質(zhì)的最佳提取工藝條件為:表面活性劑類型Triton X-100、平衡時(shí)間30 min，液固比30 ∶1 mL/g，氯化鈉摩爾濃度3.1 mol/L，表面活性劑質(zhì)量濃度45 g/L。CPE 提取物的IC50值為1.065 mg/mL，具有良好的抗氧化性，將其應(yīng)用于化妝品、食品或藥品相關(guān)領(lǐng)域具有較大的潛力。

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