HPLC- PAD 法同時(shí)測(cè)定維藥祖卡木顆粒中甘草苷、柚皮苷、槲皮素和山奈酚的含量

買買提·吐?tīng)栠d，古麗巴哈爾·達(dá)吾提，陳娟，麥麥提江·熱麥提

(1.喀什大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，新疆 喀什 844000;2.新疆特色藥食用植物資源化學(xué)實(shí)驗(yàn)室，新疆 喀什 844000)

維吾爾藥祖卡木(Zukamu Granules )顆粒是由山奈、大棗、甘草、睡蓮花、洋甘菊、蜀葵子、薄荷、大黃、破布木果、罌粟殼十種新疆維吾爾天然藥材組成的，采用維吾爾傳統(tǒng)制藥工藝，并結(jié)合現(xiàn)代制藥工藝生產(chǎn)的口服顆粒制劑。該制劑能夠調(diào)節(jié)異常氣質(zhì)，清熱、發(fā)汗、通竅，可用于治療感冒咳嗽、發(fā)熱無(wú)汗、咽喉腫痛、鼻塞流涕等病癥［1］。據(jù)古代維吾爾醫(yī)籍記載，該處方至今已有1500 多年歷史。研究表明，組成該處方藥的山奈、大棗、甘草、大黃等都含有黃酮類成分，祖卡木顆粒的抗病毒作用，與其所含有的黃酮類化合物有密切的聯(lián)系。目前，對(duì)祖卡木顆粒中總蒽醌、總黃酮、罌粟堿含量的測(cè)定有研究報(bào)道，尚未見(jiàn)用高效液相色譜方法同時(shí)分離測(cè)定祖卡木顆粒中的甘草苷、柚皮苷、槲皮素和山奈酚的相關(guān)報(bào)道。本文以新疆維吾爾藥業(yè)有限公司和新疆齊康哈博維藥有限公司生產(chǎn)的各4 批次祖卡木顆粒為研究對(duì)象，提取該顆粒中的甘草苷、柚皮苷、槲皮素和山奈酚，建立用高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)法測(cè)定祖卡木顆粒中甘草苷、柚皮苷、槲皮素和山奈酚含量的方法。以期為祖卡木顆粒的進(jìn)一步研究和質(zhì)量分析提供一定的參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

甘草苷對(duì)照品(編號(hào):111610-201005)、柚皮苷對(duì)照品(編號(hào):110722-200610)、槲皮素對(duì)照品(編號(hào):100081-200907)、山奈酚對(duì)照品(編號(hào):110861-200808)均來(lái)自中國(guó)藥品生物制品檢定所;甲醇、乙腈均為色譜純;乙醇、磷酸均為分析純;水為高純水;祖卡木顆粒，2013 年和2014 年分5 批采購(gòu)于喀什及烏魯木齊各大醫(yī)院藥房。

島津LC-20AT 高效液相色譜儀;KQ3200DE 型超聲波清洗器;XA-1 型多功能粉碎機(jī);ZK-82B 真空干燥箱;賽多利斯BS224S 型電子天平。

1.2 色譜條件

色譜柱安捷倫HC-C18 柱(5 μm，250 mm ×4.6 mm)，流動(dòng)相乙腈(A)-0.1% 磷酸(B)，梯度洗脫，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)286 nm，365 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量20 μL 。

1.3 對(duì)照品溶液的配制

準(zhǔn)確稱取甘草苷、柚皮苷、槲皮素及山奈酚對(duì)照品各10.0 mg 置于50 mL 容量瓶中，用甲醇使其溶解并定容至刻度，搖勻，得200 μg/mL 甘草苷、柚皮苷、槲皮素和山奈酚對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。使用時(shí)根據(jù)需要混合并稀釋至所需濃度。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:分別準(zhǔn)確吸取不同體積甘草苷、柚皮苷、槲皮素及山奈酚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于7 個(gè)10 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，在冰箱里保存(5 ℃)。7 組混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度(μg/mL)見(jiàn)表1。

表1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中甘草苷、柚皮苷、槲皮素和山奈酚的濃度(μg/mL)Table 1 Concentrations of liquiritin，naringin，quercetin and kaempferol in mixed standard solution

1.4 樣品溶液的制備

取不同廠家不同批次祖卡木顆粒，分別研細(xì)并過(guò)60 目篩，準(zhǔn)確稱取粉末1.0 g，用50% 甲醇(50 mL)浸泡2 h 后，超聲提取20 min，使其完全溶解，再次超聲10 min，過(guò)濾，并用純甲醇沖洗濾紙，減壓蒸餾至近干，用甲醇定容至25 mL，搖勻，用0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，濾液置于冰箱備用。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

從二極管陣列檢測(cè)器采集的樣品三維圖譜中提取紫外光譜和不同波長(zhǎng)的色譜進(jìn)行對(duì)比，檢測(cè)波長(zhǎng)為286 nm 時(shí)甘草苷和柚皮苷都有比較強(qiáng)的吸收，而槲皮素和山奈酚吸收較弱。當(dāng)檢測(cè)波長(zhǎng)為365 nm時(shí)槲皮素和山奈酚都有較強(qiáng)吸收，而甘草苷和柚皮苷吸收很弱或無(wú)吸收。因此，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)［2-3］確定286 nm (甘草苷、柚皮苷)和365 nm (槲皮素、山奈酚)作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2 流動(dòng)相的選擇

分別采用不同比例的甲醇/水、乙腈/水、甲醇/磷酸、乙腈/磷酸溶液為流動(dòng)相［4］，對(duì)樣品的分離情況進(jìn)行考察，當(dāng)乙腈(A)/0.1%磷酸(B)按下列程序進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，甘草苷、柚皮苷、槲皮素和山奈酚與其他雜質(zhì)峰得到了良好的分離，基線漂移得到了解決，峰形良好。洗脫程序見(jiàn)表2。

表2 洗脫程序Table 2 Elution profile of gradient steps

2.3 提取溶劑及提取方法的選擇

考察了乙醇熱回流索氏提取法、乙醇超聲波提取法、甲醇24 h 浸泡法和甲醇超聲波提取法［5-6］。結(jié)果表明，用50% 甲醇浸泡2 h 后，超聲20 min，放置10 min，再次超聲10 min 的方法對(duì)甘草苷、柚皮苷、槲皮素和山奈酚的提取率相對(duì)最高，在相同的色譜條件下峰面積最大。而且超聲波提取法操作簡(jiǎn)便、提取率高。故選擇用50% 甲醇浸泡2 h，超聲20 min，放置10 min，再次超聲10 min 作為提取溶劑和提取方法。

2.4 線性關(guān)系和精密度實(shí)驗(yàn)

分別精密吸取7 組混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液20 μL，從低濃度到高濃度按色譜條件測(cè)定其峰面積，每一組重復(fù)3 次，以對(duì)照品濃度c(μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積A 為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍見(jiàn)表3。

表3 線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍Table 3 Linearity between peak area and concentration

對(duì)上述7 組混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中選用甘草苷、柚皮苷、槲皮素和山奈酚的濃度為1.0，5.0，5.0，5.0 μg/mL的溶液進(jìn)行了3 次重復(fù)測(cè)定，每1 次進(jìn)樣量為20 μL，結(jié)果甘草苷、柚皮苷、槲皮素和山奈酚的RSD 分別為2.51%，1.84%，2.07%，1.21%。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(A，B)及樣品溶液(A* ，B* )色譜圖Fig.1 Chromatograms of mixed reference substances(A，B)and samples (A* ，B* )

用乙腈(A)/0.1%磷酸(B)進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，樣品中各組分的色譜峰分離度良好，當(dāng)選擇波長(zhǎng)為286 nm 時(shí)，甘草苷、柚皮苷的峰面積最大(見(jiàn)圖A 和A*)。而槲皮素和山奈酚在286 nm 處吸收很弱，因此，選用365 nm 作為槲皮素和山奈酚的檢測(cè)波長(zhǎng)。此時(shí)，槲皮素和山奈酚的峰面積最大(見(jiàn)圖B 和B*)。

2.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取供試品溶液，在12 h 內(nèi)每隔2 h 進(jìn)樣一次，進(jìn)樣量20 μL，測(cè)定甘草苷、柚皮苷、槲皮素和山奈酚的峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.18%，1.43%，1.98%，2.06%。結(jié)果表明，供試品溶液在12 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.6 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取已知甘草苷、柚皮苷、槲皮素和山奈酚含量的祖卡木顆粒樣品5 份，每份1 g 左右，分別添加不同量的甘草苷、柚皮苷、槲皮素和山奈酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.4 節(jié)方法制備加標(biāo)樣品溶液，按規(guī)定的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。其平均回收率為甘草苷102.8%，柚皮苷97.3%，槲皮素103.6%，山奈酚101.4%。

表4 方法的回收率和精密度Table 4 Recovery and precision of the method

2.7 樣品含量測(cè)定結(jié)果

精密吸取不同批次不同廠家生產(chǎn)的祖卡木顆粒樣品溶液20 μL 進(jìn)樣，并按1.2 節(jié)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，按外標(biāo)法計(jì)算樣品中甘草苷、柚皮苷、槲皮素和山奈酚的含量，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 樣品中甘草苷、柚皮苷、槲皮素和山奈酚的測(cè)定結(jié)果Table 5 Determination results of samples

由表5 可知，樣品2 不同批次的藥品溶液中甘草苷的含量普遍較高，而樣品1 中柚皮苷、槲皮素、山奈酚的含量普遍高于樣品2。

3 結(jié)論

甘草苷、柚皮苷、槲皮素和山奈酚是祖卡木顆粒中的主要活性成分，具有抗炎、抗病毒、抗菌、祛痰、止咳、平喘等作用，本文對(duì)樣品中甘草苷、柚皮苷、槲皮素和山奈酚的提取方法及色譜條件進(jìn)行了研究，用反相高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)法對(duì)不同廠家生產(chǎn)的祖卡木顆粒中甘草苷、柚皮苷、槲皮素和山奈酚含量進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明，在同一廠家生產(chǎn)的不同批次樣品中個(gè)體差異很小，而不同廠家生產(chǎn)的藥品中上述四種成分的含量有一定差異，可能是因?yàn)橥读媳群驮蟻?lái)源引起的差異。同時(shí)對(duì)方法的精密度、穩(wěn)定性及加標(biāo)回收率等進(jìn)行了考察，結(jié)果表明該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、可靠，適于測(cè)定祖卡木顆粒中甘草苷、柚皮苷、槲皮素和山奈酚的含量。

［1］ 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)維吾爾分冊(cè)［M］.烏魯木齊:新疆科技衛(wèi)生出版社，1999:175.

［2］ 許棟明，程可建.RP-HPLC 同時(shí)測(cè)定溫膽湯中甘草苷、柚皮苷、橙皮苷和甘草酸［J］.中國(guó)中藥雜志，2011，36(1):45-47.

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［5］ 陳晨，張興旺，羅智敏，等.RP-HPLC 法測(cè)定不同地區(qū)金露梅中槲皮素和山奈酚［J］.分析試驗(yàn)室，2009，28(12):54-56.

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