異氟醚對老年大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力及海馬RhoA蛋白表達(dá)的影響

張文超 王 庚 胡中華 段開明 歐陽文▲

1.北京積水潭醫(yī)院麻醉科，北京 100035；2.中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院麻醉科，湖南長沙 410083

近年來，許多研究從大腦海馬區(qū)神經(jīng)突觸形態(tài)學(xué)的變化來探究神經(jīng)結(jié)構(gòu)對學(xué)習(xí)記憶功能的影響。異氟醚對神經(jīng)軸突與樹突結(jié)構(gòu)有很大的可塑性，而這種可塑性的變化可能是學(xué)習(xí)與記憶能力的細(xì)胞基礎(chǔ)[1]。Rho 蛋白家族是與受體偶聯(lián)的小G 蛋白家族，分子量為20～30 kD，屬于Ras 超家族成員，在細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)中具有重要的功能[2]。 其主要成員RhoA 蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞肌動蛋白骨架的聚合， 對神經(jīng)纖維延長與塌陷、神經(jīng)生長方向具有導(dǎo)向作用，通過對肌動蛋白的調(diào)控而起調(diào)控樹突狀偽足和樹突棘形態(tài)的動態(tài)變化，影響神經(jīng)可塑性，而這一現(xiàn)象在學(xué)習(xí)基本形式的長時程增強(qiáng)（LTP）中有充分的體現(xiàn)[3]。 本研究以老齡SD 大鼠作為研究對象，通過建立吸入麻醉模型，使用動物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)觀察異氟醚麻醉后老年大鼠興奮性、探索性指標(biāo)以及空間辨別能力的變化，通過免疫組織化學(xué)方法觀察大鼠海馬區(qū)RhoA 蛋白的表達(dá)變化，為探討22月齡大鼠短時間異氟醚麻醉后興奮性、空間辨別能力改變的的機(jī)制提供理論依據(jù)，從而更好地闡明吸入異氟醚后對認(rèn)知功能障礙的發(fā)病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物分組

22 月齡老齡SD 大鼠，訂購于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物養(yǎng)殖場（生產(chǎn)許可證SCXK 湘2006-0001）體重550～620 g。 飼養(yǎng)條件為（22±1）℃，相對濕度40%～50%，自然晝夜非直接光照。經(jīng)穿梭箱回避實(shí)驗(yàn)篩選出30 只學(xué)習(xí)記憶能力正常的大鼠， 隨機(jī)分為對照組C 組（n = 10）、麻醉后24 h Ⅰ組（n = 10）和麻醉后72 h Ⅱ組（n = 10）。

1.2 模型建立

采用Deatex-Ohmeda 氣體監(jiān)測儀監(jiān)測自制麻醉箱中異氟醚濃度。待麻醉箱內(nèi)異氟醚濃度調(diào)節(jié)至3%時將麻醉組大鼠放于麻醉箱內(nèi)5 min，再將處于誘導(dǎo)狀態(tài)的老年大鼠，置于自制拱形氣管插管臺上，采用經(jīng)口明視氣管插管方法，將14G 靜脈套管經(jīng)鋼絲引導(dǎo)插入老鼠氣管中[4]。PetCO2探頭確定氣管插管操作成功后，將氣管導(dǎo)管與麻醉機(jī)相連， 大鼠自主吸入麻醉氣體，異氟醚濃度調(diào)為2%。 應(yīng)用鼠尾無創(chuàng)血壓檢測儀與分析系統(tǒng)（北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司）于麻醉誘導(dǎo)前，麻醉誘導(dǎo)過程中，麻醉維持2 h 與蘇醒后分別檢測大鼠鼠尾無創(chuàng)收縮壓、舒張壓、平均動脈壓（MAP）、心率（HR）。 麻醉結(jié)束后，大鼠在吸入純氧下自然蘇醒。

1.3 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 Y-迷宮實(shí)驗(yàn)

根據(jù)文獻(xiàn)[5]，將大鼠放入Y-迷宮箱中適應(yīng)3～5 min，然后隨機(jī)開始實(shí)驗(yàn)：隨機(jī)變換電擊區(qū)和安全區(qū)，觀察動物學(xué)會逃離電擊區(qū)而進(jìn)入安全區(qū)的反應(yīng)能力。大鼠進(jìn)入安全區(qū)后，燈光繼續(xù)維持5 s，以便大鼠確認(rèn)安全位置。兩次測試時間間隔為30 s，每次訓(xùn)練20次，休息5 min，連續(xù)測試直到學(xué)會為止，若測試次數(shù)﹥100 次則不再測試，并以100 為最大計數(shù)值。每次測試后，清理Y-迷宮箱，以免動物氣味對下次測試結(jié)果造成影響[6]。

1.3.2 曠場實(shí)驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[7-8]采用自制曠場實(shí)驗(yàn)觀察箱100 cm×100 cm×50 cm（長×寬×高），箱底分為25 個方格（20 cm×20 cm），墻壁涂黑。將曠場分析箱從左上開始，按左到右順序以不同編號為相同的25 個小格，其中7、8、9、12、13、14、17、18 和19 為中央?yún)^(qū)域， 其余為外周格，13 號為中央格子。 每次實(shí)驗(yàn)時捏住大鼠尾巴距根部2/3 處輕放入中央格中，觀察大鼠5 min 內(nèi)活動情況，每次測定結(jié)束將動物排泄物清除干凈， 每只僅測定1 次。 實(shí)驗(yàn)時間結(jié)束錄像分析結(jié)果。 設(shè)兩位觀察者分別觀察記錄不同指標(biāo)。 以跨格次數(shù)為水平活動得分，直立次數(shù)為垂直活動得分，記錄中央格停留時間。

1.4 標(biāo)本制備

行為學(xué)測試后，用麻醉致死法對大鼠腹腔注射麻醉藥， 在大鼠心臟還在跳動時通過左心耳快速灌注4℃生理鹽水100 mL 洗凈血液， 然后以4%多聚甲醛200～300 mL 灌注固定。 止血鉗剝離大鼠顱骨，取出完整大腦置于4℃4%多聚甲醛中浸泡6 h， 而后移入4℃的30%蔗糖溶液，將大腦冰凍切片（片厚為30 μm），用pH 7.4 的0.01% PBS 切片， 接著進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。

免疫組織化學(xué)染色： 切片移入0.1Triton～0.001%H2O2溶液中，在37℃下反應(yīng)30 min，PBS 緩沖液漂洗后，以3%正常羊血清封閉30 min，然后加兔抗RhoA抗體，4℃溫盒內(nèi)孵育72 h。 漂洗后加入即用型二抗（上海長島生物技術(shù)有限公司），37℃孵育30 min，PBS沖洗，0.05% DAB～0.01% H2O2溶液顯色，脫水，封片。應(yīng)用彩色病理圖片分析系統(tǒng)，對所有切片在同一光度下，每張切片隨機(jī)選取3 個200 倍鏡下視野計數(shù)陽性細(xì)胞，以單個標(biāo)本為單位，取平均值。

1.5 RhoA 分析

參照大鼠腦圖譜，每只大鼠選含背側(cè)海馬相應(yīng)斷面，選擇其中顯色較好且非特異性背景染色控制良好的切片3 張。 在光鏡下從每張切片的海馬CA3 區(qū)有代表性區(qū)域分別隨機(jī)選擇3 個高倍視野（10×40 倍），統(tǒng)計各視野RhoA 陽性細(xì)胞數(shù)。 陽性標(biāo)準(zhǔn)：棕黃色顆粒，特異性分布于胞質(zhì)與胞核。 染色深度達(dá)到足以區(qū)分細(xì)胞周界的神經(jīng)元被計數(shù)，計算平均值。 同時分別在20 倍與400 倍鏡下采集圖像， 通過圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0 對切片免疫組織化學(xué)陽性染色細(xì)胞進(jìn)行定量分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

三組22 月齡大鼠體重?zé)o統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。麻醉組老齡SD 大鼠中麻醉前后收縮壓、 舒張壓、MAP、HR、鼠尾氧飽和度保持在正常范圍，PetCO2維持在36～42 mm Hg（1 mm Hg = 0.133 kPa）且波形規(guī)則，皮膚顏色紅潤，未出現(xiàn)血壓較大波動及缺氧現(xiàn)象。

2.2 三組大鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

曠場實(shí)驗(yàn)：三組大鼠跨格次數(shù)、直立次數(shù)、總活動量次數(shù)及中央格停留時間比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）；Y-迷宮實(shí)驗(yàn)： Ⅰ組Y-迷宮學(xué)習(xí)次數(shù)明顯多于Ⅱ組和C 組（P ＜0.05），而Ⅱ組與C 組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。 見表1。

表1 三組大鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較（）

表1 三組大鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較（）

注：與Ⅰ組比較，*P ＜0.05

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2.3 三組大鼠免疫組織化學(xué)反應(yīng)結(jié)果

光鏡下免疫組織化學(xué)結(jié)構(gòu)顯示：大鼠海馬組織中可見RhoA 主要分布于椎體細(xì)胞層和輻射層，陽性細(xì)胞呈棕褐色，染色均勻，排列規(guī)則，呈弧形分布。 200倍鏡下隨機(jī)選取3 個視野大鼠海馬區(qū)RhoA 陽性細(xì)胞計數(shù)，Ⅰ組RhoA 陽性細(xì)胞計數(shù)多于Ⅱ組和C 組（P ＜0.05），Ⅱ組與C 組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05），表明在異氟醚吸入麻醉后24 h，大鼠海馬區(qū)RhoA 表達(dá)增加，吸入麻醉后72 h 有所恢復(fù)。 見表2。

表2 三組大鼠海馬CA3 區(qū)RhoA 陽性細(xì)胞計數(shù)比較

3 討論

術(shù)后認(rèn)知功能障礙（postoperative cognitive dysfunction，POCD）是指麻醉術(shù)后老年患者性格改變、學(xué)習(xí)記憶能力下降等中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙[9-11]。 作為老年患者術(shù)后常見并發(fā)癥給患者術(shù)后生活帶來嚴(yán)重?zé)?，?dǎo)致患者喪失社會活動、 工作學(xué)習(xí)以及生活自理能力，因此減少麻醉術(shù)后認(rèn)知障礙發(fā)生具有非常重要的意義。調(diào)查顯示，盡管醫(yī)療技術(shù)水平有了很大提高，但是對于POCD 發(fā)病機(jī)制以及預(yù)防和治療方法未得到顯著改善。鑒于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和認(rèn)知相關(guān)研究的復(fù)雜性，POCD 發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制一直沒有得到圓滿解答。突觸是一個神經(jīng)元的沖動傳到另一個神經(jīng)元或傳到另一個細(xì)胞間相互接觸的結(jié)構(gòu)，是神經(jīng)元之間在功能上發(fā)生聯(lián)系的部位，也是信息傳遞的關(guān)鍵部位。 神經(jīng)軸突與樹突結(jié)構(gòu)有很大的可塑性，而這種可塑性的變化可能是學(xué)習(xí)與記憶能力的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)[12]。

在動物實(shí)驗(yàn)中，主要采用行為學(xué)實(shí)驗(yàn)研究藥物對動物學(xué)習(xí)記憶能力的影響，人和動物的內(nèi)部心理過程很難直觀觀察到，通過客觀的動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛠黹g接推測腦內(nèi)所發(fā)生的過程，從而反映動物認(rèn)知能力的水平與變化[13]。 目前，國內(nèi)外多采用建立條件反射方法檢測動物的行為能力和高級腦功能。曠場實(shí)驗(yàn)是將一定面積劃分為不同區(qū)域，并以相應(yīng)的格子對應(yīng)。 大鼠在新環(huán)境中是由緊張、興奮、探索再到適應(yīng)的一系列過程， 興奮性的老鼠在適應(yīng)的環(huán)境中表現(xiàn)為行動活躍，四處走動，留下自身的生物氣息，跨格次數(shù)的多少反映其興奮程度?？绺翊螖?shù)的多少與動物的行動量成正比，跨格次數(shù)多，活動的距離也相應(yīng)增加，這些觀察指標(biāo)可以間接地反映動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮或抑制狀態(tài)。 實(shí)驗(yàn)中，三組大鼠中央格停留時間、跨格次數(shù)、直立次數(shù)、總活動量次數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明2%異氟醚麻醉后24、72 h 對大鼠的緊張、興奮、探索等興奮性指標(biāo)沒有顯著變化，因此可以認(rèn)為短時間吸入異氟醚對老年大鼠的空間學(xué)習(xí)能力影響不是由于其中樞興奮狀態(tài)的改變而產(chǎn)生的。 Y-迷宮用于檢測大鼠的空間辨別能力，老年大鼠在迷宮中對電刺激和光刺激出現(xiàn)被動的逃避反應(yīng)，經(jīng)過多次訓(xùn)練后大鼠就能學(xué)會并記住迷宮的安全位置，間接地反映出老年大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[14]。Y-迷宮達(dá)到學(xué)會標(biāo)準(zhǔn)的次數(shù)能夠較客觀地表現(xiàn)大鼠的學(xué)習(xí)能力。

多年來，海馬一直被認(rèn)為是參與學(xué)習(xí)記憶的重要腦區(qū)，因海馬是大腦邊緣系統(tǒng)的重要組成部分，參與外界信息中樞傳遞的整合，一直是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域研究的焦點(diǎn)，海馬區(qū)突觸結(jié)構(gòu)與大鼠學(xué)習(xí)記憶能力密切相關(guān)。海馬區(qū)神經(jīng)元在學(xué)習(xí)記憶過程中主要參與學(xué)習(xí)記憶鞏固的早期過程[15-16]，而后期的學(xué)習(xí)記憶過程更多是與其他腦區(qū)有關(guān)[17]。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Ⅰ組大鼠達(dá)到學(xué)會標(biāo)準(zhǔn)所需的訓(xùn)練次數(shù)明顯多于對照組（C 組），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05），Ⅱ組與C 組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義， 表明2%異氟醚麻醉2 h 后可導(dǎo)致老年大鼠空間學(xué)習(xí)能力受損，學(xué)習(xí)能力下降，這種現(xiàn)狀在麻醉后第1 天表現(xiàn)最為明顯， 而第3 天基本恢復(fù)，學(xué)習(xí)結(jié)果體現(xiàn)在海馬區(qū)神經(jīng)突觸結(jié)構(gòu)的變化基礎(chǔ)上，通過免疫組織化學(xué)法可以直觀觀察海馬區(qū)RhoA 陽性細(xì)胞的變化與學(xué)習(xí)成績變化趨勢相同，因此可以推斷異氟醚麻醉后老年大鼠短期內(nèi)認(rèn)知能力受損與異氟醚麻醉對海馬CA3 區(qū)RhoA 表達(dá)的影響干擾了突觸偽足的形成與塌陷有關(guān)。 Kaech 等[18]為觀察全麻藥物對突觸的影響， 使用熒光顯微鏡實(shí)時拍攝技術(shù)，觀察樹突棘的形態(tài)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)液中加入異氟醚后，神經(jīng)細(xì)胞樹突棘活力下降，說明吸入麻醉藥會影響海馬區(qū)樹突棘的動力性和棘突結(jié)構(gòu)的改變。神經(jīng)軸突與樹突應(yīng)對麻醉刺激有很大的可塑性，而這種形態(tài)學(xué)的變化可能是學(xué)習(xí)與記憶能力改變的細(xì)胞基礎(chǔ)[19-20]。RhoA 通過影響肌球蛋白收縮引起軸突生長錐的回縮及塌陷，RhoA 主要通過Rho 相關(guān)激酶信號傳導(dǎo)通路調(diào)節(jié)肌動蛋白微絲骨架的聚集，進(jìn)而影響細(xì)胞的極性和形態(tài)，RhoA 可使多個氨基酸位點(diǎn)磷酸化而激活，肌球蛋白磷酸酶結(jié)合亞單位是活化Rho 相關(guān)激酶的底物，磷酸化失活后，促使肌動蛋白微絲骨架聚合，從而影響細(xì)胞收縮[21]。 本實(shí)驗(yàn)通過觀察老年大鼠海馬組織中Rho 蛋白家族RhoA 表達(dá)變化，試圖從異氟醚對海馬組織中神經(jīng)突觸間信號傳導(dǎo)分子變化的角度來闡釋麻醉后學(xué)習(xí)空間能力的改變。實(shí)驗(yàn)中觀察到麻醉后大鼠海馬組織中RhoA 表達(dá)增高，麻醉后72 h恢復(fù)正常水平，說明異氟醚吸入麻醉后，大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元處于活躍狀態(tài)。 麻醉24 h 后RhoA 表達(dá)增加，說明RhoA 介導(dǎo)的突觸塌陷占主要地位，新的神經(jīng)突觸的建立處于抑制狀態(tài)，麻醉72 h 后表達(dá)有所恢復(fù)，說明新的突觸生長已經(jīng)恢復(fù)到麻醉前水平，而突觸的塌陷可能是神經(jīng)細(xì)胞重塑的表現(xiàn)。異氟醚麻醉后老年大鼠短期內(nèi)認(rèn)知能力受損，很可能是由于異氟醚麻醉對RhoA 表達(dá)的影響干擾了突觸偽足的形成與塌陷。神經(jīng)形態(tài)學(xué)的變化與神經(jīng)傳導(dǎo)功能具有重要的相關(guān)性，異氟醚影響海馬區(qū)Rho 蛋白家族信號傳導(dǎo)分子變化所介導(dǎo)的神經(jīng)突觸形態(tài)學(xué)改變很可能是學(xué)習(xí)記憶能力的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。

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