納秒脈沖電場消融乳腺癌的實驗研究

謝貴林 陳璐艷 陳新華 溫 浩 陳新梅

1.浙江省紹興第二醫(yī)院普外科，浙江紹興 312000；2.浙江大學(xué)第一附屬醫(yī)院普外科，浙江杭州 310000；3.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院普外科，新疆烏魯木齊 830054；4.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東濟南 250355

乳腺癌成為威脅女性的重大健康問題[1]。 根據(jù)我國2014 年腫瘤年報， 乳腺癌發(fā)病率和病死率持續(xù)增高[2]。MDA-MB-231 可以用于制作研究高侵襲乳癌細胞的細胞模型和動物模型[3]。目前多學(xué)科聯(lián)合治療是乳腺癌的主要方法[4]。根據(jù)目前消融介入技術(shù)的發(fā)展，微創(chuàng)消融也逐漸進入乳腺癌的綜合治療計劃中。脈沖場強可以引起電穿孔[5]，電穿孔不僅提高細胞膜對化療藥物的滲透率，增強化療藥物細胞毒性，還能通過降低化療藥物的使用劑量從而減小對正常細胞的毒副作用。而納秒脈沖是不同于電穿孔技術(shù)的最新一代電脈沖消融技術(shù)。 納秒脈沖引起細胞膜的微孔出現(xiàn)，最終形成細胞凋亡[6-7]。避免了嚴(yán)重的炎性反應(yīng)[8]，凋亡最初是在胚胎[9]及免疫系統(tǒng)[10]發(fā)育中發(fā)現(xiàn)。 而在腫瘤治療中凋亡產(chǎn)生則意味著腫瘤被消滅而機體未被傷害。Caspase 是凋亡發(fā)生的一個重要分子標(biāo)志[11-13]，在本實驗中納秒級脈單獨治療腫瘤，避免了化療副作用。

納秒脈沖在美國已經(jīng)開展皮膚基底細胞癌的臨床前期試驗，在政府網(wǎng)站上可見其登記號碼Clinicaltrials.gov ID：NCT01463709）。 脈沖治療儀器已經(jīng)產(chǎn)業(yè)化，AngioDynamics 公司已將該治療儀用于首例早期肝臟腫瘤的治療中，它可以在誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的同時抑制新生血管的形成，從而防止腫瘤的復(fù)發(fā)[14]。 納秒脈沖的波長要遠小于微妙脈沖，是一種非熱生物效應(yīng)及非藥物依賴性治療方法， 具有良好的應(yīng)用前景。本實驗旨在觀察nsPEFs 對于乳腺癌細胞的消融效果，對乳腺癌細胞MDA-MB-231 的分子作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株及抗體

人乳腺癌細胞株MDA-MB-231 由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院多器官聯(lián)合移植實驗室提供，含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基中37℃，5%CO2下培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.2 nsPEFs 治療

納秒脈沖發(fā)生器由杭州睿笛生物科技有限公司制造NANOABLATION 腫瘤消融儀器。 2.5×106個細胞放置于電極杯中治療。治療后的細胞置于培養(yǎng)箱中孵育1 h 后進行相關(guān)實驗。

1.3 CCK-8 法檢測細胞活性

細胞活性由Cell Counting Kit 檢測， 用黃色吸光度值反映活細胞數(shù)量。

1.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡變化

采用100 個脈沖、300 ns，0、20、40、60 kV/cm 的不同場強的納秒脈沖對乳腺癌細胞進行電擊， 其中0 kV/cm 為對照組，余為實驗組。所有經(jīng)過電擊治療的細胞孵育1 h 后，收集細胞，通過碘化丙啶（PI）染色法檢測細胞凋亡，同時設(shè)未作任何處理的空白對照。

1.5 流式細胞儀檢測細胞周期

采用100 個脈沖、300 ns，0、20、40、60 kV/cm 的不同場強的納秒脈沖對乳腺癌細胞進行電擊，所有經(jīng)過電擊治療的細胞孵育1 h 后，收集細胞，通過PI 染色法檢測細胞凋亡，并且第一組實驗進行細胞周期檢測。 本實驗電鏡標(biāo)本送往南京軍區(qū)總醫(yī)院病理科檢測，透射電鏡觀察細胞形態(tài)變化。

1.6 細胞超微結(jié)構(gòu)變化

采用100 個脈沖、300 ns，0、20、40、60 kV/cm 的不同場強的納秒脈沖對乳腺癌細胞進行電擊，所有經(jīng)過電擊治療的細胞孵育1 h 后，收集細胞，戊二醛固定，送往南京軍區(qū)總醫(yī)院病理科通過透射電鏡結(jié)果觀察細胞形態(tài)變化。

1.7 JC-1 實驗檢測線粒膜電位變化

經(jīng)過電擊的細胞制成細胞懸液。 用BD 公司線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）進行檢查。 用JC-1 從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變作為細胞凋亡早期的一個標(biāo)志。

1.8 動物模型的制作

本實驗使用的是C57B16 小鼠乳腺癌荷瘤模型，接種腫瘤細胞后連續(xù)測量腫瘤生長及長寬高3 個參數(shù)， 并且在第0、1、2 天分別給予300 ns，40 kV/cm，100 個脈沖的電擊，然后進行體積的比較。

圖1 乳腺癌小鼠模型的制作及其B 超

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析， 計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 采用CCK-8 法檢測經(jīng)nsPEFs 處理后的細胞活性

不同場強（0、20、40、60 kv/cm）的nsPEFs 作用于人乳腺癌細胞MDA-MB-231 后， 細胞分別培養(yǎng)24、48 h 和72 h，然后使用CCK-8 檢測細胞活性。結(jié)果表明：隨著脈沖場強的增加，細胞活性明顯降低，且與對照組比較（0 kV/cm），20、40、60 kV/cm 各場強能顯著抑制腫瘤細胞的活性（P ＜0.01），各實驗組組間比較，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.01）（圖2），其中40 kV/cm能達到最大抑制率被定為最佳治療參數(shù)， 增高場強到60 kV/cm 后不能再進一步提高抑制率；同一場強作用于細胞后，隨著培養(yǎng)時間的增加，細胞活性也明顯降低。

圖2 不同場強的納秒脈沖對乳腺癌細胞的抑制情況

2.2 采用流式細胞檢測經(jīng)nsPEFs 處理后細胞早期凋亡情況

在100 個脈沖，300 ns 條件下，與0 kV/cm 組比較，細胞的早期凋亡率在20 kV/cm 的場強時明顯升高（P ＜0.01），在40 kV/cm 和60 kV/cm 時呈逐漸降低趨勢。 相反， 細胞的壞死率隨著場強的增加（0、20、40、60 kV/cm），呈持續(xù)性升高趨勢，且為劑量依賴性（P ＜0.01）（圖3）。 結(jié)果表明，伴隨著納秒脈沖電場的強度增加，脈沖誘導(dǎo)的細胞死亡主要表現(xiàn)為從早期凋亡至晚期凋亡或細胞壞死，呈劑量依賴性。

2.3 采用流式細胞檢測經(jīng)nsPEFs 處理后細胞周期的改變

經(jīng)過納秒脈沖（300ns，100 個脈沖，0、20、40、60kV/cm）治療后，M 期的細胞明顯減少，由于M 期可以反映細胞增殖的能力， 因此可以說明細胞增殖被明顯抑制，但是此結(jié)果在各電場強度之間差異不明顯，說明不具有劑量依賴性。 見圖4。

圖3 不同強度納秒脈沖治療后細胞凋亡情況

2.4 透射電鏡（TEM）觀察乳腺癌細胞經(jīng)納秒脈沖電擊后凋亡情況

在對照組中（0 kV/cm），幾乎未見到凋亡細胞。隨著劑量增高，乳腺癌細胞開始出現(xiàn)早期凋亡；升高到40 kV/cm 時，出現(xiàn)變性改變；而60 kV/cm 則引起細胞壞死。 見圖5。

2.5 JC-1 實驗結(jié)果

圖4 不同場強的納秒脈沖治療后細胞周期的改變

圖5 不同場強的納秒脈沖治療后細胞形態(tài)學(xué)的改變

脈沖治療后，細胞沒有遷移，提示JC-1 單體穩(wěn)定存在。 60 kV/cm 條件下增加脈沖個數(shù)，導(dǎo)致JC-1 分布遷移，凋亡細胞增多，脈沖個數(shù)由2 個增加至5 個后遷移程度最大。 提示納秒脈沖增多，能夠引起細胞線粒體膜電位下降。 見圖6。

圖6 60 kV/cm 納秒脈沖治療后細胞線粒體膜電位下降情況

2.6 納秒脈沖對C57B16 小鼠腫瘤的治療消融

在C57B16 小鼠實驗上，接種人乳腺癌細胞后對照組腫瘤隨著時間的增加而明顯增大。 經(jīng)過連續(xù)3 d電擊治療后的實驗組小鼠腫瘤與對照組比較生長明顯減慢，腫瘤未出現(xiàn)再次生長或復(fù)發(fā)。 見圖7～8。

3 討論

圖7 各組腫瘤大小對比情況

圖8 不同時間各組小鼠乳腺腫瘤大小變化情況

乳腺癌在全球范圍內(nèi)仍然是導(dǎo)致女性死亡的重要原因之一[16]。 乳腺癌是一種全身性疾病的理念已被廣泛接受，合理的綜合治療是獲得乳腺癌長期生存的重要手段。 目前其主要治療方法有手術(shù)、放療和化療等。 納秒脈沖是脈沖電場技術(shù)的進一步發(fā)展，它將脈寬降到納秒級以下的同時提高場強 （＞10 kV/cm）[17]，它不會引起明顯的電穿孔現(xiàn)象[18]， 但是細胞出現(xiàn)微孔，形成凋亡，與化療及放療比較，納秒脈沖是一可以局部使用且不產(chǎn)熱的消融手段。其作用的效果根據(jù)脈沖的個數(shù)，脈寬以及場強等因素決定。 不同類型的細胞[19-20]以及不同的細胞周期[21]對于納秒脈沖的敏感性均不相同。

首先選擇的參數(shù)是100 個脈沖，300 ns 脈寬，場強為0、20、40、60 kV/cm 的4 個實驗組， 這個參數(shù)設(shè)置是根據(jù)皮膚黑色素瘤治療中確認(rèn)的有效參數(shù)，在本次實驗中，CCK-8 實驗證實了這個皮膚腫瘤治療參數(shù)在乳腺癌中也有效，同時還發(fā)現(xiàn)納秒脈沖在抑制細胞活性，阻斷細胞于M 期，減少細胞增長，誘導(dǎo)細胞凋亡上具有顯著的效果。 在最高的電場強作用下（60 kV/cm），并沒有觀察到細胞質(zhì)膜的破裂和壞死，所以細胞的死亡至少在某一程度上是程序性的[21-22]而且，納秒脈沖還能有效地重排細胞骨架蛋白[23]以及導(dǎo)致DNA 斷裂[24-25]。 本實驗對量效關(guān)系進行了考察，如果納秒脈沖應(yīng)用于臨床，40 kV/cm 場強可以作為一個參考的參數(shù)。

本實驗從體內(nèi)和體外實驗兩個層面，從細胞的凋亡及線粒體膜電位改變等方面來觀察納秒脈沖作用于人乳腺癌細胞MDA-MB-231 后的效果。 本實驗發(fā)現(xiàn)，納秒脈沖對于人乳腺癌細胞具有較為顯著的治療作用， 但治療參數(shù)的選擇是決定消融效果的重要因素，治療劑量并非越高越好，過強過多的治療會引起細胞完全壞死， 而在達到一定參數(shù)時例如40 kV/cm是對本實驗接種的荷瘤小鼠的最佳治療參數(shù)。 本實驗的局限是未對細胞核內(nèi)發(fā)生的分子事件進行進一步追蹤[26-28]。 尤其是NF-κB 信號通路需要進一步的研究。

本實驗從細胞及動物實驗等證實了納秒脈沖可以誘導(dǎo)人乳腺癌細胞MDA-MB-231 的凋亡， 可能是通過激活Caspase 信號通路，是一種有效的治療乳腺癌的方法。

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