重樓愈傷組織的抑菌作用研究

劉銀花，王躍華，何新友，陳 燕，唐 旭，梅 英，黃 鵬

(1.四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610101;2.成都大學(xué)生物工程學(xué)院，四川 成都 610106;3.四川金土地中藥材種植集團(tuán)有限公司，四川 成都 611130)

重樓愈傷組織的抑菌作用研究

劉銀花1，2，王躍華2，何新友3，陳 燕3，唐 旭1，2，梅 英2，黃 鵬2

(1.四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610101;2.成都大學(xué)生物工程學(xué)院，四川 成都 610106;3.四川金土地中藥材種植集團(tuán)有限公司，四川 成都 611130)

目的:探究重樓根莖誘導(dǎo)獲得愈傷組織的抑菌作用，為中藥資源的有效開(kāi)發(fā)利用提供一條重要途徑.方法:以宋內(nèi)氏痢疾桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌為受試菌，頭孢噻肟鈉為對(duì)照藥，采用試管稀釋法和瓊脂平板擴(kuò)散法對(duì)重樓根莖愈傷組織提取物的抑菌作用進(jìn)行研究，并比較它們的最小抑菌濃度.結(jié)果:重樓根莖愈傷組織提取物對(duì)宋內(nèi)氏痢疾桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌的最小抑菌濃度分別為15.63 mg/mL、31.25 mg/mL、31.25 mg/mL.結(jié)論:重樓根莖愈傷組織提取物具有一定的抑菌作用，為其臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù).

重樓;愈傷組織;抑菌

0 引言

藥用植物重樓，為百合科植物云南重樓和七葉一枝花的干燥根莖.目前，重樓屬全球共有24種，分布于歐亞大陸的熱帶及溫帶地區(qū)，我國(guó)種類(lèi)最多，有19種，全國(guó)都有分布，尤以西南各省區(qū)種類(lèi)和資源最為豐富［1］.

重樓根莖部位含有重樓皂苷等成分，其具有抗腫瘤、止血、抗菌、消炎、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化及保護(hù)肝臟與腎臟等功效［2］.研究發(fā)現(xiàn)，滇重樓對(duì)金黃色葡萄球菌、普通變形桿菌、銅綠假單胞菌等8種能引起癤、癰、刨傷感染、潰瘍的細(xì)菌具有很好的抑菌作用［3］.同時(shí)，重樓也是多種中成藥的重要成分，制藥工業(yè)對(duì)重樓的需求量逐年遞增，以致供不應(yīng)求.巨大的需求缺口驅(qū)動(dòng)商品藥材價(jià)格飛漲，導(dǎo)致亂采濫挖的現(xiàn)象屢禁不止，使得道地產(chǎn)區(qū)野生重樓資源嚴(yán)重枯竭瀕臨滅絕.植物組織培養(yǎng)技術(shù)是一種可以使重樓快速繁育的有效途徑之一，通過(guò)組織培養(yǎng)技術(shù)快速獲得大量愈傷組織，可在一定程度上解決重樓藥材供不應(yīng)求的局面.本研究為了探討重樓根莖誘導(dǎo)獲得的愈傷組織是否同重樓根莖藥材一樣具有很好的抑菌作用，采用重樓根莖為外植體來(lái)誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，并進(jìn)一步分析了愈傷組織提取物對(duì)宋內(nèi)氏痢疾桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌3種細(xì)菌的抑菌作用，以期為中藥資源的有效開(kāi)發(fā)利用提供一條重要途徑.

1 材料

實(shí)驗(yàn)所用的重樓植物采集自四川省都江堰市，實(shí)驗(yàn)時(shí)，選取生長(zhǎng)健康、無(wú)病蟲(chóng)害的重樓植物根莖為外植體誘導(dǎo)獲得愈傷組織.實(shí)驗(yàn)菌種由成都大學(xué)生物產(chǎn)業(yè)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供.

2 方法

2.1 愈傷組織誘導(dǎo)

選取生長(zhǎng)健康、無(wú)病蟲(chóng)害的重樓植物的根莖，先用流水洗凈泥土后吸干表面的水分，然后切除根莖上的不定根，再在超凈工作臺(tái)上切取根莖前端帶芽體部分的第1個(gè)莖節(jié)，先用0.1%升汞消毒9 min，然后用無(wú)菌水沖洗5次，切除根莖上的芽體，最后將該根莖莖節(jié)切成1.0 cm3大小后接入MS+6-BA 1.0 mg·L－1+NAA 1.5 mg·L－1+2，4-D 1.5 mg·L－1的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，將其置于6℃的冰箱中低溫處理15 d，再轉(zhuǎn)放在培養(yǎng)溫度為22℃、每天光照6 h、光照強(qiáng)度為1 000 lx的條件下培養(yǎng)55 d［4］.

2.2 重樓根莖愈傷組織提取物的制備

取誘導(dǎo)獲得的重樓愈傷組織，自然干燥后置于60℃烘箱中烘至恒重，研成細(xì)粉后放置于干燥器中備用.稱取愈傷組織粉末100 g加入無(wú)水甲醇溶液2 500 mL，不斷攪拌下浸提24 h.重復(fù)3次，合并濾液，并在真空負(fù)壓條件下，加熱濃縮成浸膏，所得浸膏為5.0 g，然后加入蒸餾水10 mL使浸膏溶解，配置成濃度為500 mg/mL的藥液.靜置，置冰箱備用.

2.3 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配置

稱取牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，加入蒸餾水定容至1 L，微溫溶解后調(diào)節(jié)pH值為7.0～7.2，煮沸，貯存于錐形瓶中，121℃高壓滅菌20 min.另配置1 L牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，即不加瓊脂.

2.4 菌種活化及抑菌濃度檢測(cè)

選用宋內(nèi)氏痢疾桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌3種細(xì)菌為受試菌，實(shí)驗(yàn)菌種經(jīng)傳代培養(yǎng)后，接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，置于搖床上，震蕩18 h.經(jīng)比濁法測(cè)定細(xì)菌數(shù)為108CFU/mL，稀釋至105CFU/mL，通過(guò)傾注平板法計(jì)數(shù).實(shí)驗(yàn)中，每1 mL液體培養(yǎng)基加入0.1 mL細(xì)菌液，37℃恒溫箱培養(yǎng)24 h，計(jì)數(shù)菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)即得最終實(shí)驗(yàn)濃度，其中，宋內(nèi)氏痢疾桿菌為3.3×105CFU/mL，金黃色葡萄球菌為2.4×105CFU/mL，銅綠假單胞菌為3.2×105CFU/mL.

2.5 試管稀釋法

取具有棉塞的試管9支并滅菌，編號(hào)后排列在試管架上，于每管中先加入已滅菌的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液2.0 mL，然后于第1管中加入滅菌的愈傷組織提取液2.0 mL，充分混勻后從中吸取2.0 mL加入第2管，同樣混勻后取2.0 mL加入第3管，依此類(lèi)推，直到第7管取出2 mL棄去，使成1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128，各管濃度分別為250.00 mg/mL，125.00 mg/mL、62.50 mg/mL、31.25 mg/mL、15.63 mg/mL、7.82 mg/mL、3.91 mg/mL.第8管不加藥物作對(duì)照，以便觀察培養(yǎng)基是否適合細(xì)菌生長(zhǎng).第9管中加入愈傷組織提取液2 mL，混合均勻取出2 mL棄去，不加細(xì)菌，以便觀察受試提取物是否有污染.每個(gè)稀釋倍數(shù)取3份樣，其中3份樣的每支試管中分別加入等量的宋內(nèi)氏痢疾桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌菌液各0.1 mL(菌液濃度為104CFU/mL)，將其置于恒溫箱中37℃培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果.若培養(yǎng)基混濁，表示細(xì)菌生長(zhǎng)，若培養(yǎng)基完全清亮，表示無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng).將未混濁管培養(yǎng)基轉(zhuǎn)種到瓊脂培養(yǎng)基平板上，仍無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)即表示該管對(duì)應(yīng)的藥液濃度即為其最小抑菌濃度(Minimal inhibition concentration，MIC).

2.6 瓊脂平板擴(kuò)散法(打孔法)

將21個(gè)直徑約90 mm，高約16～17 mm的潔凈干燥并滅菌的培養(yǎng)皿，分為3組，每組7個(gè).將已滅菌的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿，均勻攤布于皿中，放置在水平臺(tái)上，待其凝固后作為底層，每個(gè)培養(yǎng)皿底層厚度約為5 mm.另取牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基并分裝于3個(gè)潔凈干燥的錐形瓶中，每個(gè)錐形瓶中分裝培養(yǎng)基210 mL，經(jīng)高壓蒸汽滅菌后，向3個(gè)錐形瓶中分別加入宋內(nèi)氏痢疾桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌菌液各10 mL，輕輕晃動(dòng)使其混合均勻(菌液濃度約為104CFU/mL)，然后用無(wú)菌棉簽沾取菌液在5 mm厚的瓊脂平板上做均勻密集劃線，用6 mm孔徑打孔器打孔，每個(gè)培養(yǎng)皿中打3個(gè)孔，將每個(gè)濃度的供試藥液滴入每個(gè)培養(yǎng)皿中的其中一個(gè)孔內(nèi)，并做標(biāo)記.每個(gè)培養(yǎng)皿中其余2個(gè)小孔中分別加入頭孢噻肟鈉做陽(yáng)性對(duì)照，無(wú)菌水做陰性對(duì)照，約100 μL，然后將培養(yǎng)皿放置在37℃恒溫箱中24 h后觀察有無(wú)抑菌圈.

3 結(jié)果與分析

3.1 試管稀釋法對(duì)重樓根莖愈傷組織提取物的抑菌作用

試管稀釋法對(duì)重樓根莖愈傷組織提取物的抑菌作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示.

表1 試管稀釋法的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表1可知，重樓根莖愈傷組織提取物對(duì)宋內(nèi)氏痢疾桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌均有不同程度的抑菌作用，其抑菌作用大小主要取決于所用提取物的濃度.重樓根莖愈傷組織提取物對(duì)宋內(nèi)氏痢疾桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌的最小抑菌濃度分別為15.63 mg/mL、31.25 mg/mL、31.25 mg/mL.結(jié)果表明，重樓根莖愈傷組織提取物對(duì)宋內(nèi)氏痢疾桿菌的抑菌作用較強(qiáng)，對(duì)金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的抑菌作用明顯.

在無(wú)不當(dāng)操作，無(wú)其他外界細(xì)菌的侵染條件下，試管里的液體培養(yǎng)基本身是清澈明亮的.實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)一段時(shí)間后，如果培養(yǎng)基混濁，表示細(xì)菌生長(zhǎng)，若培養(yǎng)基完全清亮，表示無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng).同時(shí)，同種細(xì)菌在不同濃度的藥液條件下渾濁程度不同.藥物濃度越小，越渾濁.同種藥物濃度不同細(xì)菌的條件下，培養(yǎng)基的渾濁程度也不同，反映了不同細(xì)菌抗藥能力的不同.

實(shí)驗(yàn)中，試管培養(yǎng)基完全清亮的最大藥液濃度即為該細(xì)菌的最小抑菌濃度(MIC).MIC值越大，說(shuō)明重樓根莖愈傷組織提取物對(duì)該種細(xì)菌的抑菌作用越弱;反之，MIC值越小，說(shuō)明提取物的抑菌作用越強(qiáng).由重樓根莖愈傷組織提取物對(duì)3種細(xì)菌的最小抑菌濃度可以推測(cè)，重樓根莖愈傷組織提取物對(duì)宋內(nèi)氏痢疾桿菌的抑菌作用強(qiáng)于金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌.

實(shí)驗(yàn)中，不加藥液的無(wú)菌水陰性對(duì)照組均出現(xiàn)渾濁，表示均有細(xì)菌生長(zhǎng)，無(wú)菌水不起抑菌作用，消除干擾.不加藥液只加頭孢噻肟鈉的陽(yáng)性對(duì)照組均不出現(xiàn)渾濁，表示無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，頭孢噻肟鈉有很強(qiáng)的抑菌作用，可以此來(lái)對(duì)比提取液的抑菌效果.

3.2 瓊脂平板擴(kuò)散法對(duì)重樓根莖愈傷組織提取物的抑菌作用

瓊脂平均法對(duì)重樓根莖愈傷組織提取物的抑菌作用如表2所示.

表2 瓊脂平板擴(kuò)散法的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，高于MIC的藥液濃度所對(duì)應(yīng)的抑菌圈都很明顯，而且藥液濃度越高，抑菌圈直徑越大，說(shuō)明藥液濃度與抑菌作用的高低成正相關(guān).而低于MIC的藥液濃度，由于其抑菌作用已經(jīng)很微弱，其所對(duì)應(yīng)的抑菌圈難以辨識(shí).

由實(shí)驗(yàn)觀察知，同一濃度的重樓根莖愈傷組織提取物對(duì)宋內(nèi)氏痢疾桿菌的抑菌圈直徑大于另2種細(xì)菌.由此可知，同藥物濃度的條件下抑菌圈較大的，藥物對(duì)對(duì)應(yīng)的細(xì)菌抑菌作用更強(qiáng)，同時(shí)MIC值則較小;而抑菌圈小的，藥物對(duì)對(duì)應(yīng)的細(xì)菌抑菌作用則較弱，其MIC值就較大.

用無(wú)菌水做的陰性對(duì)照組，所有的實(shí)驗(yàn)細(xì)菌生長(zhǎng)良好，無(wú)抑菌圈，即沒(méi)有抑菌效果.由此證明，無(wú)菌水對(duì)細(xì)菌的影響很小，可以忽略.

用頭孢噻肟鈉溶液做的陽(yáng)性對(duì)照，其抑菌圈最明顯，抑菌效果最好.對(duì)比重樓根莖愈傷組織提取物與頭孢噻肟鈉溶液的抑菌效果強(qiáng)弱發(fā)現(xiàn)，重樓根莖愈傷組織提取物的抑菌效果不如頭孢噻肟鈉溶液的抑菌效果強(qiáng).

4 結(jié)論

本研究以宋內(nèi)氏痢疾桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌作為受試菌，對(duì)重樓根莖愈傷組織提取物的抑菌作用做了探討，旨在探索重樓根莖愈傷組織提取物的最小抑菌濃度及其抑菌圈的特征.通過(guò)采用試管稀釋法和瓊脂平板擴(kuò)散法對(duì)重樓根莖愈傷組織提取物進(jìn)行的抑菌實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，重樓根莖愈傷組織提取物對(duì)宋內(nèi)氏痢疾桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的MIC分別為15.63 mg/mL、31.25 mg/mL、31.25 mg/mL，說(shuō)明其對(duì)宋內(nèi)氏痢疾桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌均有一定程度的抑菌作用，且對(duì)宋內(nèi)氏痢疾桿菌的抑菌能力更強(qiáng).該結(jié)果為以后進(jìn)一步深入研究重樓愈傷組織藥用價(jià)值提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)數(shù)據(jù).

本實(shí)驗(yàn)采用無(wú)菌水作為陰性對(duì)照組，旨在說(shuō)明無(wú)菌水無(wú)抑菌作用，因此無(wú)菌水對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響極小，可以忽略不計(jì);用頭孢噻肟鈉溶液作為陽(yáng)性對(duì)照組，旨在對(duì)比中草藥與抗生素的抑菌作用大小.實(shí)驗(yàn)結(jié)果雖然表明相同濃度重樓根莖愈傷組織提取物的抑菌圈不如抗生素明顯，但是僅從體外抑菌的實(shí)驗(yàn)效果去對(duì)比中藥與抗生素在人體中抗感染的作用，這是不科學(xué)的.人體內(nèi)部結(jié)構(gòu)復(fù)雜，影響抑菌的方面現(xiàn)在尚未完全明了.所以，人們應(yīng)該用全新的觀點(diǎn)和方法去認(rèn)識(shí)中藥抗感染的臨床療效.中藥抗感染的作用與單一的西藥抗感染的作用不同，其中的重要一點(diǎn)就是能夠增加機(jī)體的免疫功能.因此，研究和開(kāi)發(fā)抗菌中藥對(duì)解決耐藥菌株的產(chǎn)生和抗生素短缺問(wèn)題具有重要現(xiàn)實(shí)意義.

需說(shuō)明的是，重樓根莖愈傷組織提取物在體外對(duì)宋內(nèi)氏痢疾桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌都有一定的抑制作用，但是由于人體結(jié)構(gòu)和機(jī)能的復(fù)雜性，其在體內(nèi)是否仍具有抑菌作用以及抑菌作用的強(qiáng)弱還有待進(jìn)一步研究.事實(shí)上，藥物功能和作用機(jī)制的研究，歸根到底是對(duì)于其不同階段結(jié)構(gòu)變化的研究.而結(jié)構(gòu)決定功能，所以要想深入探究藥物的作用機(jī)制，需要科研人員在分子水平上對(duì)藥物、靶點(diǎn)及二者相互作用的結(jié)構(gòu)進(jìn)行闡述.此外，由于中藥的組成成分復(fù)雜，對(duì)于在人體內(nèi)是通過(guò)各個(gè)中藥成分的靶向作用，還是通過(guò)相互化合產(chǎn)生一種新的化學(xué)物質(zhì)來(lái)抑殺微生物，必須立足于中醫(yī)基礎(chǔ)理論，采用現(xiàn)代分子藥理學(xué)及生物學(xué)的知識(shí)和方法來(lái)深入探索和研究中藥.

［1］胡光萬(wàn)，雷立公.出自深山的良藥—重樓［J］.植物雜志，2002，11(3):16.

［2］何含杰，章懷云，陳麗莉，等.重樓皂苷的藥理作用和臨床應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.中藥材，2014，37(3):527 －530.

［3］林逢春.滇重樓抑菌效果研究［J］.健康必讀(下半月)，2010，1(6):141 －142.

［4］楊林.海河流域底泥中殘留藥物與個(gè)人護(hù)理品的檢測(cè)及生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)分析［D］.長(zhǎng)沙:中南林業(yè)科技大學(xué)，2011.

［5］秦睿玲，徐占云，李春紅，等.抗耐藥菌中藥的研究進(jìn)展［J］.養(yǎng)禽與禽病防治，2010，29(3):2 －4.

Antimicrobial Effect of Paris Polyphylla Callus

LIU Yinhua1，2，WANG Yuehua2，HE Xinyou3，CHEN Yan3，TANG Xu1，2，MEI Ying2，HUANG Peng2
(1.College of Life Science，Sichuan Normal University，Chengdu 610101，China;2.School of Bioengineering，Chengdu University，Chengdu 610106，China;3.Sichuan Gold-land Chinese Medicinal Materials Planting Group Co.，Ltd.，Chengdu 611130，China)

This paper explores the antimicrobial action of callus from Paris polyphylla rhizome to provide an important way for effective development and utilization of chinese medicine resources.We used Shigella sonnei，Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa as the tested bacteria，and took Cefotaxime Sodium as the contrast drug.We used the tube broth method and the agar plate diffusion method to research the antimicrobial action of the extract from Paris polyphylla rhizome callus，and compared the minimal inhibition concentrations of the three kinds of bacteria.The experimental results showed that the extract from Paris polyphylla rhizome callus had some antimicrobial effect，and the three minimal inhibition concentrations of Shigella sonnei，Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa were 15.63 mg/mL，31.25 mg/mL and 31.25 mg/mL respectively.We conclude that the Paris polyphylla rhizome callus extract has some antimicrobial effect，which provides the experimental basis for its clinical application.

Paris polyphylla;callus;antimicrobial

R282.71;S567.23+9

A

1004－5422(2015)01－0012－04

2015－01－14.

四川省科技廳科技支撐計(jì)劃(2014ZC2103)、成都市科技局科技計(jì)劃(2014)資助項(xiàng)目.

劉銀花(1990—)，女，碩士研究生，從事藥用植物生物技術(shù)研究.