大豆總皂甙對(duì)運(yùn)動(dòng)力竭大鼠肝臟自由基代謝的影響

劉志剛， 唐文坤， 徐廣艷， 陳寶平， 熊正英

(1.玉溪師范學(xué)院 體育學(xué)院，云南 玉溪 653100；2.陜西師范大學(xué) 體育學(xué)院，陜西 西安 710062)

大豆總皂甙(total soy saponins，TS)屬于五環(huán)三萜的糖甙，存在于大豆中，具有多種生物學(xué)活性.按照皂甙元結(jié)構(gòu)的不同可分為A組、B組、E組和DDMP皂甙.其中A組皂甙根據(jù)其配基R1、R2、R3的不同又可分為Aa-Ah八種；B組又可分為Ba、Bb、Bc、Bb′、Bc′；E組可分為Bd和Be；DDMP分為Ag、Bg、Ba、Гg和γa(如圖1、圖2).

圖1 A組皂甙結(jié)構(gòu) 圖2 B組、E組和DDMP皂甙

大豆總皂甙具有多種生物學(xué)活性，如抗氧化、增強(qiáng)免疫等.可以使小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬能力加強(qiáng)，體液免疫和細(xì)胞免疫都不同程度地得到增強(qiáng)，并能通過抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的活性來顯著降低糖尿病大鼠的血糖水平，明顯改善其糖耐量，同時(shí)也能改善正常大鼠葡萄糖耐量.大豆總皂甙還能明顯抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，保護(hù)正常細(xì)胞[1]，抑制多種病毒如單純皰疹病毒、人巨細(xì)胞病毒、脊髓灰質(zhì)炎、流感、麻疹、腮腺炎及柯薩奇病毒(Coxsachie virus，CV)以及顯著的抗衰老作用.

1 材料與方法

1.1 材料

選用兩月齡Sprague-Dawley(SD)雄性健康大鼠32只，體重(200±10)g.由西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(動(dòng)物合格證編號(hào)：陜醫(yī)動(dòng)字第08-005)，同時(shí)購(gòu)入基礎(chǔ)飼料.

1.2 主要儀器

日立7060全自動(dòng)生化分析儀；上海精科721B型分光光度計(jì)；上海精科752B型分光光度計(jì)；上海安亭TGL-16G冷凍離心機(jī)；天津泰斯特DK-98-1A恒溫水浴鍋；杭州段氏DSPT-202型大鼠跑臺(tái).

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組：SD大鼠隨機(jī)分成4組，分別為安靜組(Control group)、安靜加藥組(TS group)、力竭組(Exhausted group)、力竭加藥組(TS exhausted group).每組8只，分籠飼養(yǎng)，各組大鼠自由飲水、進(jìn)食.飼養(yǎng)環(huán)境溫度(25±3)℃，相對(duì)濕度45%～65%，噪聲不大于50 dB，自然光照明.

1.3.2 給藥：大豆總皂甙購(gòu)自華北制藥股份有限公司，藥品純度90%，灰分10%.安靜加藥組和力竭加藥組給藥劑量為20 mg/kg體重，以2 mL生理鹽水溶解后，在每天固定的時(shí)間(9∶00-9∶30)經(jīng)口腔灌注給藥，每日一次，持續(xù)給藥時(shí)間為2周.給藥期間每3天稱體重一次，及時(shí)按體重變化調(diào)整給藥量.力竭組每次灌注相同劑量的生理鹽水，安靜組不作任何處理.

1.3.3 造模：采用一次力竭急性實(shí)驗(yàn).適應(yīng)環(huán)境3 d后開始給藥，平時(shí)不進(jìn)行任何訓(xùn)練，給藥2周后力竭組和力竭給藥組進(jìn)行力竭實(shí)驗(yàn).進(jìn)行一次跑臺(tái)力竭性運(yùn)動(dòng)，跑臺(tái)設(shè)定速度30 m/min，跑臺(tái)不加坡度，并在3 min內(nèi)逐漸增加到預(yù)定的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度(30 m/min).記錄力竭距離和時(shí)間.判斷力竭標(biāo)準(zhǔn)：大鼠跟不上跑臺(tái)速度，蹲坐在籠后壁，后肢隨傳動(dòng)皮帶明顯后拖，腹部著地，四肢橫向伸展，電流刺激毛刷驅(qū)趕無效.其行為特征為呼吸急促、神情疲倦，呈俯臥位垂頭，對(duì)刺激反應(yīng)遲鈍，四肢不愿著傳送帶且顫抖明顯.

1.3.4 取材和測(cè)試

大鼠運(yùn)動(dòng)至力竭后立即用乙醚麻醉，用大剪刀剪斷頭部處死，剖開腹腔，迅速取其肝臟.并以預(yù)冷的生理鹽水沖洗殘余血液，濾紙吸干，放置于標(biāo)記好的潔凈培養(yǎng)皿中.用手術(shù)刀切下并稱取適量肝臟組織，加入4 ℃的生理鹽水和適量石英砂進(jìn)行研磨，按W(g):V(mL)=1∶9制成10%組織勻漿，倒入一次性離心管中，進(jìn)行3 000 rpm、5 min離心沉淀后取上清進(jìn)行指標(biāo)測(cè)試.

1.4 指標(biāo)測(cè)試方法

指標(biāo)測(cè)試均采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒進(jìn)行.

1.5 數(shù)據(jù)處理

測(cè)試數(shù)據(jù)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS18.0進(jìn)行處理，結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(M±S)表示.組間進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.并計(jì)算效應(yīng)量Cohen's d值.Cohen's d值在0.2、0.5附近和大于0.8時(shí)分別代表小、中、大效應(yīng).

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 運(yùn)動(dòng)大鼠力竭時(shí)間比較

表1 TS對(duì)運(yùn)動(dòng)大鼠力竭時(shí)間的影響(n=8)

*與力竭組相比，p<0.05.

由表1可知，TS能明顯延長(zhǎng)運(yùn)動(dòng)大鼠的力竭時(shí)間(P<0.05)，增長(zhǎng)率為20.62%，t檢驗(yàn)結(jié)果具有大的效應(yīng)量(Cohen's d=1.07)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2.2 指標(biāo)測(cè)試結(jié)果

表2 TS對(duì)運(yùn)動(dòng)大鼠肝臟組織抗氧化能力和血清GSH-Px、ALT的影響(n=8)

與安靜組相比，▲p<0.05；▲▲p<0.01；與力竭組相比，△p<0.05；Cohen's d在0.2、0.5附近和大于0.8時(shí)分別代表小、中、大效應(yīng).

由表2可知，安靜狀態(tài)下，TS顯著提高了大鼠肝臟SOD水平，極顯著提高肝臟GSH水平,降低其MDA含量；力竭運(yùn)動(dòng)狀態(tài)下，TS顯著提高大鼠肝臟SOD、CAT、GSH和T-AOC水平、血清GSH-Px水平，并降低肝臟MDA含量和血清ALT.未經(jīng)過TS灌胃的大鼠力竭運(yùn)動(dòng)后肝臟SOD、GSH、T-AOC顯著降低，MDA顯著升高.

根據(jù)Cohen的標(biāo)準(zhǔn)，d值越大t檢驗(yàn)的結(jié)果越可靠.通常把d值小于0.2時(shí)認(rèn)為具有很小的效應(yīng)量，即t檢驗(yàn)結(jié)果可靠性較低；而d值在0.5附近具有中等效應(yīng)量；d值大于0.8時(shí)具有大的效應(yīng)量，即t檢驗(yàn)結(jié)果具有比較大的可靠性.

3 討 論

通常情況下，機(jī)體內(nèi)有兩類自由基防御系統(tǒng)，即酶促防御系統(tǒng)和非酶促防御系統(tǒng).前者如SOD、CAT、GSH-Px、GR；后者如維生素E、維生素C、GSH等.一般情況下，體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除之間保持動(dòng)態(tài)平衡，但在力竭性運(yùn)動(dòng)的情況下，體內(nèi)氧化應(yīng)激加強(qiáng)，自由基大量產(chǎn)生，線粒體內(nèi)膜呼吸鏈電子漏等會(huì)使自由基產(chǎn)生和消除之間的平衡被打破，自由基的氧化能力超過機(jī)體的抗氧化能力而導(dǎo)致氧化脅迫和氧化損傷，引起生物膜脂質(zhì)過氧化、攻擊細(xì)胞內(nèi)酶、蛋白質(zhì)、核酸引起生物大分子交聯(lián)、變性最后導(dǎo)致細(xì)胞死亡或凋亡，組織損傷和疾病發(fā)生[2-4].而SOD、CAT、GSH-Px、GR是機(jī)體最重要的抗氧化酶類，各抗氧化酶相互配合可以清除和淬滅過多的自由基.正常生理和適宜運(yùn)動(dòng)負(fù)荷情況下，抗氧化酶系通過各自的作用途徑使機(jī)體自由基的生成與清除處于動(dòng)態(tài)平衡：

但機(jī)體在進(jìn)行力竭運(yùn)動(dòng)的情況下，自由基在體內(nèi)的生成速率超過機(jī)體的清除能力，使自身的自由基代謝平衡失調(diào)，以至自由基在體內(nèi)大量堆積并增強(qiáng)脂質(zhì)過氧化水平，從而導(dǎo)致膜脂質(zhì)、核酸以及蛋白質(zhì)大分子的氧化損傷，膜損傷進(jìn)一步導(dǎo)致膜功能障礙，通透性增大，膜蛋白功能失調(diào)，最終誘發(fā)運(yùn)動(dòng)性疲勞.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，力竭性運(yùn)動(dòng)使血清ALT大幅升高，說明肝細(xì)胞通透性增大或受到損傷[5]，其可能機(jī)制是：(1)運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致體內(nèi)血流重新分配，使肝臟產(chǎn)生缺血-再灌注損傷并可能導(dǎo)致鈣超載，進(jìn)一步使氧化磷酸化解偶聯(lián)，并導(dǎo)致ATP含量下降.(2)肌酸激酶(Creatine Kinase，CK)活性降低，AMP生成增多，在腺嘌呤脫氨酶的作用下促使腺嘌呤水解脫氨生成次黃嘌呤核苷酸(IMP)，然后經(jīng)5'-核苷酸酶及核苷酶的作用生成次黃嘌呤.次黃嘌呤又在次黃嘌呤氧化酶的作用下，生成過量的超氧陰離子自由基，可引起膜脂質(zhì)過氧化水平顯著上升，損害肝細(xì)胞膜功能.(3)大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)使大鼠自由基代謝加強(qiáng)，攝入的氧約有2%轉(zhuǎn)變成了氧自由基[6].自由基產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化作用，其產(chǎn)物丙二醛(MDA)使核酸、膜蛋白等大分子產(chǎn)生交聯(lián)，損害膜功能.過多的自由基不斷攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸，引起脂質(zhì)過氧化，使膜的流動(dòng)性降低，脆性增大，從而導(dǎo)致膜表面分子流動(dòng)力學(xué)發(fā)生改變.(4)膜內(nèi)部脂質(zhì)分子的變化引起膜孔隙增大，導(dǎo)致膜的通透性發(fā)生改變.嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致膜損傷.隨著膜的損傷，亞細(xì)胞器(如線粒體、高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng))的結(jié)構(gòu)亦遭到破壞，并導(dǎo)致一系列的細(xì)胞功能紊亂.(5)在膜的過氧化反應(yīng)中，激活了花生四烯酸代謝途徑，并生成白三烯、前列腺素等具有高活性的物質(zhì)，同時(shí)又生成了氧自由基，再次引發(fā)膜的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，形成正反饋，進(jìn)一步加重?fù)p傷組織細(xì)胞.(6)自由基還可作用于核酸引起堿基配對(duì)錯(cuò)誤，誘發(fā)基因突變，導(dǎo)致蛋白質(zhì)和酶的結(jié)構(gòu)變化及蛋白功能的改變和酶活性的降低.(7)力竭性運(yùn)動(dòng)大量消耗肝糖儲(chǔ)備，降低了肝臟的解毒能力.同時(shí)蛋白質(zhì)代謝加強(qiáng)產(chǎn)生的NH4+，超過肝臟的解毒能力而對(duì)肝臟產(chǎn)生毒害作用.脂肪酸不完全氧化產(chǎn)生過多的酮體會(huì)導(dǎo)致酮中毒.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TS顯著提高大鼠肝臟抗氧化酶活性，降低MDA水平.這可能與TS的護(hù)肝作用有關(guān).有研究顯示，TS對(duì)四氯化碳所致的肝損傷有保護(hù)作用.TS與葡萄糖醛酸結(jié)合后護(hù)肝作用增加，而單獨(dú)的葡萄糖醛酸卻沒有此作用[7-8]，這說明TS對(duì)四氯化碳導(dǎo)致的肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能異常有明顯的抑制作用.而實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示的力竭加藥組比力竭組血清ALT活性大幅降低也說明了TS對(duì)肝細(xì)胞的這種保護(hù)作用.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，力竭運(yùn)動(dòng)后，TS明顯提高大鼠肝臟SOD、CAT、GSH、T-AOC及血清GSH-Px水平，降低MDA含量，且都具有較大的Cohen's d值.說明TS具有顯著的抗氧化能力，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化酶活性，降低自由基代謝產(chǎn)物MDA含量.推測(cè)這可能與TS直接清除自由基、并與它的多種生物學(xué)作用有關(guān).從結(jié)構(gòu)上看，TS富含酚羥基的母核可與自由基結(jié)合，形成了共振穩(wěn)定的半醌式結(jié)構(gòu)，中斷了自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，起到直接清除自由基的作用.有報(bào)道TS具有較強(qiáng)的體外總抗氧化能力和抗活性氧能力，可抑制肝組織脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，減輕肝線粒體膨脹程度[9]，抑制血漿和紅細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化作用，并能減少紅細(xì)胞溶血程度[10].能夠顯著抑制由Fe2+-H2O2誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂質(zhì)過氧化損傷和肝細(xì)胞線粒體過氧化脂質(zhì)的生成[11].日本學(xué)者Yoshiki 等對(duì)DDMP皂甙進(jìn)行了分子軌道法分析，認(rèn)為DDMP皂甙的抗氧化活性主要與C-6部位有關(guān)，明確指出該部位是活性氧的主要消除部位[12].TS提高力竭大鼠肝臟T-AOC水平，可能是因?yàn)門S通過抗氧化酶或直接淬滅自由基，減少肝臟的氧化應(yīng)激和促進(jìn)糖代謝的作用有關(guān).糖代謝加強(qiáng)為機(jī)體提供了大量的還原性物質(zhì)，減少了對(duì)還原性維生素、氨基酸和蛋白質(zhì)的消耗.TS清除自由基、保肝護(hù)肝的更多機(jī)制還需進(jìn)一步的工作與研究.

4 結(jié) 論

TS可以顯著提高安靜和力竭運(yùn)動(dòng)狀態(tài)下大鼠肝臟的抗氧化酶活性，保護(hù)肝細(xì)胞，降低肝內(nèi)自由基代謝水平和脂質(zhì)過氧化作用，降低血清ALT，對(duì)肝細(xì)胞和肝功能有明顯的保護(hù)作用，并能顯著提高大鼠的運(yùn)動(dòng)耐力.

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