嚙齒目中RNase4基因的分子進化研究

郎大田， 王磊， 羅家剛， 祁岑， 王忻

(1.昭通學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，云南 昭通 657000；2.云南省糧油科學(xué)研究院，云南 昆明 650033)

現(xiàn)存的生物都需要靠自身的進化來適應(yīng)變化的環(huán)境.基因型和基因數(shù)目的改變是適應(yīng)性進化的重要機制，其中基因復(fù)制為生物進化提供了原材料，是生物進化的動力源泉.隨著基因組學(xué)研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)越來越多的生物表型與基因復(fù)制有著密切的關(guān)系[1-14].

RNASE A基因超家族是研究分子進化的最佳模型之一，僅在脊椎動物中存在，截至目前在人的基因組中檢測到15個成員(RNase1-15)[15-17].其中RNase4基因是RNASE A基因超家族的一個重要成員，過去基于單基因水平(引物設(shè)計，PCR擴增，單基因測序)對RNase4基因的進化研究相對較少，但隨著分子生物學(xué)和基因組學(xué)的迅速發(fā)展，越來越多的物種基因組陸續(xù)公布，RNase4基因的研究引起了越來越多學(xué)者的關(guān)注，在基因組水平對該基因的研究越來越多[15-17].特別是2013年Goo等[17]對20個哺乳動物(僅包含哺乳動物第一大類群嚙齒目中的幾內(nèi)亞豬、裸鼴鼠、小家鼠、褐家鼠和倉鼠5個物種)基因組的RNase4基因進行研究，驚奇地在幾內(nèi)亞豬中檢測到RNase4基因發(fā)生基因復(fù)制，而在另外的四個物種均為單拷貝[18].這一有趣的發(fā)現(xiàn)提示RNase4基因在嚙齒目中可能具有獨特的進化模式.但該研究僅包含嚙齒目的5個物種， 那么RNase4基因在嚙齒目的其他物種、屬、科甚至亞目中發(fā)生基因復(fù)制的時間以及進化模式如何？因此，急需增加更多嚙齒目代表物種對RNase4基因進行深入的進化分析，以揭示上述未解決的科學(xué)問題.因此，我們對2013年Goo等[18]研究的嚙齒目 5個物種基因組及截至目前在NCBI上公布的所有嚙齒目的11個物種基因組進行RNase4基因分析.

1 材料與方法

本次研究共包含嚙齒目10科16個物種(包括2013年Goo等[18]研究的5個物種).這16個物種覆蓋了嚙齒目的三個進化枝：豪豬亞目、“與小家鼠相關(guān)的進化枝”和“與松鼠相關(guān)的進化枝”.

1.1 RNase4基因的鑒定

用小鼠RNase4基因的氨基酸序列和核酸序列分別作為查詢序列，采用先前多數(shù)學(xué)者采用的TBlastN和BlastN方法[15-17]，E值為10-10分別對每個物種的基因組搜索同源序列，進行分析.

1.2 序列比對和進化分析

使用ClustalX1.8.3[19]比對軟件進行序列比對，并進行手工矯正.采用鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)和最大似然法(Maximum Likelihood，ML)進行系統(tǒng)樹構(gòu)建.選擇兔形目(Lagomorpha)中的穴兔(Oryctolaguscuniculus)和北美鼠兔(Ochotonaprinceps)的RNase4基因(Oc_RNase4，Op_RNase4)作為外群.使用MEGA5.0軟件構(gòu)建NJ樹[20-21]，使用RaxML7.0.4軟件構(gòu)建ML樹[22].

2 結(jié)果與討論

2.1 嚙齒目的RNase4基因序列

本次研究為嚙齒目16個物種，22條RNase4基因序列，包括本次分析的11個物種(16條RNase4基因序列)和2013年Goo等.[17]研究的5個物種(6條RNase4基因序列).在這22條序列中，有5條序列的開放閱讀框，因移碼突變或者終止密碼子提前變?yōu)榧倩?白臀豚鼠和幾內(nèi)亞豬的RNase4基因有2個拷貝，鹿白足鼠和非洲跳鼠有1個真基因和2個假基因，奧氏更格盧鼠僅有1個假基因，其他11個物種的RNase4基因均為單拷貝(表1).這一結(jié)果揭示RNase4基因在白臀豚鼠、幾內(nèi)亞豬、鹿白足鼠和非洲跳鼠這四個物種發(fā)生基因擴張.

表1 本研究的物種信息和RNase4基因序列數(shù)

接下來對發(fā)生基因擴張的四個物種的旁系同源序列差異度進行計算.幾內(nèi)亞豬的兩個基因(Cp_RNase4A，Cp_RNase4B)間僅有1個堿基和1個氨基酸的差異；白臀豚鼠中的RNase4A(Ca_RNase4A)基因在376-414 bp區(qū)域未測序到，用N替代，除去未測序到的這個區(qū)域，白臀豚鼠中2個基因(Ca_RNase4A，Ca_RNase4B)間僅有1個堿基和1個氨基酸的差異，這2個拷貝在白臀豚鼠基因組的同一個Contig上(AVPZ01000045.1)，但位置相距約15 kb.幾內(nèi)亞豬和白臀豚鼠的拷貝間僅有1個氨基酸的差異，揭示RNase4基因這兩個物種中發(fā)生基因復(fù)制事件是在最近一段時間內(nèi)，這也正是在基因組水平對基因復(fù)制的進化模式的研究的優(yōu)點之一(基于單基因水平研究，拷貝間氨基酸差異數(shù)小于3，視為同一拷貝[23-25])，當然不能排除是由于基因組組裝錯誤所致，但我們認為豚鼠科的幾內(nèi)亞豬和白臀豚鼠兩個基因組對RNase4基因的組裝同時出現(xiàn)錯誤的可能性很小.倉鼠科中的鹿白足鼠和跳鼠科的非洲跳鼠的RNase4基因，因僅有1個功能基因，另外2個為假基因，只能對其核酸序列的差異度進行計算.鹿白足鼠3個拷貝(Pm_RNase4,Pm_RNase4psA和Pm_RNase4psB)中兩兩之間的堿基差異為12-14個.非洲跳鼠 3個拷貝(Jj_RNase4,Jj_RNase4psA和Jj_RNase4psB)中兩兩之間的堿基差異都在100個堿基左右，拷貝間的差異如此之大，且在系統(tǒng)發(fā)育樹中非洲跳鼠3個拷貝的枝都相對較長(圖2)，于是對這3條序列分別在NCBI上進行在線同源序列搜索，結(jié)果仍然與RNase4基因的相似度最高，這就揭示非洲跳鼠3個拷貝間有如此大的差異很可能是RNase4基因發(fā)生基因復(fù)制后，其中2個拷貝假基因化，不再受到選擇壓力，進化速率快的結(jié)果.

嚙齒目的22條序列的長度為423～537 bp，比對后的序列長度為566 bp，包含信號肽(1-84 bp)和成熟肽(85～566 bp).17條功能基因比對后的氨基酸序列為179個氨基酸，這些序列幾乎都具有RNASE A基因超家族典型的序列特征：(1)有8個結(jié)構(gòu)半胱氨酸，形成二硫鍵;(2)有3個催化氨基酸殘基;(3)有序列標簽“CKXXNTF”，但值得注意的是豪豬亞目中所有拷貝的蘇氨酸(T)突變?yōu)榻z氨酸(S)(圖1).

圖1 嚙齒目RNase4真基因的氨基酸序列對比

2.2 嚙齒目RNase4基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

采用最大似然法(ML)和鄰接法(NJ)對RNase4基因的功能基因和假基因一起構(gòu)樹，得到相似的拓撲結(jié)構(gòu)(圖2和圖3).

由圖2和圖3可以看出，拓撲結(jié)構(gòu)支持嚙齒目分為三個進化枝：“與松鼠相關(guān)的進化枝”(ML BS=94%，NJ BS=54%)、“與小家鼠相關(guān)的進化枝”(ML BS=84%，NJ BS=59%)和豪豬亞目(ML BS=100%，NJ BS=99%)，且支持率都比較高.這三支的進化關(guān)系為“與松鼠相關(guān)的進化枝”最先分歧，豪豬亞目和“與小家鼠相關(guān)的進化枝”形成姐妹群(ML BS=94%，NJ BS=54%)，這一結(jié)果與2009年Shani等對嚙齒目的系統(tǒng)發(fā)育研究結(jié)果一致[26].

另外，由圖2和圖3還可以看出，RNase4基因在豪豬亞目豚鼠科的白臀豚鼠和幾內(nèi)亞豬(ML BS=100%，NJ BS=100%)、“與小家鼠相關(guān)的進化枝”中的非洲跳鼠(ML BS=99%，NJ BS=99%)和鹿白足鼠(ML BS=100%，NJ BS=100%)中發(fā)生三次獨立基因復(fù)制，發(fā)生基因復(fù)制的時間是在嚙齒目中各科形成之后.在豚鼠科的白臀豚鼠和幾內(nèi)亞豬中均檢測到2個RNase4功能基因，并且是以基因的形式相互混合，這一結(jié)果揭示RNase4基因在白臀豚鼠和幾內(nèi)亞豬中發(fā)生一次基因復(fù)制事件，且基因復(fù)制是在這兩個物種形成之前，豚鼠科形成之后發(fā)生的.在非洲跳鼠和鹿白足鼠中均檢測到1個功能基因和2個假基因，并且基因是以物種的形式聚集，這一結(jié)果揭示RNase4基因在非洲跳鼠和鹿白足鼠中均獨立發(fā)生2次基因復(fù)制和2次假基因化事件，即“生與滅(birth and death)”的進化模式，這一進化模式在嚙齒目的EAR基因(RNASE A超基因家族中的2個成員)和其他基因家族的研究中也有報道[27-29].

圖2 基于嚙齒目 RNase4基因構(gòu)建的 ML 系統(tǒng)發(fā)育樹

圖3 基于嚙齒目 RNase4基因構(gòu)建的 NJ 系統(tǒng)發(fā)育樹

3 展 望

RNase4基因作為RNASE A超基因家族中的一個重要成員，在過去的分子進化研究中相對較少，但隨著越來越多的基因組公布，在基因組水平對RNase4基因的研究引起了越來越多學(xué)者的關(guān)注，特別是對嚙齒目中的許多模式生物進行深入進化分析研究，能為后續(xù)的功能實驗奠定基礎(chǔ).

由以上的研究可以看出RNase4基因在嚙齒目中的進化模式比想象的復(fù)雜，在所研究的類群中發(fā)生了3次獨立基因復(fù)制事件，并且在每一次獨立的基因復(fù)制事件中有不同的進化模式.同時，該研究為后續(xù)對嚙齒目RNase4基因的深入研究提供了線索：(1)在倉鼠科所分析的倉鼠、鹿白足鼠、金黃地鼠和草原田鼠這4個物種中，RNase4基因僅在鹿白足鼠中發(fā)生基因復(fù)制事件，而其他3個物種為單拷貝，這就提示后續(xù)研究需要增加倉鼠科代表物種，特別是增加與鹿白足鼠親緣關(guān)系較近的代表物種.在單基因水平進行深入的分析研究，更加清晰地追溯RNase4基因在倉鼠科中發(fā)生基因復(fù)制的時間和進化模式，同時對RNase4基因發(fā)生復(fù)制的驅(qū)動力進行深入研究.(2)在跳鼠科中，本次研究僅包含非洲跳鼠，并且檢測到RNase4基因發(fā)生2次基因復(fù)制和2次假基因化事件，這就帶來疑問：RNase4基因是僅在跳鼠科的非洲跳鼠，還是在跳鼠科的某一個或者某幾個屬，甚至整個跳鼠科中發(fā)生基因復(fù)制事件？這同樣需要增加跳鼠科代表物種來進行深入研究.

當然，對RNase4基因的研究并不局限于上述的進化分析，功能方面的研究也急需加入.為了對基因復(fù)制發(fā)生后，旁系同源基因的命運(新功能化、亞功能化和假基因化等)和活性進行深入探討，需要對拷貝在不同組織的表達、酶活性和點突變等進行研究.

另外，隨著基因組測序成本的降低和技術(shù)的成熟以及更多代表物種的基因組公布，在基因組水平對更多的生物類群進行RNase4基因研究，促進人們對該基因的認識，同時也為系統(tǒng)認識動物遺傳機制做出貢獻.

[1] RUBIN C J,ZODY M C,ERIKSSON J,et al.Whole-genome resequencing reveals loci under selection during chicken domestication[J].Nature,2010,464(7288):587-591.

[2] ALFOLDI J,DI PALMA F,GRABHERR M,et al.The genome of the green anole lizard and a comparative analysis with birds and mammals[J].Nature,2011,477(7366):587-591.

[3] KIM E B, FANG X, FUSHAN A A,et al.Genome sequencing reveals insights into physiology and longevity of the naked mole rat[J].Nature,2011,479(7372):223-227.

[4] LINDBLAD-TOH K,GARBER M,ZUK O,et al.A high-resolution map of human evolutionary constraint using 29 mammals[J].Nature,2011,478(7370):476-482.

[5] XU X,PAN S,CHENG S,et al.Genome sequence and analysis of the tuber crop potato[J].Nature,2011,475(7355):189-195.

[6] THE TOMATO GENOME CONSORTIUM.The tomato genome sequence provides insights into fleshy fruit evolution[J].Nature,2012,485(7400):635-641.

[7] ABECASIS G R,AUTON A,BROOKS L D,et al.An integrated map of genetic variation from 1,092 human genomes[J].Nature,2012,491(7422):56-65.

[8] D'HONT A,DENOEUD F,AURY J M,et al.The banana (Musa acuminata) genome and the evolution of monocotyledonous plants[J].Nature,2012,488(7410):213-217.

[9] GROENEN M A,ARCHIBALD A L,UENISHI H,et al.Analyses of pig genomes provide insight into porcine demography and evolution[J].Nature,2012,491(7424):393-398.

[10]MAYER K F,WAUGH R,BROWN J W,et al.A physical, genetic and functional sequence assembly of the barley genome[J].Nature,2012,491(7426):711-716.

[11]PASANIUC B,ROHLAND N,MCLAREN P J,et al.Extremely low-coverage sequencing and imputation increases power for genome-wide association studies[J].Nat Genet,2012,44(6):631-635.

[12]QIU Q,ZHANG G,MA T,et al.The yak genome and adaptation to life at high altitude[J].Nat Genet,2012,44(8):946-949.

[13]SCALLY A,DUTHEIL J Y,HILLIER L W,et al.Insights into hominid evolution from the gorilla genome sequence[J].Nature,2012,483(7388):169-175.

[14]ZHANG G,FANG X,GUO X,et al.The oyster genome reveals stress adaptation and complexity of shell formation[J].Nature,2012,490(7418):49-54.

[15]CHO S,BEINTEMA J J,ZHANG J.The ribonuclease A superfamily of mammals and birds:identifying new members and tracing evolutionary histories[J].Genomics,2005,85(2):208-220.

[16]Cho S,Zhang J.Ancient expansion of the ribonuclease A superfamily revealed by genomic analysis of placental and marsupial mammals[J].Gene,2006,373:116-125.

[17]GOO S M,CHO S.The expansion and functional diversification of the mammalian ribonuclease a superfamily epitomizes the efficiency of multigene families at generating biological novelty[J].Genome Biol Evol,2013,5(11):2124-2140.

[18]GUPTA S K,HAIGH B J,GRIFFIN F J,et al.The mammalian secreted RNases: mechanisms of action in host defence[J].Innate Immun,2013,19(1):86-97.

[19]THOMPSON J D,GIBSON T J,PLEWNIAK F,et al.The CLUSTAL_X windows interface:flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools[J].Nucleic Acids Res,1997,25(24):4876-4882.

[20]TAMURA K,PETERSON D,PETERSON N,et al.MEGA5:molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods[J].Mol Biol Evol,2011,28(10):2731-2739.

[21]KUMAR S,NEI M,DUDLEY J,et al.MEGA:a biologist-centric software for evolutionary analysis of DNA and protein sequences[J].Brief Bioinform,2008,9(4):299-306.

[22]STAMATAKIS A,HOOVER P,ROUGEMONT J.A rapid bootstrap algorithm for the RAxML Web servers[J].Syst Biol,2008,57(5):758-771.

[23]XU H,LIU Y,MENG F,et al.Multiple bursts of pancreatic ribonuclease gene duplication in insect-eating bats[J].Gene,2013,526(2):112-117.

[24]YU L,WANG X Y,JIN W,et al.Adaptive evolution of digestive RNASE1 genes in leaf-eating monkeys revisited: new insights from ten additional colobines[J].Mol Biol Evol,2010,27(1):121-131.

[25]YU L,ZHANG Y P.The unusual adaptive expansion of pancreatic ribonuclease gene in carnivora[J].Mol Biol Evol,2006,23(12):2326-2335.

[26]BLANGA-KANFI S,MIRANDA H,PENN O,et al.Rodent phylogeny revised: analysis of six nuclear genes from all major rodent clades[J].BMC Evol Biol,2009,9:71-83.

[27]OTA T,NEI M.Divergent evolution and evolution by the birth-and-death process in the immunoglobulin VH gene family[J].Mol Biol Evol,1994,11(3):469-482.

[28]NEI M,ROGOZIN I B,PIONTKIVSKA H.Purifying selection and birth-and-death evolution in the ubiquitin gene family[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2000,97(20):10866-10871.

[29]ZHANG J,DYER K D,ROSENBERG H F.Evolution of the rodent eosinophil-associated RNase gene family by rapid gene sorting and positive selection[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2000,97(9):4701-4706.