腦缺血及后適應(yīng)對(duì)樹(shù)鼩海馬內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)分子PERK及GRP78的影響*

陳理軍，馬　艷，李　霞，陳　靜，李樹(shù)清，張　穎△(昆明醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室，云南昆明　65003;紅河衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，云南蒙自6600)

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腦缺血及后適應(yīng)對(duì)樹(shù)鼩海馬內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)分子PERK及GRP78的影響*

陳理軍1，馬艷2，李霞1，陳靜1，李樹(shù)清1，張穎1△
(1昆明醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室，云南昆明650031;2紅河衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，云南蒙自661100)

［摘要］目的:探討腦缺血及后適應(yīng)對(duì)樹(shù)鼩海馬內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)分子蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)及葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)的影響及后適應(yīng)的腦保護(hù)機(jī)制。方法:光化學(xué)反應(yīng)誘導(dǎo)樹(shù)鼩局部血栓性腦缺血，于腦缺血后3.5 h夾閉、打開(kāi)缺血側(cè)頸總動(dòng)脈交替3個(gè)循環(huán)(每次5 min)以復(fù)制缺血后適應(yīng)模型。HE染色觀察缺血側(cè)海馬神經(jīng)元損傷及超微結(jié)構(gòu)變化，RT-PCR檢測(cè)腦缺血及后適應(yīng)不同時(shí)間海馬組織PERK及GRP78 mRNA表達(dá)的變化，免疫組織化學(xué)法與Western blot法檢測(cè)PERK及GRP78的蛋白定位及表達(dá)變化。結(jié)果:海馬神經(jīng)元隨腦缺血時(shí)間延長(zhǎng)而損傷加重，缺血24 h損傷最為嚴(yán)重，后適應(yīng)可減輕損傷。腦缺血4 h、24 h及72 h PERK的mRNA及蛋白表達(dá)較假手術(shù)組增高(P＜0.05)，后適應(yīng)組與相應(yīng)的缺血組相比，PERK的mRNA及蛋白表達(dá)減少，4 h、24 h差異顯著(P＜0.05) ;腦缺血4 h、24 h及72 h GRP78的mRNA及蛋白表達(dá)與假手術(shù)組無(wú)明顯差異，后適應(yīng)24 h組較缺血24 h組表達(dá)增高(P＜0.05)。結(jié)論:樹(shù)鼩局部血栓性腦缺血可激活缺血側(cè)海馬內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，引起PERK/eIF2α信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中相關(guān)分子PERK的mRNA及蛋白表達(dá)增高。缺血后適應(yīng)處理通過(guò)下調(diào)PERK、上調(diào)GRP78的表達(dá)，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，減少神經(jīng)元損傷，具有一定的腦保護(hù)作用。

［關(guān)鍵詞］蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶;葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78;缺血后適應(yīng);內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激;海馬;光化學(xué)反應(yīng);樹(shù)鼩

［修回日期］2015-04-16

Effects of cerebral ischemia and postconditioning on signaling molecules PERK and GRP78 in hippocampus tissue of tree shrew during endoplasmic reticulum stress

CHEN Li-jun1，MA Yan2，LI Xia1，CHEN Jing1，LI Shu-qing1，ZHANG Ying1
(1Department of Pathophysiology，Kunming Medical University，Kunming 650031，China;2Honghe Vocational Health College，Mengzi 661100，China.E-mail: coco90305@126.com)

［ABSTRACT］AIM: To investigate the effects of cerebral ischemia and postconditioning on protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase (PERK) and glucose-regulated protein 78 (GRP78) in the hippocampus tissue of tree shrew during endoplasmic reticulum stress and the mechanism of post-conditioning protecting the brain from damage.METHODS: The focal cerebral ischemic model was duplicated by photochemical reaction in tree shrew and the postconditioning was induced by alternatively occluding and opening the carotid artery of ischemic side for 3 cycles (5 min each cycle) at 3.5 h after ischemia.The damage and ultrastructural changes of the hippocampal neurons were observed by HE staining.The expression of PERK and GRP78 at mRNA and protein levels in the hippocampal tissue at different time points after cerebral ischemia and postconditioning was determined by RT-PCR，immunohistochemistry and Western blot.RESULTS: The injuries of hippocampal neurons were aggravated with prolonged cerebral ischemia，which was most severe at 24 h after ischemia while the postconditioning alleviated these damages correspondingly.The expression of PERK at mRNA and protein levels was upregulated at 4 h，24 h and 72 h after ischemia (P＜0.05)，while postconditioning downregulated the expressions of PERK at ischemia and postconditioning 4 h (IP4 h) gruop and IP24 h group (P＜0.05).The expression of GRP78 at mRNA and protein levels was not changed at 4 h，24 h and 72 h after ischemia，while postconditioning upregu-lated the expressions of GRP78 at IP24 h group (P＜0.05).CONCLUSION: The focal thrombotic cerebral ischemia activates the endoplasmic reticulum stress in ischemic hippocampus of tree shrews，leading to the changes in mRNA and protein expression of PERK in the PERK/eIF2α signal transduction pathway.The postconditioning treatment alleviates endoplasmic reticulum stress and neuronal damages by downregulating PERK and upregulating GRP78，thereby protecting the brain from injury.

［KEY WORDS］Protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase; Glucose-regulated protein 78; Ischemic postconditioning; Endoplasmic reticulum stress; Hippocampus; Photochemical reaction; Tree shrew

近年來(lái)有關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)研究表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)不僅維持細(xì)胞的生存，而且參與了細(xì)胞凋亡的調(diào)控。缺血性腦損傷可誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)［1］，適度而短暫的ERS對(duì)細(xì)胞具有保護(hù)作用，嚴(yán)重而長(zhǎng)時(shí)間的ERS將導(dǎo)致細(xì)胞損傷。有研究報(bào)道［1］大腦中動(dòng)脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)大鼠，隨著缺血時(shí)程延長(zhǎng)，皮層熱休克蛋70(heat shock protein 70，HSP70)及激活轉(zhuǎn)錄因子4(activating transcription factor 4，ATF-4)等ERS標(biāo)志蛋白表達(dá)增多，而使用真核翻譯起始因子2α (eucaryotic translation initiation factor 2α，eIF2α)特異拮抗劑后，上述蛋白及mRNA的表達(dá)相應(yīng)減少，表明腦缺血可激活ERS的蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK)/eIF2α通路。另有研究［2］發(fā)現(xiàn)大鼠經(jīng)中腦動(dòng)脈閉塞缺血再灌后腦梗塞面積增大，ERS的標(biāo)志蛋白葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP78)及CHOP表達(dá)增加，且凋亡因子caspase-12平行出現(xiàn)在TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞中，證實(shí)腦缺血激活ERS所致的腦損傷可能與凋亡有關(guān)。我室前期研究也發(fā)現(xiàn)樹(shù)鼩腦缺血可致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，加重神經(jīng)元損傷，但具體的發(fā)生機(jī)制尚不清楚。

由此可見(jiàn)，腦缺血再灌注引起的ERS可加重神經(jīng)元繼發(fā)性損傷，如何有效阻斷ERS，而起到一定的腦保護(hù)作用?腦缺血后適應(yīng)(postconditioning，Post-C)是指在腦缺血再灌注后一定時(shí)間內(nèi)，給予數(shù)次短暫性缺血-再灌注，激活組織內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，增強(qiáng)腦組織缺血耐受性，減少神經(jīng)元繼發(fā)性損傷［3］。Post-C是否可通過(guò)干預(yù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，而起到相應(yīng)的腦保護(hù)作用?基于此假設(shè)，本研究通過(guò)觀察腦缺血及后適應(yīng)對(duì)海馬內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激關(guān)鍵的信號(hào)分子PERK及GRP78表達(dá)的影響，部分闡釋腦缺血激活的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的腦損傷及Post-C干預(yù)ERS所起到的腦保護(hù)作用的機(jī)制。

材料和方法

1材料

1.1動(dòng)物健康成年樹(shù)鼩126只，雌雄不限，體重(100±20) g，由昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)前避光、清潔、安靜環(huán)境下單籠飼養(yǎng)，將動(dòng)物隨機(jī)分為假手術(shù)(sham)組、缺血(ischemic，I) 4 h(I4 h)組、缺血后適應(yīng)4 h(IP4 h)組、缺血24 h(I24 h)組、缺血后適應(yīng)24 h(IP24 h)組、缺血72 h(I72 h)組、缺血后適應(yīng)72 h(IP72 h)組，共計(jì)7個(gè)組。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)前及術(shù)后自由攝食攝水。

1.2儀器本室自行研制的SQ-Ⅲ型局部腦血栓形成裝置，大體由光源(含濾波電路及觸發(fā)器)、萬(wàn)能支架、數(shù)控光源及散熱裝置組成。光學(xué)系統(tǒng)組成包括干涉濾片及聚光透鏡。光源中心波長(zhǎng)(λ=560 nm)，帶寬(Δλ=60 nm)，光強(qiáng)度(1×104W/m2)，用時(shí)間繼電器控制照射時(shí)間。

1.3主要試劑硫噴妥鈉為上海新亞藥業(yè)有限公司產(chǎn)品;山羊血清封閉液購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司; DAB顯色試劑盒、Ⅱ抗Max-VisionTM即用型試劑購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司;Ⅰ抗PERK、GRP78購(gòu)自Santa Cruz;β-actin購(gòu)自Abcam; HRP標(biāo)記羊抗兔、羊抗鼠Ⅱ抗購(gòu)自KPL; PERK、GRP78、β-actin引物由生工生物工程股份有限公司合成; cDNA Synthesis Kit、PCR Master Mix購(gòu)自Thermo。

2主要方法

2.1使用腦血栓形成裝置建立樹(shù)鼩局部血栓性腦缺血模型［4］以1%硫噴妥鈉(5 mL/kg)腹腔注射麻醉動(dòng)物，待動(dòng)物麻醉將其固定，經(jīng)舌下靜脈一次性注射(1.5 g/L)孟加拉紅生理鹽水溶液(1.33 mL/kg)，待循環(huán)10 min后，用碘伏、75%的乙醇依次消毒右側(cè)頭部皮膚，于右側(cè)頭頂部備皮，自右耳屏前至右眼外眥作切口，分離部分顳肌以暴露頂區(qū)顱骨，將動(dòng)物置于SQ-Ⅲ型局部腦血栓形成裝置下，使光束聚焦直射顱骨表面，在光強(qiáng)度為1×104W/m2下照射血管15 min(時(shí)間由繼電器控制)，照射期間維持顱骨表面溫度于(36±1)℃。常規(guī)消毒并逐層縫合切口，放入飼養(yǎng)籠，保持體溫。

2.2缺血后適應(yīng)模型的建立在光化學(xué)法局部血栓性腦缺血模型復(fù)制成功后，在缺血4 h的時(shí)間點(diǎn)前40 min，用1%硫噴妥鈉(2.5 mL/kg)麻醉動(dòng)物，動(dòng)物仰臥固定后，常規(guī)消毒頸部，作縱形正中切，切開(kāi)皮膚、皮下組織及頸闊肌，在右側(cè)胸鎖乳突肌的前緣分離出頸動(dòng)脈鞘，并確保迷走神經(jīng)和頸內(nèi)靜脈得到保護(hù)，分離頸總動(dòng)脈，穿線，在缺血4 h時(shí)點(diǎn)前30 min用無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾在甲狀軟骨平面夾閉頸總動(dòng)脈5 min后，去掉動(dòng)脈夾再灌注5 min，夾閉-開(kāi)夾共計(jì)重復(fù)3個(gè)循環(huán)，用時(shí)30 min以復(fù)制缺血后適應(yīng)模型。術(shù)后縫合動(dòng)物頸部創(chuàng)口，放入飼養(yǎng)籠，保持體溫。

2.3 HE染色樣品從冰箱取出平衡至室溫，蠟塊標(biāo)本連續(xù)切片，切片厚約4 μm，貼片，并移至55℃恒溫箱內(nèi)烤片4～6 h，切片在二甲苯中室溫脫蠟10 min，移入二甲苯和純乙醇(1∶1)混合液中5 min，入梯度下行乙醇，后經(jīng)蒸餾水水化并轉(zhuǎn)入染液，蘇木精染液染色10 min，沖洗多余的染液，1%鹽酸乙醇(70%乙醇配制)分化數(shù)秒(鏡檢控制，直至細(xì)胞核及核內(nèi)染色質(zhì)清晰為止)，沖洗20 min，或在碳酸鋰飽和溶液中短時(shí)間堿化使細(xì)胞核呈藍(lán)色，蒸餾水漂洗5 min(換2次水)，0.5%伊紅染液染色1～5 min，梯度上行乙醇脫水(2次)，因?yàn)樵?5%以下的乙醇中伊紅易脫色，所以采用二甲苯透明(2次)，共約10 min。封片:擦去切片周?chē)嘤嗟亩妆?，待二甲苯未干之前，迅速滴加適量中性樹(shù)膠，加蓋玻片封片。

2.4免疫組織化學(xué)法檢測(cè)PERK、GRP78冰箱內(nèi)取出蠟塊標(biāo)本平衡至室溫，蠟塊標(biāo)本連續(xù)切片，切片厚度4 μm，并移至55℃恒溫烤箱內(nèi)烤片4～6 h，待切片周?chē)氖炄芑?，且保持濕?rùn)狀態(tài)時(shí)即可停止烤片;組織切片脫蠟，置于二甲苯中室溫孵育3次，每次10 min，將切片置于100%乙醇溶液內(nèi)洗片2次，每次10 min，再將切片置于梯度下行乙醇溶液內(nèi)洗片1次，每次5 min;最后將切片移入去離子水內(nèi)5 min再水化;將切片置于1 mmol/L EDTA(pH 8.0)內(nèi)煮沸15 min，進(jìn)行抗原修復(fù)，自然冷卻至40℃后用去離子水洗片3次，每次5 min，之后用含Triton X-100的PBS(PBS-TX)洗片3次，每次10 min，3% H2O2+ PBS(pH 7.4)溶液孵育去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶;切片用0.05 mol/L PBS-TX緩沖液(pH 7.4)洗3次，每次10 min;然后用5%的山羊血清封閉60 min，甩去血清后直接加入GRP78、PERK(1∶100) I抗4℃下孵育過(guò)夜;第2天用PBS洗3次，每次10 min;加入II抗(鼠/兔)，室溫下孵育30 min;用PBS洗3次，每次10 min;除去PBS液，加入新鮮配制的DAB溶液，顯微鏡下觀察3～5 min;自來(lái)水沖洗，蘇木素復(fù)染，用0.1% HCl分化，自來(lái)水沖洗至返藍(lán);切片經(jīng)梯度乙醇脫水干燥，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固。對(duì)照組以PBS代替Ⅰ抗進(jìn)行孵育，其余步驟一致。染色結(jié)果在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察，制作好的切片干燥避光儲(chǔ)存。

2.5 RT-PCR檢測(cè)PERK和GRP78的mRNA表達(dá)于對(duì)照組、腦缺血后不同時(shí)點(diǎn)、缺血后適應(yīng)后不同時(shí)點(diǎn)麻醉動(dòng)物，迅速斷頭經(jīng)高壓蒸汽滅菌處理取缺血側(cè)海馬，按TRIzol試劑說(shuō)明書(shū)提取總RNA，測(cè)定RNA樣品的純度和含量，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，以cDNA為模版，按25 μL的體系進(jìn)行RT-PCR(各基因擴(kuò)增的退火溫度如下: PERK 42.5℃; GRP78 47.5 ℃;β-actin 52.5℃)，瓊脂糖凝膠電泳，電泳后取出凝膠，在紫外線下觀察，可見(jiàn)桔黃色條帶，用凝膠電泳成像儀系統(tǒng)采集圖像。引物見(jiàn)表1。

表1　 PERK、GRP78與β-actin的引物序列Table 1.Primer sequences of PERK and GRP78

2.6 Western blot檢測(cè)PERK和GRP78的蛋白水平

于對(duì)照組、腦缺血后不同時(shí)點(diǎn)、缺血后適應(yīng)后不同時(shí)點(diǎn)麻醉動(dòng)物，迅速斷頭在冰面上經(jīng)消毒取缺血側(cè)海馬，按組織重量每100 mg組織加入1 mL裂解液提取總蛋白，Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，進(jìn)行SDSPAGE，電泳后半干轉(zhuǎn)到PVDF膜，用保鮮膜將PVDF膜封起來(lái)，5%脫脂牛奶封閉，室溫振搖封閉2 h，將PERK、GRP78抗兔多克隆抗體(1∶800)和β-actin抗鼠多克隆抗體(1∶20 000)用含0.1% Tween-20 TBS封閉液稀釋后分別加入，室溫振搖2 h后，4℃冰箱中孵育過(guò)夜，用含0.05% Tween-20的TBST洗膜3次，依次為30 min、20 min、10 min，將辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗用含0.1% Tween-20 TBS封閉液稀釋后分別加入，室溫振搖2 h，用含0.05% Tween-20的TBS洗膜3次，依次為30 min、20 min、10 min。ECL化學(xué)發(fā)光處理6 min后(PERK、GRP78)或1 min后(β-actin)，采用化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀檢測(cè)目的條帶。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，用GraphPad Prism 5統(tǒng)計(jì)軟件行方差齊性檢驗(yàn)、單因素方差分析，樣本均數(shù)間的兩兩比較用q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 HE染色結(jié)果

假手術(shù)組海馬結(jié)構(gòu)完整、層次清晰、分布均勻，海馬神經(jīng)元細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)未出現(xiàn)異常，CA1區(qū)的錐體細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞核大而且呈圓形，核仁較明顯。缺血4 h組可見(jiàn)缺血性改變;隨缺血時(shí)間延長(zhǎng)，海馬神經(jīng)元細(xì)胞損傷加重，缺血24 h組的病變最為明顯，此時(shí)缺血側(cè)海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞的胞體縮小，胞漿尼氏小體消失，呈嗜酸性變，細(xì)胞核固縮，核仁消失，結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)胞周?chē)纬煽张?，神?jīng)元密度急劇減少。缺血72 h組海馬病變有所減緩，但仍有部分神經(jīng)元細(xì)胞固縮。后適應(yīng)4 h組可見(jiàn)神經(jīng)元嗜酸性變有所減輕，而后適應(yīng)24 h組海馬神經(jīng)元損傷有明顯的減輕，后適應(yīng)72 h組神經(jīng)元細(xì)胞出現(xiàn)層次性增加，見(jiàn)圖1。

Figure 1.The HE staining and expressions of PERK and GRP78 in by immunohistochemistry the hippocampus of tree shrew during cerebral ischemia and post-conditioning.圖1腦缺血及后適應(yīng)缺血側(cè)海馬組織HE染色及PERK與GRP78免疫組化結(jié)果

2免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

光學(xué)顯微鏡下觀察，陽(yáng)性反應(yīng)部位呈現(xiàn)棕黃色(DAB顯色)。假手術(shù)組海馬PERK蛋白散在而且低水平表達(dá)，I4 h、I24 h及I72 h組缺血側(cè)海馬PERK的表達(dá)增強(qiáng)，以I4 h最為明顯。后適應(yīng)與相應(yīng)缺血組對(duì)比，PERK蛋白表達(dá)減少，IP24 h組減少最為顯著;假手術(shù)組海馬GRP78蛋白散在而且低水平表達(dá)，I4 h、I24 h及I72 h樹(shù)鼩海馬GRP78的表達(dá)略增強(qiáng)。后適應(yīng)組與缺血組相比，IP24 h組表達(dá)增強(qiáng)，見(jiàn)圖1。

3腦缺血及后適應(yīng)對(duì)缺血側(cè)海馬組織PERK、GRP78 mRNA表達(dá)的影響

局部血栓性腦缺血I4 h組、I24 h組及I72 h組缺血側(cè)海馬組織PERK的mRNA表達(dá)較假手術(shù)組明顯增強(qiáng)(P＜0.05)。后適應(yīng)組與缺血組比較，IP4 h組、IP24 h組海馬組織PERK的mRNA表達(dá)減少(P＜0.05) ;局部血栓性腦缺血I4 h組I24及I72 h組缺血側(cè)海馬組織GRP78的mRNA表達(dá)較假手術(shù)組稍高，但差異不顯著。后適應(yīng)組與缺血組比較，IP24 h組海馬的GRP78 mRNA表達(dá)增強(qiáng)(P＜0.05)，見(jiàn)圖2。

4腦缺血及后適應(yīng)對(duì)缺血側(cè)海馬組織PERK、GRP78蛋白表達(dá)的影響

局部血栓性腦缺血I4 h組、I24 h組及I72 h組缺血側(cè)海馬組織PERK蛋白表達(dá)較假手術(shù)組明顯增強(qiáng)(P＜0.05)。后適應(yīng)組與缺血組比較，IP24 h組及IP72 h組海馬PERK蛋白表達(dá)減少(P＜0.05) ;局部血栓性腦缺血I4 h組、海馬GRP78蛋白表達(dá)較假手術(shù)組增強(qiáng)(P＜0.05)。后適應(yīng)組與缺血組比較，IP24 h組海馬GRP78蛋白表達(dá)增強(qiáng)(P＜0.05)，見(jiàn)圖2。

Figure 2.The expression of PERK and GRP78 at mRNA and protein levels in ischemic hippocampus of tree shrew during cerebral ischemia and postconditioning.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs sham;#P＜0.05 vs I4 h;△P＜0.05 vs I24 h.圖2腦缺血及后適應(yīng)缺血側(cè)海馬組織PERK與GRP78 mRNA和蛋白的表達(dá)

討論

大量研究表明缺血再灌可加重腦組織的損傷及功能障礙，本實(shí)驗(yàn)主要探討光化學(xué)誘導(dǎo)樹(shù)鼩局灶性腦缺血是否激活海馬內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK/eIF2α信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及后適應(yīng)的干預(yù)機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)隨缺血時(shí)間延長(zhǎng)，缺血側(cè)海馬神經(jīng)元損傷加重，神經(jīng)元密度急劇減少，缺血72 h組海馬病變有所減緩，但仍有部分神經(jīng)元細(xì)胞固縮，而同時(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表現(xiàn)出結(jié)構(gòu)紊亂，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)池?cái)U(kuò)張及溶解。這與湯諹等［4］研究一致，表明腦缺血可激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，并損傷神經(jīng)元。

PERK屬于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK/elF2α信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的啟動(dòng)蛋白，通過(guò)胞漿內(nèi)結(jié)構(gòu)域的自身二聚化和磷酸化而激活［5］。有研究發(fā)現(xiàn)使用PERK選擇性抑制劑U0126可以加重神經(jīng)元的死亡，從而推測(cè)PERK在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在缺血性腦損傷中起保護(hù)作用［6］。然而近年來(lái)的研究更傾向于PERK可加重缺血性腦損傷的觀點(diǎn)，Henriksson等［7］證明U0126抑制PERK激活后可減輕神經(jīng)元損傷。本研究亦發(fā)現(xiàn)，腦缺血后海馬組織PERK表達(dá)增強(qiáng)，神經(jīng)元損傷加重，可能與PERK通路持續(xù)性激活引起嚴(yán)重的ERS、啟動(dòng)CHOP誘發(fā)凋亡、促使缺血/再灌注損傷加重有關(guān)。

GRP78是HSP70家族成員之一，也是一種分子伴侶，在ERS時(shí)表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)新合成的多肽進(jìn)一步折疊、修飾或與堆積的未折疊蛋白及錯(cuò)誤折疊的蛋白相結(jié)合后通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)未折疊蛋白或錯(cuò)誤折疊蛋白降解［8］，在應(yīng)激狀態(tài)下具有維護(hù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正常功能及維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+平衡的作用［9］。研究表明GRP78作為PERK/eIF2α信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的上游相關(guān)分子，可抑制腦缺血誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激產(chǎn)生的損傷［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血損傷誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起GRP78表達(dá)升高，可能與GRP78需要去應(yīng)對(duì)缺血引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)大量未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷有關(guān)，表明GRP78具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用。

減輕缺血后神經(jīng)元損傷一直是國(guó)內(nèi)外腦缺血基礎(chǔ)研究和探索的重要領(lǐng)域。Post-C是一種在方法上與缺血預(yù)適應(yīng)完全不同，但作用相似的腦保護(hù)措施。海馬神經(jīng)元是腦缺血或其它毒性物質(zhì)最易損傷區(qū)域［11］，我室前期研究亦發(fā)現(xiàn)多次短暫閉塞動(dòng)物的頸動(dòng)脈可延長(zhǎng)樹(shù)鼩腦缺血治療的“時(shí)間窗”，缺血后適應(yīng)可顯著提高缺血24 h、72 h海馬CA1區(qū)局部區(qū)域血流［12］。本次研究發(fā)現(xiàn)，缺血后適應(yīng)下調(diào)PERK、上調(diào)GRP78而減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而減輕缺血側(cè)海馬神經(jīng)元的損傷。本研究還發(fā)現(xiàn)，腦缺血4 h時(shí)PERK表達(dá)即有改變，4 h是腦缺血病理生理過(guò)程的超早期，從形態(tài)學(xué)角度雖未觀察到神經(jīng)元改變，而相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路已被激活［2］。如果能在此期間通過(guò)缺血后適應(yīng)處理，激活自身組織細(xì)胞內(nèi)源性保護(hù)作用機(jī)制，可增強(qiáng)腦組織缺血耐受性，從而減輕繼發(fā)性腦損傷。

綜上所述，腦缺血可誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，PERK/eIF2α信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路得以激活，其中的信號(hào)分子PERK與GRP78表達(dá)發(fā)生改變，從而加重神經(jīng)元繼發(fā)性損傷。而缺血后適應(yīng)可下調(diào)PERK、上調(diào)GRP78而減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，從而起到一定的腦保護(hù)作用。

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*［基金項(xiàng)目］國(guó)家科技支撐計(jì)劃(No.2014BAIO1B01) ;國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.31360245) ;云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究(昆醫(yī)聯(lián)合專(zhuān)項(xiàng)) (No.2012FB013)

［收稿日期］2014-11-05

［文章編號(hào)］1000-4718(2015)06-1105-06

［中圖分類(lèi)號(hào)］363

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.06.024