納米金逆轉(zhuǎn)人肝癌耐藥細(xì)胞HepG2/ADM耐藥性的實(shí)驗(yàn)研究*

邵明濤，潘運(yùn)龍，△，覃　莉，巫　青，丁　暉，趙曉旭(暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院胃腸外科，醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，附屬第一醫(yī)院體部伽瑪?shù)吨行模瑥V東廣州506)

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納米金逆轉(zhuǎn)人肝癌耐藥細(xì)胞HepG2/ADM
耐藥性的實(shí)驗(yàn)研究*

邵明濤1，潘運(yùn)龍1，3△，覃莉2，巫青1，丁暉1，趙曉旭3
(暨南大學(xué)1附屬第一醫(yī)院胃腸外科，2醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，3附屬第一醫(yī)院體部伽瑪?shù)吨行?，廣東廣州510632)

［摘要］目的:探討納米金(gold nanoparticles，GNPs)對人肝癌阿霉素(adriamycin，ADM)耐藥細(xì)胞株HepG2/ADM的阿霉素耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用及其可能機(jī)制。方法: MTT比色法檢測GNPs對人肝癌細(xì)胞株HepG2及其耐藥細(xì)胞株HepG2/ADM對不同濃度ADM耐藥性的影響;流式細(xì)胞術(shù)檢測GNPs處理后ADM(2 mg/L)對HepG2/ADM細(xì)胞凋亡的影響;紫外分光光度計(jì)檢測GNPs處理后HepG2/ADM細(xì)胞內(nèi)ADM的藥物濃度;谷胱甘肽(GSH)檢測試劑盒(DTNB法)檢測GNPs處理后HepG2/ADM細(xì)胞GSH的含量。結(jié)果: GNPs處理前HepG2和HepG2/ADM細(xì)胞對不同濃度ADM的半數(shù)抑制濃度分別為: (9.16±2.03) mg/L、(29.46±1.73) mg/L，耐藥倍數(shù)為3.22; GNPs處理后HepG2/ADM細(xì)胞對不同濃度ADM的半數(shù)抑制濃度為(15.18±0.85) mg/L，逆轉(zhuǎn)指數(shù)為1.95。GNPs+ ADM組HepG2/ADM的細(xì)胞凋亡率明顯高于單獨(dú)ADM組(P＜0.05)。HepG2/ADM組細(xì)胞內(nèi)的ADM含量低于HepG2組細(xì)胞內(nèi)的ADM含量(P＜0.01) ; GNPs處理后HepG2/ADM細(xì)胞內(nèi)的ADM含量較處理前明顯增加(P＜0.01)。HepG2/ADM組細(xì)胞內(nèi)GSH含量高于HepG2組(P＜0.01) ; GNPs處理后HepG2/ADM細(xì)胞內(nèi)的GSH含量較處理前明顯降低(P＜0.05)。結(jié)論:納米金具有逆轉(zhuǎn)耐藥肝癌細(xì)胞對阿霉素耐藥性的作用，并且可以降低細(xì)胞內(nèi)GSH含量及增加胞內(nèi)化療藥物濃度。

［關(guān)鍵詞］納米金;阿霉素;谷胱甘肽;耐藥性;肝細(xì)胞癌

［修回日期］2015-03-27

Effect of gold nanoparticles on reversing adriamycin resistance of human hepatocellular carcinoma HepG2/ADM cells

SHAO Ming-tao1，PAN Yun-long1，3，QIN Li2，WU Qing1，DING Hui1，ZHAO Xiao-xu3
(1Gastrointestinal Surgery，The First Affiliated Hospital，2Department of Histology＆Embryology，School of Medicine，3Body Gamma Knife Center，The First Afftiliated Hospital，Jinan University，Guangzhou 510632，China.E-mail: tpanyl@ jnu.edu.cn)

［ABSTRACT］AIM: To investigate whether gold nanoparticles (GNPs) reverses adriamycin (ADM)，resistance of human hepatocellular carcinoma drug-resistant cell line HepG2/ADM and to explore the potential mechanism.METHODS: The sensitivities of HepG2 cells and HepG2/ADM cells to ADM were tested by MTT assay before and after GNPs pretreatment.The apoptotic rate was examined by flow cytometry.The concentration of ADM in HepG2/ADM or HepG2 cells was determined by ultraviolet-visible spectrophotometer.The content of glutathione (GSH) in HepG2/ADM or HepG2 cells by DTNB method.RESULTS: The half maximal inhibitory concentrations (IC50) of ADM for HepG2/ADM cells were(29.46±1.73) mg/L and (15.18±0.85) mg/L before and after GNPs pretreatment，respectively.The IC50of ADM for HepG2 cells was (9.16±2.03) mg/L before pretreatment.The apoptotic rate in GNPs+ ADM group was higher than that in ADM group (P＜0.05).The concentration of ADM in HepG2/ADM group was lower than that in HepG2 group (P＜0.01).After GNPs pretreatment，the concentration of ADM in HepG2/ADM cells was higher than that before pretreatment.The content of GSH in HepG2/ADM group was higher than that in HepG2 group (P＜0.01).After GNPs pretreatment，the content of GSH in the HepG2/ADM cells was lower than that before pretreatment.CONCLUSION: Gold nanoparticles can reverse ADM resistance of human hepatocellular carcinoma drug-resistant cell line HepG2/ADM，reduce the content of GSH and increase the concentration of ADM in HepG2/ADM cells.

［KEY WORDS］Gold nanoparticles; Adriamycin; Glutathione; Drug resistance; Hepatocellular carcinoma

化療是腫瘤，尤其是晚期腫瘤治療的重要手段之一，然而由于肝癌細(xì)胞多藥耐藥性(multidrug resistance，MDR)的存在，化療效果并不理想［1］。因此，對MDR機(jī)制的研究變得尤為重要。近年來，人們對MDR的發(fā)生機(jī)制、檢測手段及其逆轉(zhuǎn)的研究取得了較大進(jìn)展。目前認(rèn)為，MDR的主要機(jī)制與腫瘤細(xì)胞對抗腫瘤藥物的主動外排作用密切相關(guān)［2］。納米金(gold nanoparticles，GNPs)是金的微小顆粒，在腫瘤治療方面具有很大的潛能［3］。我們前期研究表明納米金不僅具有抗腫瘤血管生成［4］及誘導(dǎo)腫瘤血管正常化［5-6］的作用，還可以通過減少腫瘤細(xì)胞對化療藥物的主動外排或增加化療藥物的攝入而發(fā)揮增敏作用［7］。那么，納米金是否可以逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥性，本研究旨在探討納米金能否逆轉(zhuǎn)人肝癌阿霉素(adriamycin，ADM)耐藥細(xì)胞HepG2/ADM對ADM耐藥性及可能的機(jī)制。

材料和方法

肝癌細(xì)胞株HepG2及對ADM耐藥的肝癌細(xì)胞株HepG2/ADM由本實(shí)驗(yàn)室保存。RPMI-1640培養(yǎng)液、L-谷氨酰胺、青霉素和鏈霉素均購自HyClone; ADM購自浙江海正藥業(yè)股份有限公司;胎牛血清和胰蛋白酶購自Gibco; MTT和DMSO購自Sigma; AnnexinⅤ-FITC/碘化丙啶(propidium iodide，PI)細(xì)胞凋亡試劑盒和細(xì)胞周期檢測試劑盒均購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司;谷胱甘肽(glutathione，GSH)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。紫外可見分光光度計(jì)購自Perkin Elmer;酶聯(lián)免疫檢測儀購自Bio-Rad;相關(guān)酶標(biāo)板購自Costar。

2主要方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)HepG2細(xì)胞株用含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液，置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的飽和濕度條件下培養(yǎng); HepG2/ADM細(xì)胞在上述培養(yǎng)條件下，加入ADM(1.0 mg/L)培養(yǎng)，以維持其耐藥性，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 MTT法檢測GNPs對HepG2/ADM細(xì)胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用取對數(shù)生長期的HepG2、HepG2/ADM細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液，以1× 107/L的細(xì)胞密度接種于96孔板中，每孔100 μL。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，吸出上清液，MTT法進(jìn)行檢測。實(shí)驗(yàn)分成HepG2組、HepG2/ADM組和GNPs (10 nmol/L)+ HepG2/ADM組。每組設(shè)3個重復(fù)孔。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，HepG2組、HepG2/ADM組分別加入不同濃度的ADM(0.1、1、5、25、50、100、150、200 mg/L)，GNPs+ HepG2/ADM組加入GNPs預(yù)處理1 h后去掉上清液，分別加入不同質(zhì)量濃度的ADM(0.1、1、5、25、50、100、150、200 mg/L) ;細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h，各孔加入MTT溶液(5 g/L) 20 μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清，每孔加入150 μL二甲基亞砜，在測量波長570 nm、參比波長630 nm處測吸光度(A)值。細(xì)胞增殖抑制率(inhibitory rate，IR)=(1－藥物組A 值/對照組A值)×100%。以ADM濃度為橫坐標(biāo)、IR為縱坐標(biāo)繪制藥物濃度-IR曲線，求出回歸方程，得到半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)值，計(jì)算耐藥倍數(shù)(resistant factor，RF)和逆轉(zhuǎn)指數(shù)(reversal index，RI)。RF=耐藥細(xì)胞IC50值/非耐藥細(xì)胞IC50值，RI=GNPs處理前耐藥細(xì)胞IC50值/GNPs處理后耐藥細(xì)胞IC50值。

2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測GNPs處理后ADM對HepG2/ADM細(xì)胞凋亡率的影響取對數(shù)生長期HepG2/ADM細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×108/L，接種于6孔板中，每孔2 mL;細(xì)胞貼壁生長24 h后，分為對照(control)組、GNPs(10 nmol/L)、ADM(2.0 mg/L)和GNPs+ ADM組;藥物作用24 h后，用胰酶消化細(xì)胞并收集于試管中，PBS洗滌細(xì)胞3次。按AnnexinⅤ-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒說明書提供的方法，每管樣品中分別加入200 μL binding buffer重懸細(xì)胞后，加入5 μL AnnexinⅤ-FITC和5 μL PI，輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15 min，上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

2.4紫外分光光度計(jì)檢測GNPs處理后HepG2/ADM細(xì)胞內(nèi)積聚的ADM量在室溫(25℃)條件下配制濃度為50 mg/L的ADM溶液，用紫外分光光度計(jì)于200～800 nm波長范圍掃描，結(jié)果顯示在480 nm處有最大吸收峰，配制8個不同濃度的ADM標(biāo)準(zhǔn)溶液，用紫外分光光度計(jì)測其480 nm吸光度，得到濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)驗(yàn)分組同方法2.2，每組設(shè)4個復(fù)孔。按分組將HepG2和HepG2/ADM細(xì)胞分別以每孔1×104接種于96孔板。培養(yǎng)24 h后，HepG2組和HepG2/ADM組加無血清培養(yǎng)基100 μL，而GNPs+ HepG2/ADM組加入10 nmol/L GNPs溶液預(yù)處理1 h后用PBS洗凈，最后各組分別加入10 mg/L的ADM 200 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后收集各組上清液，測其480 nm處的吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)積聚的ADM量。

2.5 GSH檢測試劑盒檢測GNPs處理后HepG2/ADM細(xì)胞內(nèi)GSH的含量取對數(shù)生長期的HepG2 和HepG2/ADM細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液，以1×108/L的細(xì)胞密度接種于6孔板中，每孔2 mL。每組設(shè)3個復(fù)孔。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后: HepG2組和HepG2/ADM組換為無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)1 h，GNPs+ HepG2/ADM組則加入10 nmol/L GNPs處理1 h，棄上清后使用胰蛋白酶消化細(xì)胞并收集，反復(fù)凍融收集細(xì)胞3次，使樣本細(xì)胞破碎。離心后取樣本細(xì)胞的上清液按照GSH檢測試劑盒的操作說明檢測各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)GSH水平。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

奧氮平治療高致吐化療引起惡心嘔吐的meta分析……………………… 郭 蕊，張晉萍，丁選勝，等（1·30）

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有檢測實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或配對t檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用SNK法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 GNPs對HepG2/ADM細(xì)胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用

MTT檢測結(jié)果顯示，人肝癌HepG2/ADM細(xì)胞對ADM顯示耐藥性，HepG2/ADM組細(xì)胞對ADM的IC50為(29.46±1.73) mg/L，明顯高于HepG2組(P＜0.01)。HepG2/ADM組細(xì)胞對ADM的RF為3.22倍;經(jīng)GNPs處理后，GNPs+ HepG2/ADM組細(xì)胞對ADM的耐藥性降低，IC50為(15.18±0.85) mg/L(P＜0.01)，見圖1。因此，GNPs可有效逆轉(zhuǎn)HepG2/ADM細(xì)胞對ADM的耐藥性，RI為1.95。

Figure 1.The effect of gold nanoparticles on reversing adriamycin resistance of HepG2/ADM cells.Mean±SD.n=3.＊＊P＜0.01 vs HepG2 group;##P＜0.01 vs HepG2/ADM group.圖1 GNPs對HepG2/ADM細(xì)胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用

2 GNPs對HepG2/ADM細(xì)胞凋亡率的影響

GNPs+ ADM組HepG2/ADM細(xì)胞的凋亡率明顯高于ADM組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05) ;單獨(dú)GNPs組與對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見圖2。由此說明，GNPs處理后，ADM誘導(dǎo)HepG2/ADM細(xì)胞凋亡的作用增強(qiáng)，GNPs本身對細(xì)胞無明顯的毒副作用。

3 GNPs增加HepG2/ADM細(xì)胞內(nèi)的ADM含量

紫外分光光度計(jì)檢測結(jié)果顯示，HepG2/ADM組細(xì)胞內(nèi)ADM含量低于HepG2組細(xì)胞內(nèi)ADM含量(P＜0.01) ;經(jīng)GNPs作用后，HepG2/ADM細(xì)胞內(nèi)的ADM含量明顯增加(P＜0.01)，見圖3。由此說明，GNPs能明顯增加HepG2/ADM細(xì)胞內(nèi)ADM的積聚。

4 GNPs降低HepG2/ADM細(xì)胞內(nèi)GSH含量

HepG2/ADM組細(xì)胞內(nèi)的GSH含量高于HepG2組細(xì)胞內(nèi)GSH含量(P＜0.01) ;經(jīng)GNPs處理后，HepG2/ADM細(xì)胞內(nèi)的GSH含量較HepG2/ADM組明顯降低(P＜0.05)，見圖4。由此說明，GNPs能降低HepG2/ADM細(xì)胞內(nèi)GSH含量。

討論

化療是治療腫瘤，尤其是惡性腫瘤的重要手段之一，但是由于肝癌細(xì)胞多藥耐藥作用的存在，使得許多肝癌患者化療效果并不理想。研究肝癌多藥耐藥性的逆轉(zhuǎn)，從而提高肝癌的化療效果是急需解決的問題。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥的機(jī)制主要包括通過ATP-結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白增加藥物的外排，通過谷胱甘肽系統(tǒng)增加對抗腫瘤藥物的解毒作用等［8-11］。另有相關(guān)研究［12］表明谷胱甘肽也與腫瘤細(xì)胞的主動外排作用密切相關(guān)。陳家念等［13］總結(jié)發(fā)現(xiàn)納米粒給藥系統(tǒng)可以逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性。納米金是金的納米粒子，在腫瘤治療方面具有很大的潛能［3］，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，GNPs可以增加腫瘤細(xì)胞對表柔比星的敏感性［7］及增加化療藥物順鉑對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用［14］，那么納米金可能具有逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥性的作用。

本研究從GNPs誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞HepG2/ADM凋亡、影響胞內(nèi)藥物濃度及胞內(nèi)GSH含量方面初步探討了GNPs對HepG2/ADM細(xì)胞耐藥性的影響。由MTT結(jié)果可知經(jīng)GNPs處理后，HepG2/ADM的耐藥倍數(shù)降低。GNPs可以逆轉(zhuǎn)HepG2/ADM細(xì)胞對ADM的耐藥性。同時，結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果，GNPs處理后HepG2/ADM細(xì)胞的凋亡率明顯增高。更進(jìn)一步證明，納米金可以逆轉(zhuǎn)肝癌耐藥細(xì)胞株HepG2/

ADM對ADM的耐藥性。

Figure 2.Apoptotic rates of HepG2/ADM cells.Mean±SD.n=3.＊＊P＜0.01 vs control group;#P＜0.05 vs ADM group.圖2 GNPs對HepG2/ADM細(xì)胞凋亡率的影響

Figure 3.The concentration of ADM in HepG2/ADM or HepG2 cells.Mean±SD.n=3.＊＊P＜0.01 vs HepG2 group;##P＜0.01 vs HepG2/ADM group.圖3 HepG2/ADM和HepG2細(xì)胞內(nèi)ADM的含量

Figure 4.The content of GSH in HepG2/ADM or HepG2 cells.Mean±SD.n=3.＊＊P＜0.01 vs HepG2 group;##P＜0.01 vs HepG2/ADM group.圖4 HepG2和HepG2/ADM細(xì)胞內(nèi)GSH的含量

GSH參與癌細(xì)胞耐藥的機(jī)制目前認(rèn)為與多藥耐藥相關(guān)蛋白(multidrug resistance-associated protein，MRP)和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione-S-transferase，GST)相關(guān)，GSH是人類細(xì)胞質(zhì)中自然合成的一種肽，由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成，含有巰基，是細(xì)胞內(nèi)抗氧化體系的重要組成部分，同時，GSH作為細(xì)胞內(nèi)的一種主要電子供體，在GST催化下可與許多親電子性藥物、毒物結(jié)合。GST本身也可與許多親脂性藥物結(jié)合，從而促進(jìn)抗腫瘤藥物的解毒與外排。而MRP發(fā)揮作用也與細(xì)胞內(nèi)足夠的GSH相關(guān)［15］。本研究結(jié)果顯示，耐藥細(xì)胞株HepG2/ADM 中GSH含量明顯高于非耐藥細(xì)胞HepG2; HepG2/ADM細(xì)胞內(nèi)ADM濃度低于HepG2細(xì)胞。這與韓曉群、劉明華等［12，16-17］研究結(jié)果相一致:谷胱甘肽參與腫瘤細(xì)胞的的主動外排作用，并且腫瘤細(xì)胞內(nèi)GSH含量的增高與MDR密切相關(guān)。因此，結(jié)合本研究結(jié)果，經(jīng)GNPs處理后，HepG2/ADM胞內(nèi)ADM含量明顯增加、GSH含量降低。我們推測，納米金與細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的巰基結(jié)合形成很強(qiáng)的共價(jià)鍵［18］后，減少了ADM與谷胱甘肽的結(jié)合，從而影響耐藥細(xì)胞HepG2/ADM對ADM的外排作用，增加了胞內(nèi)ADM藥物濃度，進(jìn)而逆轉(zhuǎn)了HepG2/ADM細(xì)胞對ADM的耐藥性。另外，我們前期研究［7，14］表明，GNPs還可以通過改變腫瘤細(xì)胞表面超微結(jié)構(gòu)，增加細(xì)胞對化療藥物的內(nèi)吞作用，從而增加胞內(nèi)化療藥物濃度。

綜上所述，納米金具有逆轉(zhuǎn)耐藥肝癌細(xì)胞對阿霉素耐藥性的作用，并且可以降低細(xì)胞內(nèi)GSH含量及增加胞內(nèi)化療藥物濃度。關(guān)于其更詳盡的細(xì)胞機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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通訊作者△Tel: 020-38688358; E-mail: tpanyl@ jnu.edu.cn

*［基金項(xiàng)目］國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81472849) ;廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.2014A030313383) ;暨南大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院科研培育基金資助項(xiàng)目(No.511005004)

［收稿日期］2014-12-02

［文章編號］1000-4718(2015)06-1014-05

［中圖分類號］730.23

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.06.009