間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基激活Nrf2/ARE通路對(duì)抗H2O2致H9c2細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷*

董　曦，孫桂波，羅　云，陳素紅，孫曉波

(1中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京100193;2溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，浙江溫州325035)

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間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基激活Nrf2/ARE通路對(duì)抗H2O2致H9c2細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷*

董曦1，2，孫桂波1△，羅云1，陳素紅2，孫曉波1△

(1中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京100193;2溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，浙江溫州325035)

［摘要］目的:探討間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)條件培養(yǎng)基(MSCCM)對(duì)氧化應(yīng)激損傷的心肌細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制。方法:用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)MSC進(jìn)行鑒定，再用MTT實(shí)驗(yàn)確定MSCCM對(duì)抗H2O2氧化應(yīng)激損傷的最佳孵育時(shí)間。將H9c2細(xì)胞分為正常組、模型組、模型+ MSCCM組和MSCCM組。模型+ MSCCM組和MSCCM組均用MSCCM進(jìn)行預(yù)孵育24 h，模型組和模型+ MSCCM組用濃度為300 μmol/L的H2O2作用4 h模擬心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)損傷后心肌細(xì)胞的線粒體膜電位變化、凋亡比率等指標(biāo)，通過(guò)熒光顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞ROS產(chǎn)生的變化，Western blot檢測(cè)Nrf2/ARE通路的相關(guān)蛋白表達(dá)。結(jié)果: MSCCM組心肌細(xì)胞的線粒體膜電位、凋亡比率和ROS產(chǎn)生與正常組相比均無(wú)顯著差異(P＞0.05) ;模型+ MSCCM組的線粒體膜電位、凋亡比例和ROS產(chǎn)生與模型組相比差異顯著(P＜0.01) ;在0 h到24 h這段時(shí)間內(nèi)，心肌細(xì)胞Nrf2/ARE通路中的Nrf2核轉(zhuǎn)位與HO-1表達(dá)均隨著MSCCM孵育時(shí)間延長(zhǎng)而增加。結(jié)論: MSCCM可以保護(hù)心肌細(xì)胞，對(duì)抗H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷，其機(jī)制可能與激活Nrf2/ARE通路有關(guān)。

［關(guān)鍵詞］間充質(zhì)干細(xì)胞;條件培養(yǎng)基;心肌細(xì)胞;氧化應(yīng)激

［修回日期］2015-03-25

MSC-conditioned medium activates Nrf2/ARE pathway to protect H9c2 cells against oxidative stress

DONG Xi1，2，SUN Gui-bo1，LUO Yun1，CHEN Su-hong2，SUN Xiao-bo1
(1Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100193，China;2School of Pharmaceutical Sciences，Wenzhou Medical University，Wenzhou 325035，China.E-mail: sunguibo@126.com; sun-xiaobo@163.com)

［ABSTRACT］AIM: To investigate the protective effect of mesenchymal stem cell (MSC) -conditioned medium (MSCCM) on myocardial cell line H9c2 and its mechanism.METHODS: Verification of MSC was performed by flow cytometry analysis，followed by MTT assay to determine the optimal incubation time of MSCCM with myocardial cells.The cells were divided into 4 groups: normal (N) group，model (M) group，M+ MSCCM group and MSCCM group.The cells in M+ MSCCM group and MSCCM group were pre-incubated with MSCCM for 24 h.The cells in M group and M+ MSCCM group were treated with 300 μmol/L H2O2for 4 h to imitate oxidative injury of myocardial cells.Mitochondrial membrane potential and apoptotic rate of injured myocardial cells were detected by flow cytometry.The ROS production was measured by fluorescence microscopy.The nuclear translocation of Nrf2 and expression of HO-1 was examined by Western blot.RESULTS: No difference of mitochondrial membrane potential，apoptotic rate or ROS production between MSCCM group and N group was observed (P＞0.05).The mitochondrial membrane potential depolarization，apoptotic rate and ROS production in M+ MSCCM group were significantly lower than those in M group (P＜0.01).The nuclear translocation of Nrf2 and expression of HO-1 in the myocardial cells were increased with MSCCM incubation time prolonged.CONCLUSION: MSCCM protects the myocardial cells against oxidative injury induced by H2O2.The anti-oxidative mechanism would be associated with the activation of Nrf2/ARE pathway.

［KEY WORDS］Mesenchymal stem cells; Conditioned medium; Myocardial cells; Oxidative stress

缺血性心臟病是指由于冠狀循環(huán)改變引起的冠狀動(dòng)脈血流與心肌需求之間不平衡而導(dǎo)致的心肌損傷，又稱為冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病。缺血性心臟病的基本治療原則是恢復(fù)血流再灌，但當(dāng)心肌缺血經(jīng)過(guò)一定時(shí)期后，即使恢復(fù)血流再灌，心肌損傷反有加重，人們稱這種現(xiàn)象為心肌缺血/再灌注損傷(ischemia/reperfusion，I/R)［1］。在缺血階段，心臟的血液及養(yǎng)分供給不足，導(dǎo)致心肌細(xì)胞的凋亡及壞死。而當(dāng)血液再灌注至缺血部位，由于氧供給的突然增加，缺血部位會(huì)產(chǎn)生過(guò)量的活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，造成該部位的氧化損傷以及心肌細(xì)胞死亡［2］。有研究表明，再灌注過(guò)程中產(chǎn)生的過(guò)量ROS會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡及心臟功能異常［3］。

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSC)具有組織再生、修復(fù)以及旺盛的分泌能力，有關(guān)MSC的研究已經(jīng)開(kāi)展至臨床階段。更有研究指出MSC對(duì)心絞痛及心肌梗死等缺血性心臟病有著顯著的治療作用［4-5］。目前研究主要集中在MSC對(duì)心臟病的改善，而有證據(jù)表明MSC所分泌的因子是發(fā)揮修復(fù)作用的重要部分［6-7］。MSC條件培養(yǎng)基(MSC-conditioned medium，MSCCM)是指與MSC共孵育一段時(shí)間的培養(yǎng)基，MSC條件培養(yǎng)基內(nèi)含有MSC分泌的各種因子，并被證實(shí)對(duì)氧化應(yīng)激造成的損傷有治療作用［8］。

Nrf2/ARE是細(xì)胞抵抗氧化、化學(xué)等刺激的防御性轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，并在缺血性心臟病中起著重要的治療作用［9］。在Nrf2/ARE通路中，活化的Nrf2轉(zhuǎn)錄因子可以促進(jìn)細(xì)胞Ⅱ相解毒酶、抗氧化酶等的轉(zhuǎn)錄，清除過(guò)量的ROS，保持細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的平衡，并減輕ROS對(duì)細(xì)胞的損傷［10］。由于Nrf2通路具有突出的抗氧化作用，以及細(xì)胞氧化損傷是缺血性心臟病中重要的致病機(jī)制，許多文章都在研究Nrf2通路對(duì)于缺血性心臟病中細(xì)胞損傷的治療作用。這些研究結(jié)果表明，Nrf2通路可以緩解心肌細(xì)胞由于缺血再灌注產(chǎn)生的氧化損傷［11］，降低氧化應(yīng)激損傷誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡［12］，在心肌梗死中保護(hù)心肌細(xì)胞［13］。

然而，關(guān)于MSCCM對(duì)心肌細(xì)胞的抗氧化保護(hù)作用，以及MSCCM對(duì)Nrf2/ARE通路的調(diào)控的研究還比較少。因此，本研究將通過(guò)H2O2誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞損傷模型，來(lái)探索MSCCM對(duì)心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用以及其對(duì)Nrf2/ARE通路的影響，以期了解MSCCM的作用機(jī)制并對(duì)臨床做出指導(dǎo)。

材料和方法

1實(shí)驗(yàn)材料

DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco; MTT和胰酶購(gòu)自Amresco; FBS購(gòu)自四季青公司; ROS檢測(cè)試劑及凋亡檢測(cè)試劑購(gòu)自Invitrogen; JC-1試劑購(gòu)自ENZO; DMSO購(gòu)自Sigma;流式抗體CD29、CD73、CD45和CD34購(gòu)自BD; Western blot I抗Nrf2、HO-1、β-actin和lamin B購(gòu)自Santa Cruz; Western blot相關(guān)II抗購(gòu)自中杉金橋公司。

2間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基制備

機(jī)械法分離人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，無(wú)菌條件下分離華通氏膠，剪碎后培養(yǎng)于含10% FBS血清的DMEM培養(yǎng)基中，2周后MSC從華通氏膠中爬出并貼壁，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，消化并傳代。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至3～4代，并80%融合時(shí)，向細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入新鮮無(wú)血清培養(yǎng)基，然后收集孵育12 h、24 h和36 h的間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基。

3實(shí)驗(yàn)方法

3.1流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞表型取培養(yǎng)至第3代的MSC，300×g離心5 min，棄上清，PBS洗2遍。用100 μL PBS重懸，加入5 μL熒光標(biāo)記抗體，室溫避光孵育20 min，加入1 mL PBS，300×g離心5 min，然后用500 μL PBS重懸，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

3.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率取第3代的MSC，重懸至1×108/L，鋪在96孔平底板中，每孔200 μL。將實(shí)驗(yàn)組分為5組，正常組內(nèi)加入新鮮無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，0 h、12 h、24 h、36 h組分別加入新鮮無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基(即模型組)、12 h間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基、24 h間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基、36 h間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基后與H9c2細(xì)胞共孵育24 h。然后向0 h、12 h、24 h、36 h組加入無(wú)血清培養(yǎng)基配制的300 μmol/L H2O2并孵育4 h。孵育結(jié)束后，吸棄間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基，并加入200 μL(1 g/L) MTT，孵育4 h。然后加入200 μL DMSO，混勻后在570 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組光吸收值/對(duì)照組光吸收值)×100%。

3.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)線粒體膜電位及凋亡取培養(yǎng)至第3代的MSC，重懸至1×108/L，鋪在6孔平底板中，每孔2 mL。實(shí)驗(yàn)組分為正常(normal，N)組、模型(model，M)組、M+ MSCCM組和MSCCM組。用步驟3.2中確定的最佳時(shí)點(diǎn)的MSCCM與M+ MSCCM組及MSCCM組的H9c2細(xì)胞共孵育24 h，用300 μmol/L H2O2溶液對(duì)模型組與M+ MSCCM組造模，其它2組換成新鮮無(wú)血清DMEM。4 h后消化細(xì)胞，用無(wú)血清DMEM配制的2 μmol/L JC-1探針與各組H9c2細(xì)胞于37℃下避光孵育15 min，再用PBS 洗2次，然后用500 μL PBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè);利用Annexin V/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，先用試劑盒內(nèi)的200 μL binding buffer重懸各組細(xì)胞，再用5 μL FITC標(biāo)記的Annexin V工作液與1 μL PI工作液共同孵育細(xì)胞懸液15 min，然后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

3.4熒光顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基水平

按照步驟3.3中的方法處理細(xì)胞，然后向培養(yǎng)板中加入用無(wú)血清DMEM配制的25 μmol/L的ROS探針，與各組H9c2細(xì)胞于37℃下避光孵育30 min，再用PBS洗2次。用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察拍照。之后用Image-Pro Plus進(jìn)行分析。

3.5 Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)按照步驟3.3中的方法處理各組細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞1次并消化，400×g 10 min離心細(xì)胞，并加入細(xì)胞裂解液400 μL重懸，于4℃裂解1 h。800×g 15 min離心，收集上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度。每組取20 μg的總蛋白，12% SDS-PAGE分離蛋白，用電轉(zhuǎn)移法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉3 h，分別加入兔抗小鼠Nrf2、HO-1、β-actin和lamin B I 抗(均為1∶200稀釋)，4℃孵育過(guò)夜; TBST溶液洗滌3次，每次15 min，加入辣根素過(guò)氧化酶標(biāo)記的羊抗鼠II抗，室溫孵育4 h，TBST溶液洗膜3次，每次15 min，以增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色、曝光，定量測(cè)定各條帶密度，以β-actin進(jìn)行校正。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，正態(tài)分布資料采用單因素方差分析，非正態(tài)分布資料轉(zhuǎn)成正態(tài)分布后再采用單因素方差分析;計(jì)數(shù)資料采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 MSC的鑒定

間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過(guò)分離并培養(yǎng)至第3代，經(jīng)鑒定其CD29和CD73表達(dá)為陽(yáng)性，CD34和CD45表達(dá)為陰性，符合MSC特征，見(jiàn)圖1。

2 MSCCM對(duì)H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

MTT結(jié)果顯示，孵育24 h的MSCCM對(duì)H2O2損傷的H9c2細(xì)胞有較好的保護(hù)作用，其與0 h相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01) ; 36 h的MSCCM也對(duì)H9c2細(xì)胞具有保護(hù)作用(P＜0.05) ;而其它時(shí)點(diǎn)的MSCCM對(duì)H2O2損傷的H9c2細(xì)胞無(wú)明顯作用(P＞0.05)，見(jiàn)圖1。

Figure 1.Identification of MSC and protective effect of MSCCM on oxidatively injured H9c2 cells.Mean±SD.n=3.##P＜0.01 vs N group;*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs 0 h group.圖1 MSC的鑒定與MSCCM保護(hù)受氧化損傷的H9c2細(xì)胞

3 MSCCM對(duì)H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位及活性氧自由基水平變化的作用

本研究利用紅綠熒光的比例來(lái)表示線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)去極化的程度。與模型組相比，MSCCM可顯著緩解H9c2細(xì)胞的MMP去極化，M+ MSCCM組的紅綠熒光比值較模型組顯著升高(P＜0.01)，MSCCM組與正常組無(wú)顯著差異(P＞0.05)。本研究又利用熒光顯微鏡觀察了MSC條件培養(yǎng)基對(duì)H2O2誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞ROS產(chǎn)生的影響。熒光照片結(jié)果表明，與模型組相比，M+ MSCCM組的ROS產(chǎn)生顯著下降(P＜0.01)，而MSCCM組與正常組無(wú)顯著差異(P＞0.05)。因此，孵育24 h的MSCCM對(duì)于H2O2誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞的ROS產(chǎn)生和MMP去極化都有抑制作用，見(jiàn)圖2。

Figure 2.Protective effect of MSCCM on depolarization of MMP and ROS production in oxidatively injured H9c2 cells.Mean±SD.n=3.##P＜0.01 vs N group;＊＊P＜0.01 vs M group.圖2 MSCCM對(duì)氧化損傷的H9c2細(xì)胞的線粒體膜電位去極化與ROS產(chǎn)生的影響

4 MSCCM對(duì)H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡的影響

與模型組相比，M+ MSCCM組的凋亡比例顯著降低(P＜0.01)。而與正常組相比，MSCCM組細(xì)胞凋亡水平?jīng)]有顯著差異(P＞0.05)，見(jiàn)圖3。

5 MSCCM對(duì)H9c2細(xì)胞抗氧化通路蛋白表達(dá)的影響

根據(jù)Western blot的結(jié)果可知，24 h的MSCCM孵育H9c2細(xì)胞不同時(shí)間，從4 h到24 h，MSC條件培養(yǎng)基逐漸增加Nrf2的核轉(zhuǎn)位以及抗氧化酶HO-1的表達(dá)，見(jiàn)圖4。這表明MSCCM對(duì)H9c2細(xì)胞的保護(hù)至少部分是通過(guò)Nrf2/ARE通路來(lái)發(fā)揮作用的。

討論

在臨床上，缺血再灌注是心肌常見(jiàn)的損傷形式。盡管缺血再灌注的病理生理機(jī)制還未被完全闡明，氧化損傷被認(rèn)為是啟動(dòng)缺血再灌注損傷的重要因素。許多前臨床研究都指出，抑制ROS的生成可以有效地緩解缺血再灌注損傷［14］。我們的研究表明，MSCCM處理24 h可以保護(hù)H9c2細(xì)胞，對(duì)抗H2O2造成的氧化應(yīng)激損傷。而其它時(shí)點(diǎn)沒(méi)有改善效果。這可能是由于MSC條件培養(yǎng)基內(nèi)有效因子還未至起效濃度，或有害物質(zhì)積累的原因。

氧化應(yīng)激損傷所造成的嚴(yán)重影響之一是造成線粒體膜滲透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)的開(kāi)放。mPTP位于線粒體膜上，其開(kāi)放程度的改變會(huì)引起線粒體膜通透性的改變。當(dāng)線粒體受到氧化應(yīng)激損傷后，mPTP開(kāi)放，引起線粒體膜電位去極化、細(xì)胞色素C釋放、caspase家族活化及細(xì)胞凋亡［15］。線粒體膜電位產(chǎn)生于呼吸氧化過(guò)程中，呼吸產(chǎn)生的能量以電化學(xué)勢(shì)能儲(chǔ)存于線粒體內(nèi)膜，在內(nèi)膜兩側(cè)造成質(zhì)子及其它離子濃度的不對(duì)稱分布形成了線粒體膜電位。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MSCCM能夠顯著降低H9c2細(xì)胞線粒體膜電位去極化水平。在氧化應(yīng)激情況下，ROS會(huì)攻擊心肌細(xì)胞內(nèi)的生物分子，引起線粒體及細(xì)胞核損傷、脂質(zhì)過(guò)氧化等，最終導(dǎo)致突變、蛋白變性。而線粒體損傷又是缺血再灌注后ROS上升的重要原因［16］。MSCCM能夠降低M+ MSCCM組的ROS產(chǎn)生，這些結(jié)果表明MSCCM可以對(duì)抗H2O2的氧化應(yīng)激損傷，保護(hù)心肌細(xì)胞線粒體，減少線粒體因損傷而釋放的ROS。

細(xì)胞凋亡是引起心肌細(xì)胞死亡的另一重要機(jī)制，同時(shí)也是細(xì)胞線粒體損傷的后續(xù)事件。細(xì)胞凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞程序性死亡。細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死不同，細(xì)胞凋亡不是一個(gè)被動(dòng)的過(guò)程，而是主動(dòng)過(guò)程，它涉及一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控等的作用。長(zhǎng)期以來(lái)，人們普遍認(rèn)為壞死是心肌細(xì)胞死亡的唯一方式，而后續(xù)研究則認(rèn)為凋亡也是心肌細(xì)胞死亡的重要原因［17］。在臨床上，冠狀動(dòng)脈介入是缺血性心臟病的重要診療手段。然而，在冠狀動(dòng)脈介入術(shù)后，會(huì)發(fā)生缺血再灌注損傷，出現(xiàn)一過(guò)性低血壓、再灌注心律失常、心功能不全、心源性休克甚至是猝死。心肌細(xì)胞凋亡則被認(rèn)為是這些缺血再灌注損傷的重要原因［18］。本研究用Annexin V/PI雙染法分析MSCCM對(duì)氧化損傷的H9c2細(xì)胞的保護(hù)作用，結(jié)果表明，MSCCM可以緩解心肌細(xì)胞的凋亡。這與MSCCM對(duì)線粒體的保護(hù)作用一起表明，MSCCM可以抑制因氧化應(yīng)激而造成的依賴于線粒體的細(xì)胞凋亡，展現(xiàn)出治療缺血性心臟病的潛在能力。

MSCCM可激活MAPK及PI3K/Akt通路達(dá)到保護(hù)作用［19］，本研究則嘗試根據(jù)MSCCM的抗氧化作用來(lái)探索它對(duì)Nrf2/ARE通路的影響。Nrf2/ARE通路是抗氧化的重要通路，Nrf2與Keap1以無(wú)活性的2聚體形式存在于細(xì)胞漿內(nèi)，當(dāng)受到外界氧化、化學(xué)刺激后，Nrf2與Keap1分離，轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核。在細(xì)胞核內(nèi)Nrf2與Maf、抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element，ARE)結(jié)合并調(diào)控抗氧化酶的表達(dá)［16，20］。由Western blot的結(jié)果可知，隨著時(shí)間的推移，MSCCM可以促進(jìn)Nrf2的核轉(zhuǎn)位以及其所調(diào)控的抗氧化酶HO-1的表達(dá)。這表明MSCCM可以活化Nrf2/ARE通路，并增加其下游抗氧化酶的表達(dá)。

綜上所述，本研究表明MSCCM可以保護(hù)心肌細(xì)胞，對(duì)抗心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷。目前，有大量的研究工作都集中在MSC對(duì)疾病的治療及組織的修復(fù)上，并發(fā)展到臨床階段。盡管關(guān)于MSCCM的研究已經(jīng)逐漸走入科研工作者的視線，并在各領(lǐng)域都有所涉及。然而MSCCM對(duì)于心肌細(xì)胞的保護(hù)作用還鮮有研究，本結(jié)果提示這些條件培養(yǎng)基可能在臨床上具有潛在的治療價(jià)值。由于MSC具有旺盛的分泌能力，目前已知的MSC分泌因子已達(dá)數(shù)十種。相信除抗氧化外，MSCCM還具有其它的功能，對(duì)其妥善的應(yīng)用也許可以使MSC的用途更加廣泛。

Figure 3.Protective effect of MSCCM on apoptotic rate of oxidatively injured H9c2 cells.Mean±SD.n=3.##P＜0.01 vs N group;＊＊P＜0.01 vs M group.圖3 MSCCM對(duì)氧化損傷的H9c2細(xì)胞凋亡的影響

Figure 4.The effect of MSCCM on anti-oxidative signal pathway of H9c2 cells.Mean±SD.n=3.##P＜0.01 vs 4 h group;＊＊P＜0.01 vs 8 h group;△△P＜0.01 vs 12 h group.圖4 MSCCM對(duì)氧化損傷H9c2細(xì)胞抗氧化信號(hào)通路的影響

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通訊作者△孫桂波Tel: 010-57833220; E-mail: sunguibo@126.com;孫曉波Tel: 010-57833013; E-mail: sun-xiaobo@163.com

*［基金項(xiàng)目］國(guó)家重大新藥創(chuàng)制項(xiàng)目(No.2012ZX09501001004; No.2012ZX09301002-001)

［收稿日期］2015-02-09

［文章編號(hào)］1000-4718(2015)06-0961-06

［中圖分類號(hào)］R363.2

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.06.001