大蒜汁液對(duì)雞源致病菌的抑菌作用研究＊

楊偉平，張海艷，韓建明，牛菁華，王育娜，陳萬(wàn)光

（河南洛陽(yáng)師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河南洛陽(yáng)471022）

大蒜是一種可食植物，它不僅富含蛋白質(zhì)、糖類、多種維生素及礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分，而且還含有至少33種硫化物、多種活性酶類及17種氨基酸，此外還包括一些甾體酯苷和凝集素等，作為藥用植物而越來(lái)越受到人們關(guān)注［1－2］。目前，大蒜已在人類和動(dòng)物疾病治療中被證明是一種有效的降血脂藥、抗菌劑、降壓藥、保肝藥、殺蟲劑，此外大蒜還具有抗腫瘤、降低血清中膽固醇的水平，增加血液凝集等生物學(xué)特性［1，3，4］。目前，商品化的包含大蒜粉的膠囊和藥片作為食品添加劑已成為國(guó)際保健品市場(chǎng)上倍受青睞［5－6］。在動(dòng)物生產(chǎn)中，大蒜作為一種飼料添加劑添，不僅能夠增強(qiáng)動(dòng)物食欲，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，改善肉蛋的品質(zhì)［7－9］，減少重金屬在肝臟的積累［10］，還能刺激免疫系統(tǒng)，控制多種病原體，尤其是細(xì)菌、真菌、一些耐酸細(xì)菌以及耐抗生素性細(xì)菌［3，11］。研究發(fā)現(xiàn)，在大蒜中起殺菌、抑菌作用的主要是大蒜素和其它一些有揮發(fā)性的硫醚化合物［11－12］，其抑菌能力比其他蔥屬植物要高的多［1］。因此，大蒜做為一種純天然的綠色無(wú)污染的防腐保鮮劑，在國(guó)內(nèi)外的食品儲(chǔ)藏保鮮中一直被廣泛研究并應(yīng)用［13－17］。

本文使用不同濃度的大蒜汁液對(duì)致病性大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌及雞蛋表面多種雜菌混合物進(jìn)行抑菌分析，旨在為大蒜作為一種安全防腐保鮮劑能在雞蛋保鮮中應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

普通紫皮大蒜，無(wú)芽，無(wú)蟲，購(gòu)于某超市。致病性大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌由西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院曹斌云教授的試驗(yàn)室提供。雞蛋表面的混合菌是用一小塊無(wú)菌的紗布沾取無(wú)菌的生理鹽水擦拭儲(chǔ)藏1周的雞蛋表面，然后置于無(wú)菌的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃，220rpm條件下?lián)u菌培養(yǎng)12h所得。

1.2 致病菌細(xì)菌的活化培養(yǎng)

試驗(yàn)前，把在－80℃凍存的大腸桿菌和沙門氏菌、金黃色葡萄球菌在無(wú)菌的LB固體培養(yǎng)基上劃線活化培養(yǎng)，然后分別挑各菌株的單克隆接種于相應(yīng)編號(hào)的經(jīng)高壓滅菌的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，220rpm條件下轉(zhuǎn)接培養(yǎng)2代?；罨蟮拇竽c桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌以0.1%的接種量接種至液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h。取各菌液適量分別于4 000rpm條件下離心15min收集菌體，菌體用無(wú)菌PBS液（pH 7.4）洗滌2次，最后用等體積的無(wú)菌PBS液重懸菌體。然后通過平板計(jì)數(shù)法調(diào)整各致病菌的濃度至1×108CFU／mL左右。

1.3 不同濃度大蒜汁液的制備

稱取一定重量的剝皮的大蒜放入組織勻漿機(jī)中制備汁液，然后先用無(wú)菌紗布擠壓過濾，再用0.45 μm的無(wú)菌微孔濾膜過濾，獲得一定體積的無(wú)菌大蒜原汁液。然后用無(wú)菌蒸餾水將大蒜原汁液分別稀釋至濃度為75%，50%，25%，10%，5%的稀釋液，放置4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 大蒜汁液的抑菌能力－牛津杯法

將滅菌的固體LB固體培養(yǎng)基冷卻至60℃左右，準(zhǔn)確量取10mL，加入預(yù)先水平放置的培養(yǎng)皿內(nèi)，將無(wú)菌的牛津杯放入預(yù)先倒入并凝固的LB固體培養(yǎng)基中，分別將濃度為1×108CFU／mL的致病菌以1%接種量加入溫度為50℃左右的LB固體培養(yǎng)基中，搖勻，倒板，每個(gè)板25mL左右，凝固后去掉牛津杯。然后取不同濃度的大蒜汁液150μL分別加入固體培養(yǎng)基的杯孔中，置于37℃的恒培溫養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h，測(cè)量抑菌圈直徑（Inhibitory zone diameter，IZD）。每個(gè)處理做3個(gè)重復(fù)取平均值。

1.5 大蒜汁液最小抑菌濃度及最低殺菌濃度測(cè)定

將濃度為10%的大蒜汁液與LB液體培養(yǎng)基按2倍稀釋法稀釋，配制成大蒜汁濃度為5%，2.5%，1.25%，0.63%，0.31%，0.16%，0.08%的培養(yǎng)液各2mL，然后取濃度為1×108CFU／mL的各致病菌液1mL接種至體積為2mL的含不同大蒜汁濃度的培養(yǎng)基中，搖勻，37℃培養(yǎng)24h后，從以上各試驗(yàn)管中分別吸取0.1mL培養(yǎng)液，涂布于各固體LB培養(yǎng)板中于37℃條件下，培養(yǎng)24h，以平板上細(xì)菌落數(shù)≤50為大蒜汁液的最小抑菌濃度（MIC）［18－19］，將大蒜汁液濃度高于MIC的各管培養(yǎng)物各吸取0.1 mL涂布于LB固體培養(yǎng)板培養(yǎng)板中，37℃，培養(yǎng)24 h，以菌落數(shù)≤5的蒜汁濃度為最低殺菌濃度（MBC）［20］。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)前處理，用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多重比較采用Dancan法，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”。

2 結(jié)果與分析

表1 不同濃度大蒜汁液對(duì)致病菌的抑菌結(jié)果（n＝3）Table 1 Antibacterial effect of the different concentrations of garlic juice on pathogens

2.1 不同濃度大蒜汁液的體外抑菌能力

由表1可以看出，大蒜汁液對(duì)各致病抑菌均有一定的抑制作用，抑菌能力隨著其濃度的減小而降低。大蒜汁在同一濃度條件下，對(duì)各致病菌的抑菌能力依次為：沙門氏菌＞大腸桿菌＞金黃色葡萄球菌＞雞蛋表面混合菌，其中大蒜汁對(duì)沙門氏菌、大腸桿菌和雞蛋表面混合菌的抑菌能力呈差異性顯著（P＜0.05）。

2.2 不同濃度的大蒜汁液的MIC和MBC

本試驗(yàn)以LB平板上細(xì)菌落數(shù)≤50為大蒜汁液的MIC，在MIC的基礎(chǔ)上，研究了大蒜汁液的MBC，并以LB平板上細(xì)菌落數(shù)≤5為大蒜汁液的MBC。由表2和表3試驗(yàn)結(jié)果看，大蒜汁液在對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌的MIC和MBC均分別為1.25%和2.5%，對(duì)金黃色葡萄球菌和雞蛋表面混合菌的MIC和MBC均分別為5%和7.5%。由此可見，大蒜汁液對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌能力要強(qiáng)于金黃色葡萄球菌和雞蛋表面的混合菌。

3 討 論

大蒜是“地里長(zhǎng)出來(lái)的抗生素”，因能夠抑制和殺滅多種革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌，因此有“天然廣譜抗生素”之稱［21］。研究指出，大蒜對(duì)來(lái)自糞便的細(xì)菌高度敏感，其中對(duì)革蘭氏陰性菌最為敏感［22］，并且能夠特異性的抑制腸道的有害細(xì)菌［11］。雞蛋在儲(chǔ)存的過程中，引起雞蛋腐敗變質(zhì)的微生物主要有大腸桿菌、沙門氏菌、金色葡萄球菌［23］。本試驗(yàn)研究了大蒜汁液對(duì)對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌，金黃色葡萄球菌及雞蛋表面細(xì)菌的抑菌能力。結(jié)果表明，不同濃度的大蒜汁液對(duì)以上致病菌均有一定抑制作用，其對(duì)致病菌的抑菌能力由大到小依次為沙門氏菌＞大腸桿菌＞金黃色葡萄球菌。在大蒜汁濃度為50%時(shí)，其抑菌圈的直徑均在28mm以上，試驗(yàn)結(jié)果高于I walokun等［21］和蘇鳳賢［24］的試驗(yàn)結(jié)果，但低于陳洪生［25］試驗(yàn)結(jié)果。研究還表明，大蒜汁液對(duì)致病菌的抑菌強(qiáng)度與抗生素［21］、化學(xué)防腐劑苯甲酸鈉和山梨酸鉀的抑菌效果相當(dāng)［24］。

表2 大蒜汁液的最小抑菌濃度Table 2 Minimal inhibitory concentration of garlic juice %

表3 大蒜汁液的最小殺菌濃度Table 3 Minimal bactericidal concentration of garlic juice

此外，本試驗(yàn)大蒜汁液對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌的MIC均為1.25%，對(duì)金黃色葡萄球菌和雞蛋表面混合菌的MIC均為5%。對(duì)大腸桿菌的MIC低于I walokun［21］，雷曉燕［26］和陳洪生［25］的試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)沙門氏菌的MIC高于蘇鳳賢［24］的研究結(jié)果，對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC低于陳洪生［25］和雷曉燕［26］的試驗(yàn)結(jié)果，而與I walokun的試驗(yàn)結(jié)果相近。對(duì)于MBC，大蒜汁對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MBC均低于陳曉月等研究結(jié)果［27］，對(duì)沙門菌的MBC高于蘇鳳賢［24］研究結(jié)果。由此可見，大蒜汁對(duì)各致病菌的抑菌能力，MIC和MBC在不同的研究中均有不同結(jié)果，但試驗(yàn)中不同濃度的大蒜汁液對(duì)各致病菌表現(xiàn)出的抑制能力多數(shù)優(yōu)于以上研究者的試驗(yàn)結(jié)果。這可能是與大蒜的品種、種植的地域以及新鮮程度有關(guān)［28－29］，如李曉亮［30］，周延峰［31］，Llamas等［28］均研究表明紫皮大蒜的抑菌和抗菌能力優(yōu)于白皮大蒜。此外，不同方法獲取的大蒜汁，其抑制的微生物種類、抑菌活性差異較大，因在制備過程中會(huì)不同程度地改變或損失某些抑菌成分的活性［22］，還有，不同的抑菌試驗(yàn)方法，LB平板的抑菌孔中加大蒜汁液量的多少，以及菌種來(lái)源，懸菌液被稀釋的濃度、接種量均會(huì)影響其抑菌能力［24］。

由以上研究可以看出，大蒜汁液致病菌有強(qiáng)的抑菌和殺菌能力。因此，將大蒜汁液作為生物防腐劑或保鮮劑對(duì)雞蛋保鮮具有可能。在國(guó)內(nèi)，許多研究工作者采用不同藥用植物的提取液對(duì)雞蛋進(jìn)行了保鮮研究。如王嬋等［23］在四種植物的乙醇提取液對(duì)雞蛋保鮮效果的比較研究中指出，金銀花提取液對(duì)雞蛋的保鮮效果最佳，儲(chǔ)藏35d后好蛋率為100%。王勁松等［33］用殼聚糖、蜂膠和金銀花的保鮮劑對(duì)雞蛋保鮮，也取得了好的保鮮效果，其中殼聚糖的效果最佳。而在國(guó)外，新型的含大蒜油的抗菌塑料包裝對(duì)即時(shí)熟食食品已經(jīng)起到了一定的保鮮作用［14］。因此，如果我們將大蒜提取液和其他一些具有抑菌作用作用的生物材料做成復(fù)保鮮劑對(duì)雞蛋進(jìn)行涂膜保鮮，也不失為一種很好的保鮮方法。

4 結(jié) 論

不同濃度的大蒜汁液對(duì)各致病菌均有一定的抑菌能力，其抑菌能力大小依次為沙門氏菌＞大腸桿菌＞金黃色葡萄球菌＞雞蛋表面混合菌。大蒜汁液在對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌的MIC和MBC均分別為1.25%和2.5%，對(duì)金黃色葡萄球菌和雞蛋表面混合菌的MIC和MBC均分別為5%和7.5%。因此，將大蒜汁液作為生物防腐劑或保鮮劑對(duì)雞蛋保鮮具有可能。

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