褪黑素在牛卵母細(xì)胞體外受精中的抗氧化作用＊

李曉霞，劉 燕，曹平華，韓文霞，姚昱君，祝 蕊，禹學(xué)禮

（1.河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院，河南洛陽471003；2.河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院牧業(yè)工程學(xué)院，河南中牟451450）

胚胎體外生產(chǎn)技術(shù)的關(guān)鍵在于胚胎發(fā)育質(zhì)量的優(yōu)劣［1］。相較體內(nèi)培養(yǎng)來說，體外生產(chǎn)胚胎質(zhì)量差，在形態(tài)學(xué)、生理學(xué)和生物化學(xué)方面均與體內(nèi)胚胎存在明顯差異。原因在于體外生產(chǎn)胚胎處于高氧濃度條件下，導(dǎo)致活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）產(chǎn)生過多［2］。ROS是體外胚胎發(fā)育效率低的重要原因，同時高水平的ROS會降低精子活力［3］、使糖酵解酶失活、頂體膜損傷［4］、DNA氧化，最終影響體外受精率和體外胚胎發(fā)育潛能。添加抗氧化劑可減少ROS產(chǎn)生、阻止氧化應(yīng)激效應(yīng)。

褪黑素（Melatonin，MLT）化學(xué)名為N－乙酰－5－甲氧基－色胺，是一種由松果腺合成和分泌的神經(jīng)內(nèi)分泌激素，具有高度親脂性和部分親水性，可彌散穿透各種生理屏障，發(fā)揮強(qiáng)大的抗氧化作用［5］。褪黑素及其代謝物可直接清除ROS、激活抗氧化酶、增加GSH水平、抑制細(xì)胞氧化酶產(chǎn)生［6］。尤其在減少細(xì)胞氧化損傷方面，褪黑素是最有效的抗氧化劑［21－23］。褪黑素保護(hù)作用在許多繁殖生物技術(shù)研究中已證實(shí)，如促進(jìn)牛［7－8］和水牛［9］卵母細(xì)胞體外成熟，提高豬［10］、老鼠［11］、倉鼠［12］、人［13］、水牛［14］和羊［15］的精子功能，刺激老鼠［16］、牛［17］和綿羊［18］胚胎發(fā)育。然而，關(guān)于牛精子功能研究報道很少，尤其在牛精子獲能方面研究還未見報道。為此，本研究將探討在體外成熟液、獲能液和胚胎培養(yǎng)液中添加MLT對牛卵母細(xì)胞成熟、獲能后精子質(zhì)量和早期胚胎發(fā)育的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑藥品

褪黑素（MLT）（Sigma M5250），TCM3－199（GIBCO公司），促卵泡素FSH、促黃體素LH（中科院動物所），胎牛血清FCS（四季青生物工程有限公司），考馬斯亮藍(lán)G－250（BLOSHARP），其他試劑除特別注明外均購自Sigma Chemical Co。

1.2 卵母細(xì)胞收集和體外成熟

1.2.1 卵巢收集 從屠宰場收集牛卵巢置于35℃含有青霉素、鏈霉素的生理鹽水中，于6h內(nèi)運(yùn)送回實(shí)驗(yàn)室。再用上述生理鹽水洗滌3次備用。

1.2.2 卵母細(xì)胞采集 用帶有12號針頭的10mL一次性注射器抽吸卵巢表面直徑為2～8mm卵泡內(nèi)的卵母細(xì)胞，用體視鏡撿出卵母細(xì)胞，除去蜘蛛網(wǎng)狀卵、透明帶變形卵和裸卵，余下的用于成熟培養(yǎng)。

1.2.3 卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng) 挑選卵丘細(xì)胞包裹兩層以上的COCs經(jīng)成熟培養(yǎng)液清洗2～3遍后，放入預(yù)先平衡過的10－9M MLT［19］的成熟培養(yǎng)液中，其對照組（未添加MLT）采用基礎(chǔ)培養(yǎng)液，然后置于39℃、5%CO2和最大飽和濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)。基礎(chǔ)培養(yǎng)液為TCM199中加入0.5μg／mL FSH、5μg／mL LH和100μM Cysteamine。培養(yǎng)方式為微滴培養(yǎng)法，在30mm培養(yǎng)皿中作6～10個滴（50μL／滴），每滴放25～35枚卵丘－卵母細(xì)胞復(fù)合體，后覆蓋石蠟油靜置培養(yǎng)。

1.2.4 核成熟評估 成熟培養(yǎng)24h后取出牛卵母細(xì)胞，用0.1%的透明質(zhì)酸酶去掉卵丘細(xì)胞，在體視顯微鏡下觀察是否排出PB1，排出PB1則為核成熟的卵母細(xì)胞（圖1）。

1.3 體外受精

1.3.1 精液的處理 將牛細(xì)管凍精從液氮罐取出，立即置于38℃水浴中解凍約30s，用潤濕酒精的紙巾擦拭凍精細(xì)管，而后剪開凍精細(xì)管進(jìn)行精液的處理。采用上游法處理精子，將精子分別緩緩加入預(yù)熱好的內(nèi)含10－3M、10－4M和10－5M MLT的2 mL受精液（含肝素、咖啡因的獲能液）的試管底部，放入39℃、5%CO2和最大飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育45min后，取上清液置于10mL離心管中，離心（1 500rpm）5min后去除上層懸液，留下層大約50 μL的活精子滴，隨后進(jìn)行精液品質(zhì)相關(guān)參數(shù)的評定，篩選最適MLT濃度。

1.3.1.1 活力評定 采用目測法評估精子活力，精子活力是指精液中呈直線前進(jìn)運(yùn)動精子占總精子的百分率。

1.3.1.2 質(zhì)膜完整性檢測 低滲腫脹法檢測精子質(zhì)膜的完整性，參照李曉霞［5］的方法操作。最后，滴片后在200×相差顯微鏡下觀察精子尾部形態(tài)，精子尾部形成一個圓環(huán)的為精子質(zhì)膜完整的精子，沒有形成圓環(huán)的則為質(zhì)膜損傷的精子，每次計數(shù)至少200條精子。

1.3.1.3 頂體完整性檢測 采用考馬斯亮藍(lán)G－250染色法檢測精子頂體完整性，方法參照李曉霞［5］。染色完畢后用自來水沖洗，自然干燥后，在1000×油鏡下統(tǒng)計頂體膜完整率及破損率。頂體區(qū)為藍(lán)色且頂體邊緣光滑的精子為具有完整頂體的精子，頂體區(qū)不著色或著色較淡的精子為頂體破損的精子，至少觀察200條精子。

1.3.1.4 線粒體活性檢測 用線粒體膜電位檢測試劑盒（JC－1）（Beyotime）檢測精子的線粒體膜電位，精子的染色程序按照試劑盒說明進(jìn)行。（1）按照每50μL JC－1（200×）加入8mL超純水混勻后，再加入2mL JC－1染色緩沖液（5×）混勻即為JC－1染色工作液。每1mL JC－1染色緩沖液（5×）加入4 mL蒸餾水的比例，配制適量的JC－1染色緩沖液（1 ×）。取100μL精子密度大約為107個／mL精液，加入100μL JC－1染色工作液，37℃下孵育30 min。然后用JC－1染色緩沖液（1×）離心洗滌，再重懸于JC－1染色緩沖液（1×），使精子密度達(dá)到107個／mL。（2）取5μL染色后的精子懸液滴在載玻片上，然后蓋上蓋玻片，于熒光顯微鏡的藍(lán)光下觀察且記錄有線粒體活性（高膜電位）的精子數(shù)（在精子尾部中段有微黃或桔紅色熒光）和無線粒體活性（低膜電位）的精子數(shù)（精子尾部中段產(chǎn)生綠色熒光）（圖2），至少觀察200個精子。

圖1 排出PB1的牛卵母細(xì)胞Fig.1 Bovine oocyte educing PB1

圖2 牛精子JC－1染色Fig.2 Bovine spermatozoa stained by JC－1

1.3.2 受 精 將成熟培養(yǎng)后的牛卵母細(xì)胞用受精液清洗3遍后，將卵母細(xì)胞移入已平衡好的受精滴（50μL／滴）中，每滴一般放入15～20個卵母細(xì)胞。隨后將處理后的精子分別加入到各受精滴中，使其終濃度達(dá)到1～2×106個／mL，最后放置于39℃、5%CO2且最大飽和濕度條件下進(jìn)行孵育。

1.4 體外培養(yǎng)

圖3 胚胎發(fā)育A.卵裂時期；B.囊胚時期（黑色箭頭所指為囊胚）Fig.3 Embryo developmentA.Cleavage stage；B.Blastocyst stage（black arrow pointing at the blastocyst）

受精8h后，將假定受精卵用含培養(yǎng)液（C液）清洗3遍后移入預(yù)先用10－9M MLT［19］培養(yǎng)液制備好的細(xì)胞單層（20μL／個）中或直接移入未含有10－9M MLT（對照組）單層中培養(yǎng)，每個細(xì)胞單層通常放入15～25枚受精卵，置于39℃、5%CO2及最大飽和濕度條件下繼續(xù)培養(yǎng)，每隔48h進(jìn)行半量換液。且在受精后48h統(tǒng)計其分裂率，在受精后第6～9d統(tǒng)計其囊胚率（圖3）。

1.5 統(tǒng)計分析

所有試驗(yàn)重復(fù)6次，每個試驗(yàn)組至少計數(shù)200條精子或20枚卵母細(xì)胞。用SPSS11.5統(tǒng)計軟件，對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。顯著水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加褪黑素對牛卵母細(xì)胞體外成熟的影響

牛卵母細(xì)胞在添加0M（對照組）或10－9M MLT的成熟培養(yǎng)液中體外成熟培養(yǎng)24h后，其成熟率見表1。結(jié)果表明，成熟液中添加10－9M MLT牛卵母細(xì)胞的成熟率顯著高于對照組（77.8%vs 62.5%，P＜0.05）。因此，在牛卵母細(xì)胞體外成熟液中添加MLT可提高牛卵母細(xì)胞體外成熟率。

2.2 添加褪黑素對牛精子獲能效果的影響

牛凍精分別在添加0M（對照組）、10－3M、10－4M、10－5M MLT的獲能液中經(jīng)上游法處理45min后，檢測各個處理組精子的活力、質(zhì)膜完整率、頂體完整率和線粒體高膜電位百分率（如圖4）。結(jié)果表明，獲能液中添加10－4M MLT牛精子處理后的活力（84.6%vs 71.6%）、質(zhì)膜完整率（88.8%vs 75.2%）、頂體完整率（87.0%vs 74.4%）和線粒體高膜電位百分率（83.0%vs 70.2%）均顯著高于對照組（P＜0.05）；且獲能液中添加10－3M與10－4M MLT牛精子處理后的各個參數(shù)間均差異不顯著（P＞0.05），但添加10－3M MLT牛精子處理后的各個參數(shù)與對照組均差異顯著（P＜0.05）。由此說明，在獲能液中添加MLT可提高處理后精子的活力、質(zhì)膜完整性、頂體完整性和線粒體活性；添加MLT的最適濃度為10－4M。

2.3 添加褪黑素對牛早期胚胎發(fā)育的影響

牛卵母細(xì)胞受精后在添加0M（對照組）或10－9M MLT的體外培養(yǎng)液中培養(yǎng)48h后，統(tǒng)計其卵裂率，培養(yǎng)6～9d統(tǒng)計其囊胚率（見表2）。結(jié)果表明，體外培養(yǎng)液中添加10－9M MLT牛卵母細(xì)胞體外受精后的卵裂率（67.6%vs 53.2%，P＜0.05）和囊胚率（35.4%vs 20.3%，P＜0.05）均顯著高于對照組。由此可見，在體外培養(yǎng)液中添加MLT可顯著提高體外受精后的卵裂率和早期胚胎發(fā)育的囊胚率。

表1 添加10－9 M褪黑素對牛卵母細(xì)胞體外成熟的影響Table 1 Effect of 10－9 M MLT on bovine oocyte maturation in vitro

表2 添加10－9 M MLT對牛早期胚胎發(fā)育的影響Table 2 Effect of 10－9 M MLT on early embryos development of bovine

圖4 添加不同濃度褪黑素在牛精子獲能液中對精液品質(zhì)的影響Fig.4 Effect of different concentrations of MLT on bovine semen quality in vitro capacitation

3 討 論

體外受精及體外培養(yǎng)過程中，氧化應(yīng)激會直接影響卵母細(xì)胞成熟、精子獲能和早期胚胎發(fā)育［20］的效果。配子、胚胎易受到ROS攻擊，源于其在體外操作中常處于超生理水平的ROS環(huán)境［21］。而過多的ROS會導(dǎo)致線粒體功能紊亂、ATP消耗、細(xì)胞凋亡發(fā)生和胚胎發(fā)育阻滯［20］。因此，添加抗氧化劑于體外培養(yǎng)液可提高卵母細(xì)胞成熟［22］、精子質(zhì)量［14］和胚胎體外發(fā)育［19］的效率，代表性地有Vc［23］、白藜蘆醇［24］、褪黑素［22－25］等。關(guān)于褪黑素在繁殖系統(tǒng)方面的作用，尤其在提高卵母細(xì)胞成熟和早期胚胎發(fā)育方面，已成為快速發(fā)展的研究領(lǐng)域之一。

褪黑素被發(fā)現(xiàn)存在于牛卵泡液中，卵泡液中的褪黑素可能是由卵母細(xì)胞合成的［26］，它可以保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激，減少由環(huán)境因素?fù)p傷造成大分子物質(zhì)遭受氧化作用［16］，從而提高卵母細(xì)胞質(zhì)量。在臨床治療中，褪黑素可以改善人卵母細(xì)胞質(zhì)量［27］。除此之外，褪黑素也提高了豬、牛、小鼠卵母細(xì)胞體外成熟效率［22］，本研究也得到相似結(jié)果。另外，褪黑素可通過減少ROS的濃度，顯著提高卵母細(xì)胞成熟、孤雌激活囊胚及正常囊胚的細(xì)胞數(shù)目［28］。牛胚胎體外培養(yǎng)過程中，添加褪黑素可抑制自由基形成，且能促進(jìn)牛胚胎發(fā)育［17］。Dehghani－Mohammadabadi等［29］也發(fā)現(xiàn)了同樣的結(jié)果，添加10－12M褪黑素可明顯提高鼠卵母細(xì)胞體外發(fā)育的卵裂率和囊胚形成率，而添加10－9M褪黑素則可明顯增加滋養(yǎng)層和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)數(shù)目，兩種處理濃度均可顯著減少凋亡指數(shù)。Manjunatha等［9］分別在水牛卵母細(xì)胞成熟液和胚胎培養(yǎng)液中添加10、50μM褪黑素可明顯提高卵母細(xì)胞成熟率和可移植胚胎率。為檢測褪黑素在牛胚胎發(fā)育中的保護(hù)作用，Wang等［19］在體外培養(yǎng)液中分別添加10－11、10－9、10－7、10－5、10－3M褪黑素，發(fā)現(xiàn)添加10－11～10－5M在前2d和3～8d的不同培養(yǎng)液中，均可明顯促進(jìn)胚胎發(fā)育；尤其是10－9、10－7M的褪黑素效果最佳，此結(jié)果與本研究結(jié)果基本一致。本研究嘗試添加10－9M的褪黑素于胚胎培養(yǎng)液中，相比對照組來說，MLT組可明顯提高早期胚胎發(fā)育的卵裂率和囊胚率。說明添加適宜濃度的MLT在IVF培養(yǎng)液，可減少ROS的產(chǎn)生，抑制氧自由基的損傷，從而保護(hù)牛卵母細(xì)胞免受氧化應(yīng)激，提高牛卵母細(xì)胞體外發(fā)育效率。

ROS超生理水平的產(chǎn)生會對精子質(zhì)量和體外保存的精子功能產(chǎn)生毒副作用［30］，還能誘使凋亡細(xì)胞死亡［31］。褪黑素作為一種非酶類的強(qiáng)抗氧化劑，它在保護(hù)精子功能和清除NO、ROS的作用已有相關(guān)研究報道［32］。然而，在牛精子獲能處理液中添加褪黑素對牛精子質(zhì)量功能作用的研究還不充分。因此，本研究嘗試在含肝素、咖啡因的獲能液中分別添加0M（對照組）、10－3M、10－4M、10－5M MLT，經(jīng)上游法處理后評估精液品質(zhì)各參數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加10－4M MLT處理后的牛精子活力、質(zhì)膜完整率、頂體完整率和線粒體高膜電位百分率均顯著高于對照組。du Plessis等［33］添加2mM MLT與處理后人精液在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中共孵育2h后，MLT組可明顯提高精子活力、減少不能存活精子數(shù)目和內(nèi)源NO含量。Kaya等［15］研究發(fā)現(xiàn)，植入MLT的公羊在繁殖或非繁殖季節(jié)均可顯著提高精子冷凍－解凍后的頂體完整率，在繁殖季節(jié)植入MLT還可以減少磷酸酶釋放，從而減少超低溫冷凍過程中酶的泄露，以利于提高羊精液冷凍效率。同樣地，Li等［14］研究也發(fā)現(xiàn)，相較其它處理組（0 M、10－5M和10－6M），在水牛精液稀釋液中添加10－4M MLT可顯著提高精子線粒體活性。本試驗(yàn)結(jié)果與這些結(jié)果基本一致，說明褪黑素在提高獲能后精子質(zhì)量方面也可以作為一種有效工具，利用其抗氧化性以延長精子壽命、減少精子過早老化，從而改善精子品質(zhì)。

4 結(jié) 論

體外受精液中添加10－9M MLT可顯著提高牛卵母細(xì)胞體外成熟率和隨后胚胎發(fā)育效率，獲能液中添加10－4M MLT可明顯改善精子質(zhì)量，說明褪黑素作為一種強(qiáng)抗氧化劑可保護(hù)兩性配子和胚胎發(fā)育免受損傷。

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