福爾馬林固定石蠟包埋樣本提取的RNA質(zhì)量分析及其臨床應(yīng)用

薛洋，曾富春，舒駿，叢偉

(四川省人民醫(yī)院胸外科，四川 成都610072)

福爾馬林固定石蠟包埋(formalin-fixed paraffin-embedded，F(xiàn)FPE)組織是目前國(guó)內(nèi)外運(yùn)用最為廣泛的組織保存形式。因?yàn)槠淠軌虮３纸M織的特殊形態(tài)，而且保存時(shí)間較長(zhǎng)，能夠適合后期的免疫組化和組織學(xué)分析，為臨床治療的選擇提供可靠的保障。

目前，分子靶向治療逐步成為腫瘤治療的主流，在臨床用藥前對(duì)患者基因突變狀態(tài)進(jìn)行檢測(cè)，可正確指導(dǎo)臨床個(gè)體化用藥，減輕患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，提高分子靶向藥物治療效果。因此，從FFPE樣本中提取高質(zhì)量的DNA/RNA進(jìn)行分子靶標(biāo)檢測(cè)也逐漸受到關(guān)注。從FFPE中提取到能夠有效擴(kuò)增的DNA/RNA不僅適用于回顧性研究，也對(duì)疾病的診斷與鑒別、評(píng)估疾病預(yù)后和探索疾病分子機(jī)制具有重要意義[1]。

但是DNA/RNA在福爾馬林固定和石蠟包埋的過(guò)程中，都有不同程度的片段化，而且樣本大小、固定時(shí)間、固定溫度和包埋條件等等都對(duì)DNA/RNA的質(zhì)量產(chǎn)生極大的影響。近年來(lái)，研究人員試圖了解在FFPE樣本制備過(guò)程中存在著的各種對(duì)DNA/RNA的不利因素，找出解決方案，力求提取出高質(zhì)量的DNA/RNA，用于后續(xù)的基因突變分析，還原樣本真實(shí)的基因信息，以提高FFPE樣本在疾病的診斷和預(yù)后中的應(yīng)用價(jià)值。

在2011年發(fā)表的《中國(guó)非小細(xì)胞肺癌患者表皮生長(zhǎng)因子受體基因突變檢測(cè)專家共識(shí)》中，對(duì)FFPE樣本的處理提出了規(guī)范化操作流程，使得各大醫(yī)院能輕松地完成從FFPE樣本中提取到高質(zhì)量的DNA，用于表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(EGFR)的基因突變檢測(cè)，為非小細(xì)胞肺癌的靶向治療提供了重要的臨床依據(jù)。但是由于環(huán)境中存在較多且穩(wěn)定的RNA酶，導(dǎo)致從FFPE樣本中提取完整的RNA較為困難。隨著技術(shù)的不斷完善，國(guó)內(nèi)外出現(xiàn)了許多不同的提取方法，所得RNA的產(chǎn)量及擴(kuò)增效率也存在著很大差異[2-4]。因此，目前存在著很多質(zhì)疑：能否從FFPE樣本中提取到高質(zhì)量并且足夠多的RNA用于后續(xù)的基因突變檢測(cè)？

目前尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)國(guó)內(nèi)大隊(duì)列的FFPE樣本提取的RNA質(zhì)量進(jìn)行分析。因此，本研究從國(guó)內(nèi)不同地區(qū)收集了994例FFPE樣本，采用廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司生產(chǎn)的FFPE樣品RNA分離試劑盒(2013年獲CFDA批準(zhǔn)上市)進(jìn)行RNA分離，對(duì)RNA質(zhì)量進(jìn)行分析，并將提取的RNA用于EML4-ALK基因融合和ROS1基因融合檢測(cè)，通過(guò)對(duì)比測(cè)序結(jié)果，以此判斷采用FFPE樣本RNA進(jìn)行基因突變檢測(cè)的可靠性。

1 材料與方法

1.1 樣本來(lái)源 收集2010年1月至2013年12月共994例FFPE樣本，其中四川省人民醫(yī)院303例、上海市某醫(yī)院389例、福建省某醫(yī)院302例，所有樣本均有明確的病理診斷結(jié)果，并根據(jù)地區(qū)來(lái)源和不同年限進(jìn)行分類，每例患者的組織蠟塊連續(xù)切2張5μm厚的切片。

1.2 試劑 FFPE樣品RNA分離試劑盒 (廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司，貨號(hào)：ADx-FF04，簡(jiǎn)稱AmoyDx RNA試劑盒)；人類EML4-ALK基因融合檢測(cè)試劑盒(廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司)；人類ROS1基因融合檢測(cè)試劑盒(廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司)。

1.2 方法

1.2 .1 FFPE樣本的RNA分離 采用AmoyDx RNA試劑盒進(jìn)行RNA抽提。(1)切片：一次性切片刀，連續(xù)5μm厚切片，每個(gè)蠟塊取2個(gè)切片，置入1個(gè)1.5ml EP管內(nèi)，4℃冰箱保存；(2)脫蠟：分析純二甲苯浸沒(méi)組織切片，渦旋混勻促使組織溶解，離心棄上清；(3)脫二甲苯：加入無(wú)水乙醇以去除二甲苯，離心棄上清；(4)干燥；組織沉淀物經(jīng)干燥蒸發(fā)殘留的乙醇；(5)蛋白消化：蛋白酶K及其緩沖液浸沒(méi)組織 ，56℃消 化 15min，80℃ 孵 育 15min；(6)DNA 降解：加入DNaseⅠ及其緩沖液，吹打混勻后靜置15min；(7)RNA吸附：加入結(jié)合緩沖液，用吸附柱吸附RNA；(8)RNA收集：洗滌兩次吸附柱，空管離心14000r/min 5min； 加入 80μl RNase-freeWater，靜置3min；14000r/min離心1min。RNA樣本立即保存于-80℃冰箱中。

1.2 .2 RNA的質(zhì)量檢測(cè) 使用Thermo Scientific公司的NanoDrop 1000超微量分光光度計(jì)檢測(cè)核酸的純度和濃度。A260的數(shù)值即OD值作為核酸濃度的指標(biāo)，濃度以ng/μl為單位。A260/A280和A260/A230的比值作為核酸純度的指標(biāo)。

取5μlAmoyDx RNA試劑盒提取的RNA進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，以鑒定RNA的完整性。取6μl RNA用于HPRT1基因檢測(cè)，用于評(píng)估RNA樣本中能進(jìn)行有效擴(kuò)增的片段含量。

1.2 .3 qRT-PCR 將所提取的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。采用Takara公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA合成。25μl逆轉(zhuǎn)錄體系包含：6μl RNA，5.0μl 5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，1μl M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶(200U/μl)，3.5 pmol/l特異性逆轉(zhuǎn)錄引物。反應(yīng)程序?yàn)椋?2℃60min；95℃5min。分別取5μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行HPRT1基因、EML4-ALK基因融合和ROS1基因融合檢測(cè)。40μl反應(yīng)體系含有5μl cDNA，0.2mmol/L dNTPs，引物濃度為 0.4μmol/L，1 U ExTaq DNA聚合酶(Takara公司)，4.0μl10×PCR 緩沖液。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性 5min，15個(gè)循環(huán)的 95℃變性 25s，64℃退火 20s，72℃延伸20s，接著31個(gè)循環(huán)的 93℃變性 25s，60℃退火 35s(收集 FAM 和 HEX信號(hào))，72℃延伸20s。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀機(jī)型為Stratagene Mx3000PTM。

1.2 .4 Sanger測(cè)序 所提取的RNA樣本先進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及RT-PCR，然后將得到的PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

對(duì)于EML4-ALK基因融合陽(yáng)性和ROS1基因融合陽(yáng)性的RNA樣本，根據(jù)已有報(bào)道的基因融合序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增；對(duì)于EML4-ALK基因融合陰性和ROS1基因融合陰性的RNA樣本，則根據(jù)EML4-ALK基因和ROS1基因斷裂點(diǎn)處的序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 將所提RNA進(jìn)行EML4-ALK和ROS1基因融合檢測(cè)，同時(shí)使用Sanger測(cè)序法進(jìn)行驗(yàn)證，采用χ2檢驗(yàn)分析其一致性。采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RNA純度 對(duì)本實(shí)驗(yàn)所得的RNA純度進(jìn)行檢測(cè)：A260/A280(圖 1)和 A260/A230(圖 2)，RNA 的A260/A280和A260/A230均值分別為1.97和1.92。

圖1 RNA A260/A280

圖2 RNA A260/A230

2.2 RNA濃度 對(duì)本實(shí)驗(yàn)所得的RNA濃度進(jìn)行檢測(cè)。RNA的濃度和HPRT1的qRT-PCR檢測(cè)的Ct均值分別為 204.23ng/μl(圖 3)和 14.09(圖 4)。

圖3 RNA濃度

圖4 RNA HPRT1 Ct值

2.3 RNA完整性 對(duì)本實(shí)驗(yàn)所得的RNA的完整性進(jìn)行檢測(cè)。FFPE樣本的RNA電泳多數(shù)呈寬帶狀、彌散分布的smear帶，提示降解明顯，平均長(zhǎng)度集中在200bp左右。

2.3 .1 比較不同地區(qū)來(lái)源的FFPE樣本提取的RNA質(zhì)量 分別對(duì)各家醫(yī)院的樣本RNA質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估(圖5)。結(jié)果顯示：四川省人民醫(yī)院樣本RNA的 A260/A280、A260/A230、濃度和 HPRT1 的 Ct均值分別為 2.02、1.98、196ng/μl和 12.0。 上海市某醫(yī)院的FFPE樣本RNA的A260/A280和A260/A230均值分別為1.94和1.84， 平均濃度為248ng/μl， 經(jīng)qRT-PCR檢測(cè)的HPRT1的Ct值為14.8，其中有兩例標(biāo)本沒(méi)有檢測(cè)到HPRT1的Ct值，標(biāo)本檢測(cè)失敗。福建省某 醫(yī) 院 樣 本 RNA的 A260/A280、A260/A230、 濃 度 和HPRT1 的 Ct 均 值 分 別 為 1.96、1.98、156ng/μl、15.3。

圖5 不同地區(qū)來(lái)源的FFPE樣本的RNA質(zhì)量比較

2.3 .2比較不同保存年限的FFPE樣本的RNA質(zhì)量 收集2010~2013年四川省人民醫(yī)院的FFPE樣本，其中2010年23例，2011年75例，2012年110例，2013年95例。對(duì)上述FFPE樣本進(jìn)行RNA抽提，并對(duì)所獲得RNA的質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)(圖6)。

2010 年的FFPE樣本提取的RNA的A260/A280、A260/A230、濃度和 HPRT1的 Ct均值分別為1.97、2.03、146 ng/μl、12.8；2011 年的 FFPE 樣本提取的RNA 的 A260/A280、A260/A230、 濃度和 HPRT1的 Ct值分別為 2.02、2.01、169ng/μl、12.6；2012 年的 FFPE樣 本 提 取 的 RNA的 A260/A280、A260/A230、 濃 度 和HPRT1 的 Ct 均 值 分 別 為 2.03、1.98、226ng/μl、12.4；2013年的 FFPE樣本提取的 RNA的 A260/A280、A260/A230、 濃度和 HPRT1的 Ct均值分別為2.04、1.94、195ng/μl、10.9。

圖6 不同保存年限的FFPE樣本的RNA質(zhì)量比較

2.4 EML4-ALK和ROS1基因融合檢測(cè)與Sanger測(cè)序結(jié)果的對(duì)比 人類EML4-ALK基因融合和ROS1基因融合檢測(cè)試劑盒與Sanger測(cè)序法均得到檢測(cè)結(jié)果的FFPE樣本為992例，檢測(cè)成功率為99.80%(992/994)。兩種方法檢測(cè)結(jié)果均為EML4-ALK基因融合和ROS1基因融合陽(yáng)性的樣本數(shù)為117例，總檢出率為11.79%(117/992)。兩種方法檢測(cè)結(jié)果均為EML4-ALK基因融合和ROS1基因融合陰性的樣本數(shù)為875例(表1)。

表1 試劑盒法和Sanger測(cè)序法對(duì)臨床樣本的檢測(cè)結(jié)果對(duì)比情況

根據(jù)表1所列檢測(cè)數(shù)據(jù)，兩種方法對(duì)992例臨床FFPE樣本的檢測(cè)結(jié)果的符合率為：

①兩種方法檢測(cè)的基因融合陽(yáng)性符合率為a/(a＋c)=100%。

②兩種方法檢測(cè)的基因融合陰性符合率為d/(b＋d)=100%。

③兩種檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果的總符合率為 (a＋d)/(a＋b＋c＋d)=100%。

即使用人類EML4-ALK基因融合和ROS1基因融合檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)結(jié)果與Sanger測(cè)序法完全一致。

3 討論

FFPE樣本具有來(lái)源充足、疾病種類廣闊、疾病信息豐富和監(jiān)控腫瘤性疾病的長(zhǎng)期臨床處理過(guò)程以及可長(zhǎng)期保存、原位診斷和隨時(shí)獲取等[5]諸多優(yōu)點(diǎn)，顯示了其在疾病研究中的巨大潛力。因此，從FFPE中獲取高質(zhì)量的RNA，對(duì)疾病尤其是腫瘤的研究和臨床用藥治療[6-8]具有重要的意義。

RNA樣本的質(zhì)量檢測(cè)一般分為總量、純度與完整性三大項(xiàng)。其中總量可以通過(guò)微量分光光度計(jì)測(cè)定260nm吸收值進(jìn)行計(jì)算。純度可以通過(guò)微量分光光度計(jì)測(cè)定A260/A230的比值，用于評(píng)估有機(jī)溶劑殘留，理想值應(yīng)當(dāng)≥1.8，如果比值低于1.8，則表明存在有機(jī)物/鹽離子等污染；測(cè)定A260/A280吸收值的比值可用于評(píng)估蛋白質(zhì)污染比例，理想值應(yīng)為1.9-2.1，如果比值低于1.8，則表明存在蛋白污染。完整性可以通過(guò)電泳，目測(cè)有無(wú)基因組DNA污染，有無(wú)RNA降解(28S，18S條帶)[9]。研究表明，每個(gè)樣本的Ct值與該樣本的特定基因的起始拷貝數(shù)存在一定關(guān)系[10]，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。因此，只要比較不同樣本的Ct值，即可推斷出樣本中含有特定基因的起始拷貝數(shù)的多寡。由于HPRT1是一種管家基因，在不同來(lái)源的細(xì)胞中的表達(dá)比較穩(wěn)定，因此可以通過(guò)比較RNA樣本中HPRT1的qRT-PCR的Ct值，來(lái)判斷樣本中的可擴(kuò)增片段的濃度?；谏鲜鲋笜?biāo)，本文總共對(duì)994例FFPE樣本采用AmoyDx RNA試劑盒進(jìn)行RNA抽提 ，RNA 的 質(zhì) 量 通 過(guò) A260/A280、A260/A230、 濃 度 和HPRT1的qRT-PCR的Ct值來(lái)檢測(cè)。

各家醫(yī)院對(duì)于樣本的處理有所不同，包括樣本離體時(shí)間、固定時(shí)間和溫度、包埋時(shí)間和溫度、FFPE組織保存時(shí)間和溫度等。而上述條件均會(huì)導(dǎo)致FFPE樣本中RNA的片段化程度不同。本文從三個(gè)不同地區(qū)的三家醫(yī)院收集FFPE樣本，均采用AmoyDx RNA試劑盒提取RNA，并對(duì)RNA的質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)分析。從上述結(jié)果可以看出：所提取的RNA的A260/A280和A260/A230數(shù)值均大于1.8，說(shuō)明該RNA試劑盒能去除多余的蛋白質(zhì)和鹽離子，獲得的RNA純度較好。在后續(xù)的qRT-PCR反應(yīng)中，三家醫(yī)院的RNA樣本都能進(jìn)行有效擴(kuò)增，尤其是四川省人民醫(yī)院的RNA樣本的有效擴(kuò)增片段顯著多于其它兩家醫(yī)院，說(shuō)明采用RNA試劑盒法從這三家醫(yī)院的FFPE樣本提取的RNA，在純度和總得率上均能適用于qRT-PCR的基因突變檢測(cè)。

Nam等人[11]評(píng)估了樣本的儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)RNA抽提質(zhì)量的影響。將FFPE樣本儲(chǔ)存在室溫1個(gè)月至10年。結(jié)果顯示儲(chǔ)存時(shí)間越長(zhǎng)，RNA得率越低，純度也顯著降低。儲(chǔ)存3~8年的樣本中有58.3%能檢測(cè)出β-actin的表達(dá)，儲(chǔ)存1個(gè)月至1年的樣本有62.5%能檢測(cè)出β-actin的表達(dá)，儲(chǔ)存時(shí)間少于1個(gè)月的樣本全部能檢測(cè)出β-actin的表達(dá)。本研究對(duì)樣本的保存年限進(jìn)行分組，考察RNA試劑盒提取的RNA的質(zhì)量。結(jié)果顯示，不同保存年限的FFPE樣本，所提取的RNA的純度均能符合要求，即A260/A280和A260/A230大于1.8，而在RNA得率方面，2012和2013年的FFPE樣本的RNA濃度高于2010和2011年，而且有效片段濃度也高于后者，說(shuō)明FFPE樣本保存年限越長(zhǎng)，RNA降解程度越大。

EML4-ALK基因融合和ROS1基因融合各自分別代表了一類具有特定臨床與病理特征的NSCLC分子亞群。文獻(xiàn)報(bào)道約3%~7%的NSCLC存在EML4-ALK基因融合[12-15]，另有約1%-3%的NSCLC存在ROS1基因融合[16,17]，從而為肺癌的治療提供了新的分子靶點(diǎn)?，F(xiàn)有臨床研究表明，以EML4-ALK基因融合、ROS1基因融合為靶點(diǎn)的新型EML4-ALK/ROS1酪氨酸激酶抑制劑克唑替尼對(duì)攜帶EML4-ALK基因融合或ROS1基因融合的NSCLC患者療效顯著，其客觀緩解率(ORR)分別為57%和54%，疾病控制率(DCR)則分別達(dá)到了87%和85%[18,19]。因此，準(zhǔn)確檢測(cè)EML4-ALK基因融合和ROS1基因融合存在狀態(tài)，可為腫瘤患者的靶向用藥治療提供必要依據(jù)。本研究檢測(cè)的EML4-ALK和ROS1融合基因陽(yáng)性率為11.77%，與上述報(bào)道數(shù)據(jù)一致，而且檢測(cè)結(jié)果與Sanger測(cè)序法的陽(yáng)性檢出率、陰性檢出率均為100%，說(shuō)明從FFPE樣本中提取的RNA，可以用于基因突變檢測(cè)，而且檢測(cè)結(jié)果真實(shí)可靠，可為靶向治療方案的選擇提供重要的證據(jù)。

994 例FFPE樣本RNA中有992例可用于qRT-PCR的檢測(cè)，檢測(cè)成功率為99.80%。由于目前各大醫(yī)院對(duì)樣本的處理進(jìn)行了規(guī)范化操作：控制離體時(shí)間，用中性的10%福爾馬林浸泡，根據(jù)樣本大小不同來(lái)調(diào)節(jié)固定時(shí)間，使得從FFPE樣本中提取出來(lái)的RNA質(zhì)量較好，而且qRT-PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度較短，低于130bp，這些改善措施大大提高了從FFPE樣本中提取的RNA質(zhì)量，適合后續(xù)的基因突變檢測(cè)，使得FFPE樣本的臨床利用率大為提高，能提供真實(shí)可靠的基因突變圖譜，可為靶向治療提供可靠的保障。

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