FLAER檢測及其在陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥診斷中的意義

劉淑媛，萬臘根，聞芳，李欣，張長林

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 南昌330006)

陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥 (paroxysmal nocturnal hemoglobinuria,PNH)是一種或幾種造血干細(xì)胞發(fā)生PIG-A基因突變，導(dǎo)致糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidy inositol,GPI)錨蛋白合成障礙，引發(fā)細(xì)胞膜錨連蛋白缺失，補(bǔ)體活化異常所致的溶血性疾病[1]。目前通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞膜表面CD55、CD59的缺失已成為診斷PNH的首選實(shí)驗(yàn)方法；但CD55、CD59等補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)還會(huì)受到其它因素的影響，如骨髓增生異常綜合征(MDS)、細(xì)胞發(fā)育不全等均有可能導(dǎo)致膜蛋白的缺失[2]，因此仍有一定的局限性。隨后，Brodsky等[3]發(fā)現(xiàn)PNH細(xì)胞對氣單胞菌溶素抵抗，利用這一特性可區(qū)分GPI+和GPI-細(xì)胞。經(jīng)過改進(jìn)，目前已經(jīng)可以用熒光標(biāo)記嗜水氣單胞菌溶素前體的變異體(fluorescent aerolysin,FLAER)，使之成為診斷PNH更特異的方法。我們利用流式細(xì)胞儀對臨床患者的血標(biāo)本進(jìn)行FLAER及CD55、CD59檢測，對其結(jié)果進(jìn)行比較，以探討FLAER檢測在PNH診斷中的意義。

1 材料與方法

1.1 研究對象 所有患者均為南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院2013年至2014年的門診或住院患者。其中PNH患者10例，經(jīng)補(bǔ)體相關(guān)溶血試驗(yàn)及流式細(xì)胞術(shù)檢測確診；非PNH貧血患者37例，均為缺鐵性貧血、巨幼細(xì)胞性貧血等營養(yǎng)不良性貧血患者。

1.2 儀器與試劑 美國Beckman-Coulter公司FC500 型流式細(xì)胞儀 (FCM)，CD14-ECD、CD24-PC5、CD55-PE和CD59-FITC熒光標(biāo)記單克隆抗體、FLAER試劑及紅細(xì)胞裂解液均購自美國Beckman公司。

1.3 方法

1.3 .1 外周血紅細(xì)胞CD55、CD59檢測 EDTA抗凝外周血標(biāo)本以生理鹽水稀釋，調(diào)整紅細(xì)胞數(shù)為109/L；取30μl紅細(xì)胞懸液于流式專用試管中，分別加入3μlFITC標(biāo)記的鼠抗人CD59和3μlPE標(biāo)記的鼠抗人CD55抗體，混勻后室溫避光標(biāo)記15min；生理鹽水洗去游離抗體，加入600μl生理鹽水懸浮細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞表面抗體標(biāo)記率。

1.3 .2外周血粒細(xì)胞、單核細(xì)胞FLAER檢測 取30μl全血分別加入 2μlFLAER 試劑、3μlECD 標(biāo)記的鼠抗人CD14和3μlPC5標(biāo)記的鼠抗人CD24抗體，混勻后室溫避光標(biāo)記15min；加入200μl紅細(xì)胞裂解液，室溫孵育10min，生理鹽水洗滌2次，加入600μl生理鹽水懸浮細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞表面抗體標(biāo)記率。

1.3 .3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PNH患者外周血紅細(xì)胞CD55、CD59抗原缺失表達(dá) 經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，非PNH貧血患者的外周血紅細(xì)胞表面抗原CD55、CD59均未見明顯表達(dá)缺陷，結(jié)果顯示CD55、CD59僅存在單一表達(dá)峰 (見圖 1A、1B)；CD55－占 (3.31±4.26)%，CD59－占(0.78±1.39)%。 PNH 組中 2 例 CD55－、CD59－＜5%，8例患者外周血中同時(shí)存在正常及CD55、CD59缺陷的2群紅細(xì)胞，部分患者在弱陽性區(qū)可見一群細(xì)胞，為CD55/CD59部分缺陷的紅細(xì)胞(見圖1E)；紅細(xì)胞膜CD55、CD59抗原表達(dá)缺失率分別為(35.54±21.91)%和(32.32±22.04)%，與非 PNH 貧血組比較明顯升高(P＜0.05)，見表 1。

圖1 PNH患者和非PNH貧血患者外周血紅細(xì)胞CD55、CD59檢測

表1 PNH組和非PNH貧血組外周血細(xì)胞抗原缺失率(x±s，%)

2.2 PNH患者外周血FLAER檢測分析 通過多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)檢測，分別采用CD14、CD24對外周血單核細(xì)胞、粒細(xì)胞進(jìn)行靶向標(biāo)記，結(jié)果顯示，PNH患者外周血粒細(xì)胞FLAER陰性率達(dá) (82.52±25.24)%，單核細(xì)胞FLAER陰性率達(dá) (79.84±19.86)%；與CD55、CD59的陰性率相比，有顯著升高 (P＜0.05)。其中6例PNH患者同時(shí)伴有CD24、CD14抗原的缺失(見圖2A、2B)。對于PNH患者，F(xiàn)LAER分析檢出率達(dá)100%；而CD55、CD59抗原缺失檢測存在2例陰性結(jié)果(如圖3所示)。非PNH貧血患者外周血粒細(xì)胞和單核細(xì)胞均為FLAER陽性(見圖2C、2D)。由此可見，外周血FLAER檢測的敏感性和特異性均比CD55、CD59檢測更好。同時(shí)，與傳統(tǒng)的CD55、CD59相比，F(xiàn)LAER分析法區(qū)分的GPI+和GPI－2群細(xì)胞也更直觀，易于分辨(圖2 所示)。

3 討論

陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥(PNH)是一種獲得性紅細(xì)胞膜缺陷性疾病，臨床表現(xiàn)主要為清晨醬油色尿，慢性血管內(nèi)溶血，可伴有全血細(xì)胞減少和反復(fù)血栓形成[4]。傳統(tǒng)診斷PNH常用的方法有Ham試驗(yàn)、蔗糖溶血試驗(yàn)、尿Rous試驗(yàn)等；但這些方法敏感性、特異性差，容易受到其它因素的影響，如PNH發(fā)作時(shí)呈典型的血管內(nèi)溶血，Ham試驗(yàn)陽性具有診斷價(jià)值[5]，而對于緩解期臨床癥狀好轉(zhuǎn)的病人，Ham試驗(yàn)等溶血性貧血相關(guān)試驗(yàn)常呈陰性，易造成漏診。

圖2 PNH患者和非PNH貧血患者外周血粒細(xì)胞、單核細(xì)胞的FLAER分析

圖3 對1例PNH患者外周血細(xì)胞FLAER與CD55、CD59檢測比較

20世紀(jì)80年代以來，對PNH的研究逐步深入，該病的發(fā)生機(jī)制被證實(shí)是由于造血干細(xì)胞發(fā)生PIG-A基因突變，導(dǎo)致糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨蛋白合成障礙，造成血細(xì)胞表面錨連蛋白的缺失，紅細(xì)胞因表面缺乏補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白如CD55、CD59而對補(bǔ)體敏感[1]。而PNH患者的多數(shù)臨床表現(xiàn)均可歸因?yàn)槭芾奂?xì)胞表面此類蛋白的缺乏。因此通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白CD55、CD59逐漸成為診斷PNH的金標(biāo)準(zhǔn)，并可以對PNH血細(xì)胞進(jìn)行定量分析[6]。隨著研究的不斷深入，學(xué)者發(fā)現(xiàn)很多干細(xì)胞疾病(如再生障礙性貧血、骨髓增生異常綜合征等)和免疫性疾病(如系統(tǒng)性紅斑狼瘡等)患者中均可檢出 CD55－/CD59－細(xì)胞[7-9]，CD55、CD59檢測對于PNH的診斷仍有一定的局限性。在這種情況下人們找到了FLAER分析法彌補(bǔ)其不足。1999年，Brodsky等[3]發(fā)現(xiàn)PNH細(xì)胞對氣單胞菌溶素抵抗，利用這一特性可區(qū)分GPI+和GPI-細(xì)胞。經(jīng)過改進(jìn)，用熒光標(biāo)記嗜水氣單胞菌溶素前體的變異體 (fluorescent aerolysin,FLAER)，使之特異性地與細(xì)胞膜上的GPI錨連蛋白結(jié)合而直接反映錨連蛋白的缺失情況。因此FLAER診斷的特異性與其它靶向標(biāo)記抗原相比較而言有所提高。

本研究中，我們采用流式細(xì)胞術(shù)對10例PNH患者和37例非PNH貧血患者進(jìn)行檢測，結(jié)果表明FLAER對區(qū)分正常和異常的細(xì)胞群更加明顯，并且非PNH患者FLAER呈100%陽性，而CD55－占(3.31±4.26)%，CD59－占 (0.78±1.39)%。 由此說明FLAER分析法較CD55、CD59檢測假陰性率低，特異性好。通過對FLAER和CD55、CD59檢測結(jié)果進(jìn)行比較，對于PNH患者，F(xiàn)LAER分析檢出率達(dá)100%；而CD55、CD59抗原缺失檢測存在2例陰性結(jié)果 (如圖3所示)。這2例患者外周血紅細(xì)胞CD55－、CD59－＜5%， 而 FLAER 檢測粒細(xì)胞陰性率分別為67.3%、17.4%，單核細(xì)胞陰性率分別為54.3%、52.5%，明顯存在GPI錨連蛋白的缺失。造成這一結(jié)果的原因一方面可能是PNH患者處于發(fā)作期，呈典型的血管內(nèi)溶血的臨床表現(xiàn)，紅細(xì)胞溶解而影響紅細(xì)胞表面抗原檢測結(jié)果；另一方面可能是貧血患者采用輸血作為治療手段，導(dǎo)致CD55、CD59缺陷紅細(xì)胞稀釋而影響檢測結(jié)果。同時(shí)，由于紅細(xì)胞表面某些糖蛋白的存在使FLAER不能很好地與錨連蛋白結(jié)合，因此我們首先利用CD24和CD14對粒細(xì)胞和單核細(xì)胞進(jìn)行靶向標(biāo)記，再進(jìn)行FLAER分析。這樣提高了FLAER檢測的敏感度，避免輸血或溶血導(dǎo)致的PNH克隆的減少，對于PNH的診斷更有意義。此外，我們發(fā)現(xiàn)PNH患者外周血中粒細(xì)胞FLAER陰性率達(dá)(82.52±25.24)%，單核細(xì)胞 FLAER陰性率達(dá)(79.84±19.86)%，PNH 克隆數(shù)明顯大于 CD55、CD59抗原檢測。進(jìn)一步說明與CD55、CD59檢測相比，F(xiàn)LAER技術(shù)對PNH診斷具有更大的優(yōu)勢。

目前已證實(shí)PNH的發(fā)生是由于造血干細(xì)胞PIG-A基因突變所致，PNH克隆可累及幾乎所有血細(xì)胞；本研究結(jié)果顯示在10例PNH患者外周血中，紅系PNH克隆數(shù)均明顯低于粒系和單核系，說明紅系的PNH克隆檢測并不能完全反映患者的真實(shí)情況，這可能與紅細(xì)胞壽命較短有關(guān)。因此，F(xiàn)LAER對白細(xì)胞的分析能夠更可靠地反映PNH克隆情況，這對PNH微小克隆的檢測、PNH血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)評估及其治療具有重要意義。

綜上所述，F(xiàn)LAER技術(shù)對PNH的診斷比CD55、CD59檢測更加特異、敏感、直觀；FLAER分析更能反映PNH克隆的變化情況，對PNH微小克隆的檢測及治療具有重要價(jià)值。

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