諾如病毒感染及其實(shí)驗(yàn)室檢查

林迪，孫長(zhǎng)貴

(解放軍第117醫(yī)院檢驗(yàn)科南京軍區(qū)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)質(zhì)控中心，浙江 杭州310013)

諾如病毒(Norovirus，NV)是世界范圍內(nèi)引起人類非細(xì)菌性急性胃腸炎的一種高度傳染性病原菌[1]，該病毒具有高度感染性,傳播途徑廣泛,人群普遍易感,容易在餐館、學(xué)校、社區(qū)、醫(yī)院、托兒所、養(yǎng)老院等聚集性場(chǎng)所引起集體暴發(fā)[2]。在美國(guó)，據(jù)估計(jì)諾如病毒每年將造成2100萬(wàn)人感染，71000人住院治療，800人死亡[3]。諾如病毒原型株諾瓦克病毒(Norwalk virus)于1968年在美國(guó)諾瓦克市暴發(fā)的一次急性腹瀉患者糞便中分離到，1972年Kapikian等人通過(guò)免疫電子顯微鏡從患者的糞便中檢測(cè)到直徑為27 nm的病毒顆粒，命名為諾瓦克病毒[4]。2002年8月第八屆國(guó)際病毒命名委員會(huì)批準(zhǔn)名稱為諾如病毒。1995年，中國(guó)報(bào)道了首例諾如病毒感染，之后山西、北京、安徽、福州、武漢、廣州、浙江嘉興等地區(qū)先后發(fā)生多起諾如病毒感染性腹瀉暴發(fā)疫情。本文就諾如病毒相關(guān)的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性、發(fā)病機(jī)制、流行病學(xué)、臨床表現(xiàn)、診斷與鑒別診斷和實(shí)驗(yàn)室檢查等作簡(jiǎn)要綜述。

1 諾如病毒的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性

諾如病毒屬于人杯狀病毒科、諾如病毒屬，其病毒顆粒直徑約為26～35nm，無(wú)包膜，表面粗糙，球形，呈二十面體對(duì)稱；負(fù)染色電鏡照片顯示，NV具有典型的羽狀外緣，表面有凹痕的小圓狀結(jié)構(gòu)。NV為單股正鏈 RNA病毒,全長(zhǎng)約7642bp，包括3個(gè)開(kāi)放閱讀框：ORF1編碼包括保守的具有RNA多聚酶在內(nèi)的非結(jié)構(gòu)蛋白；ORF2編碼分子量約為56KDa的衣殼蛋白；ORF3編碼一種分子量約為22.5KDa的強(qiáng)堿性微小結(jié)構(gòu)蛋白[5]。目前NV尚未能按血清學(xué)進(jìn)行分類，但根據(jù)RNA多聚酶區(qū)核苷酸序列的相似性，被分為5個(gè)基因組：GⅠ、GⅡ、GⅢ、GⅣ和GⅤ，其中可感染人類有GⅠ、GⅡ和GⅣ[6]，而 GⅢ、GⅡ、GⅤ分別感染牛、豬和鼠。目前，GⅡ是世界范圍內(nèi)NV流行的主要基因型，優(yōu)勢(shì)株為GⅡ-4[7]。NV對(duì)熱、乙醚和酸穩(wěn)定，室溫pH2.7環(huán)境下存活 3h，20%乙醚 4℃處理存活 18h，60℃孵育30min仍有感染性，也耐受普通飲水中3.75～6.25mg/L 的 Cl-濃度(游離氯 0.5~1.0mg/L)，但在處理污水的10mg/L的Cl-濃度中被滅活。

2 發(fā)病機(jī)制

由于NV不能在體外進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，也沒(méi)有合適的動(dòng)物模型，因此其發(fā)病機(jī)制的研究受到阻礙[8]。但目前大部分研究證明人組織血型抗原(histoblood group antigens，HBGAs)為 NV 與胃腸道黏膜上皮細(xì)胞結(jié)合的受體，宿主的遺傳因素被認(rèn)為是NV感染的重要因素[9]。NV通過(guò)人組織血型抗原受體與胃十二指腸上皮細(xì)胞結(jié)合后，將其遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移至上皮細(xì)胞內(nèi)，在其中復(fù)制產(chǎn)生新的病毒，然后再感染十二指腸和空腸上段，并造成上皮細(xì)胞空泡變性和微絨毛變短，腸上皮細(xì)胞損傷造成一系列生物大分子的數(shù)量和活性發(fā)生改變，引起糖類和脂類吸收障礙，導(dǎo)致腸腔滲透壓升高，體液進(jìn)入腸腔，出現(xiàn)嘔吐和腹瀉。

3 流行病學(xué)

NV流行地區(qū)極為廣泛，分布于各大洲，NV感染疫情全年均可發(fā)生，但在寒冷季節(jié)呈現(xiàn)高峰，NV感染多以集體暴發(fā)流行的形式出現(xiàn)。NV感染濃度低(100個(gè)病毒顆粒即可導(dǎo)致發(fā)病)、環(huán)境穩(wěn)定性以及缺乏持久的免疫力等原因，導(dǎo)致NV感染性強(qiáng)[10,11]，Cannon等報(bào)道，發(fā)達(dá)國(guó)家42%~90%的非細(xì)菌性腹瀉暴發(fā)是由NV引起的[12]。我國(guó)自1995年報(bào)道了首例NV感染，之后許多地區(qū)發(fā)生NV感染疫情。2006年2月廣西大新縣農(nóng)場(chǎng)72人出現(xiàn)NV感染引起的急性胃腸炎癥狀；2010年12月廣州從化發(fā)生水污染引起的NV感染事件，共有429人發(fā)??；2013年3月，廣州大學(xué)城多所高校出現(xiàn)因感染NV，而導(dǎo)致的聚集性腹瀉病例，累計(jì)確診200多例；2013年4月，廣東省揭陽(yáng)市揭陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院近400名學(xué)生感染NV；2014年2月嘉興市多個(gè)學(xué)校和幼兒園暴發(fā)NV感染，累計(jì)報(bào)告發(fā)病人數(shù)共511人；2014年11月廣州南洋理工職業(yè)學(xué)院暴發(fā)NV感染，受感染人數(shù)達(dá)274例。由此可見(jiàn)，我國(guó)NV感染主要集中在南方城市，廣東、浙江、廣西等均是多發(fā)省份，且暴發(fā)起數(shù)和病例數(shù)均呈逐年增加趨勢(shì)。

3.1 傳染源和宿主范圍 傳染源主要為NV胃腸炎患者、隱性感染者及病原攜帶者。以前人被認(rèn)為是NV的唯一宿主，但近年來(lái)豬、牛、鼠等動(dòng)物的糞便中也檢測(cè)到該病毒。同時(shí)也有很多關(guān)于貝類引起NV暴發(fā)的報(bào)道，但實(shí)際上它們并不是宿主，只是寄生。

3.2 傳播途徑 糞-口途徑是NV感染的主要傳播方式，可以通過(guò)污染的水源、食物、物品、空氣等傳播，也可通過(guò)吸入懸浮在空中的由污染物形成的氣溶膠等形式傳播。

3.3 高危人群 NV傳染性強(qiáng)，每個(gè)年齡段的人均易感，但以學(xué)齡兒童和成年人為主[13]。

4 臨床表現(xiàn)和病理特點(diǎn)

臨床NV感染潛伏期多在24～48h，最短12h，最長(zhǎng)72h。感染者發(fā)病突然，主要癥狀為惡心、嘔吐、腹痛、肌痛和非血性腹瀉[4]。兒童患者嘔吐普遍，成人患者腹瀉為多，24h內(nèi)腹瀉4~8次，糞便為稀水便或水樣便，無(wú)黏液膿血，糞檢白細(xì)胞陰性,未見(jiàn)RBC。原發(fā)感染患者的嘔吐癥狀明顯多于繼發(fā)感染者，有些感染者僅表現(xiàn)出嘔吐癥狀，故在臨床常稱為“冬季嘔吐病”。此外，頭痛、輕度發(fā)熱、寒顫也是常見(jiàn)癥狀，嚴(yán)重者出現(xiàn)脫水癥狀。

細(xì)胞水平的病變?yōu)槟c上皮細(xì)胞微絨毛變短、隱窩增大和細(xì)胞內(nèi)空泡形成；組織水平的病變表現(xiàn)為固有層單核細(xì)胞浸潤(rùn)；沒(méi)有觀察到腸上皮細(xì)胞壞死和腸黏膜下炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

5 診斷與鑒別診斷

5.1 診斷 主要依據(jù)流行季節(jié)、地區(qū)、發(fā)病年齡等流行病學(xué)資料、臨床表現(xiàn)以及實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行診斷。

5.1 .1診斷標(biāo)準(zhǔn)

5.1 .1.1疑似病例 (1)潛伏期 24~48h;(2)50%以上發(fā)生嘔吐;(3)病程 12~60 h;(4)糞便、血常規(guī)檢查無(wú)特殊發(fā)現(xiàn);(5)排除常見(jiàn)細(xì)菌、寄生蟲(chóng)及其他病原感染。

5.1 .1.2確診病例 疑似病例基礎(chǔ)上，在糞便標(biāo)本或嘔吐物中檢測(cè)出諾如病毒。

5.2 鑒別診斷 諾如病毒性胃腸炎與細(xì)菌性、真菌性和原蟲(chóng)性腹瀉鑒別；與其他病毒性胃腸炎的鑒別。常見(jiàn)的病毒性胃腸炎中，輪狀病毒、腺病毒和星狀病毒性胃腸炎主要見(jiàn)于嬰幼兒，病程較長(zhǎng)，多為1周左右。

6 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

6.1 電鏡檢查

6.1 .1直接電鏡法 (EM)將糞便標(biāo)本制成懸液離心，負(fù)染病毒顆粒后直接鏡下觀察，根據(jù)病毒粒子的大小、形狀等鑒定是否為NV。但該方法靈敏度較低，要求每毫升標(biāo)本中至少有105~106個(gè)病毒顆粒，患者早期病毒大量排出時(shí)的檢出率只有 10%~20%，不適合大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查。

6.1 .2免疫電鏡法 (IEM)將糞便標(biāo)本制成懸液離心得到的病毒顆粒與標(biāo)準(zhǔn)血清共孵育，再經(jīng)負(fù)染后在鏡下觀察來(lái)檢測(cè)病毒，可用于患者恢復(fù)期血清捕捉同型抗原，該方法檢出率比直接電鏡法高10~100倍?？偟膩?lái)說(shuō)，電鏡設(shè)備昂貴，檢出率較低，且受操作者的影響較大，不適合廣泛普及。

6.2 免疫法 目前較常用的免疫學(xué)方法包括放射免疫法(RIA)、生物素-親和素免疫法(Biotin-Avidin Immunoassay)、酶聯(lián)免疫法(ELISA)等。RIA既具有免疫反應(yīng)的高特異性，又具有放射性測(cè)量的高靈敏度,該方法可檢測(cè)抗體升高水平，但其耗時(shí)長(zhǎng)且需放射性同位素標(biāo)記；為了簡(jiǎn)化方法，美國(guó)疾病預(yù)防控制中心建立了生物素-親和素免疫法，其靈敏度與RIA法相當(dāng)，目前該方法已成為美國(guó)疾病預(yù)防控制中心檢測(cè)諾瓦克樣病毒(NLV)抗原和抗體的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方法之一；ELISA主要用于檢測(cè)NV核衣殼抗原，該方法操作簡(jiǎn)單，價(jià)格低廉，可用于NV大規(guī)模暴發(fā)后的篩查，但對(duì)于ELISA技術(shù)來(lái)說(shuō)其特異性較強(qiáng)在90.91%~96.37%之間，而靈敏度差異較大在43.81%~97.14%之間[14-16]。

6.3 基因芯片 該方法通過(guò)在玻璃芯片上以鏈霉親和素包被的磁珠作為標(biāo)記物，采用生物素標(biāo)記的核酸為樣品，通過(guò)鏈霉親和素與生物素的親和作用，進(jìn)行核酸雜交檢測(cè)，雜交結(jié)果以肉眼或通過(guò)普通顯微鏡觀測(cè)，該方法靈敏度、特異性與RTPCR基本相近，但檢測(cè)費(fèi)用較昂貴。

6.4 病毒核酸檢測(cè) 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) (RTPCR)能更準(zhǔn)確、靈敏地檢測(cè)標(biāo)本中的NV，尤其是低濃度感染 (即可檢測(cè)糞便中102~104病毒顆粒/ml)，現(xiàn)已廣泛用于NV的檢測(cè)。利用RT-PCR可以快速擴(kuò)增患者嘔吐物、糞便以及水中NV特異性的基因片段，成為NV診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。GⅠ、GⅡ型諾如病毒RT-PCR檢測(cè)引物序列見(jiàn)表1。RT-PCR反應(yīng)總體積為 25μl：PrimeScript1Step EnzymeMix,1μl；2×1 Step Buffer,12.5μl；G1SKF/G1SKR(33μmol/L)、C0G2F/G2SKR(33μmol/L)各 0.2μl；RNA，10.7μl；DEPC 水補(bǔ)足體系到 25μl。 擴(kuò)增條件：94℃ 3min；94℃ 30s，55℃30s，72℃1min，共35個(gè)循環(huán)；最后 72℃延伸 7min。

表1 RT-PCR檢測(cè)諾如病毒引物序列[6,17]

7 結(jié)束語(yǔ)

在我國(guó)，諾如病毒暴發(fā)平均每起暴發(fā)發(fā)病89人，暴發(fā)規(guī)模及危害性均較大[18]。近期，廣東省多處學(xué)校已陸續(xù)發(fā)生由諾如病毒感染引起的聚集性疫情，一時(shí)間“諾如”成了“登革熱”后廣州的又一流行詞。雖然屬于自限性疾病的諾如病毒性胃腸炎癥狀輕微，但其發(fā)病急、傳播速度快、涉及范圍廣，可導(dǎo)致嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。目前尚無(wú)針對(duì)性的抗病毒藥物,以對(duì)癥或支持治療為主，一般不需使用抗生素,預(yù)后良好。由于諾如病毒只寄生于活的宿主細(xì)胞內(nèi)，無(wú)法在體外培養(yǎng)，從而不能通過(guò)傳統(tǒng)的減毒或滅活病毒方式來(lái)制備疫苗，因此迄今尚無(wú)諾如病毒疫苗問(wèn)世。眼下，我國(guó)已經(jīng)到了諾如病毒的高發(fā)季節(jié)，我們應(yīng)加強(qiáng)諾如病毒感染疫情的防控工作以及提高實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力，以減少諾如病毒感染疫情的暴發(fā)。

[1]Yan Y，Wang HH，Gao L,et al.A one-step multiplex real-time RT-PCR assay for rapid and simultaneous detection of human norovirus genogroup I,IIand IV[J].JVirol Methods,2013,189(2):277-282.

[2]Lopman B,Zambon M,Brown DW，et al.The evolution of norovirus,the"gastric flu"[J].PLoSMed,2008,5(2):e42.

[3]Scallan E,Griffin PM,Angulo FJ,et al.Foodborne illness acquired in the United States-major pathogens [J].Emerg Infect Dis,2011,17(1):7-15.

[4]Patel MM,Hall AJ,Vinje J,et al.Noroviruses:a comprehensive review[J].JClin Virol,2009,44(1):1-8.

[5]Phan TG,Takanashi S,Kaneshi K,et al.Detection and genetic characterization of norovirus strains circulating among infants and children with acute gastroenteritis in Japan during 2004-2005[J].Clin Lab,2006,52(9-10):519-525.

[6]Han TH,Kim SC,Kim ST,et al.Detection of norovirus genogroup IV,klassevirus,and peppermild mottle virus in sewage samples in South Korea[J].Arch Virol,2014,159(3):457-463.

[7]Bok K,Abente EJ,Realpe-Quintero M,et al.Evolutionary dynamics of GII.4 noroviruses over a 34-year period[J].JVirol,2009,83(22):11890-11901.

[8]Cheetham S,Souza M,Meulia T,et al.Pathogenesis of a genogroup II human norovirus in gnotobiotic pigs[J].J Virol,2006,80(21):10372-10381.

[9]Lindesmith L,Moe C,Marionneau S,et al.Human susceptibility and resistance to Norwalk virus infection[J].Nat Med,2003,9(5):548-553.

[10]Teunis PF,Moe CL,Liu P,et al.Norwalk virus:how infectious is it[J].JMed Virol,2008,80(8):1468-1476.

[11]Duizer E,Bijkerk P,Rockx B,et al.Inactivation of caliciviruses[J].Appl Environ Microbiol,2004,70(8):4538-4543.

[12]Cannon JL,Papafragkou E,Park GW,et al.Surrogates for the study of norovirus stability and inactivation in the environment：A comparison ofmurine norovirus and feline calici virus[J].J Food Prot,2006,69(11):2761-2765.

[13]Rockx B,De Wit M,Vennema H,et al.Natural history of human calicivirus infection:a prospective cohort study[J].Clin Infect Dis,2002;35(3):246-253.

[14]Okitsu-Negishi S,Okame M,Shimizu Y,et al.Detection of norovirus antigens from recombinant virus-like particles and stool samples by a commercial norovirus enzyme-linked immunosorbent assay kit[J].JClin Microbiol,2006,44(10):3784-3786.

[15]高志勇,呂虹,黃芳,等.90例病毒性胃腸炎患者糞便中諾如病毒檢出情況分析[J].中國(guó)病原生物學(xué)雜志,2008,3(8):564-566.

[16]Gray JJ,Kohli E,Ruggeri FM,et al.European multicenter evaluation of commercial enzyme immunoassays for detecting norovirus antigen in fecal samples[J].Clin Vaccine Immunol,2007,14(10):1349-1355.

[17]林謙,程衛(wèi)霞,金玉,等.2009-2010年南京地區(qū)腹瀉嬰幼兒中人類杯狀病毒感染流行病學(xué)特點(diǎn)分析 [J].臨床兒科雜志，2012,30(10):924-927.

[18]張靜,常昭瑞,孫軍玲,等.我國(guó)諾如病毒感染性腹瀉流行現(xiàn)狀及防制措施建議[J].疾病監(jiān)測(cè),2014,29(7):516-521.