壓裂液增稠劑降解菌的誘變育種研究*

李慧玲，劉祖艷，趙 敏*

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150040；2.東北林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150040）

目前，石油的開采難度逐漸增加，向油井注入壓裂液是增產(chǎn)的重要措施之一。為了提高壓裂效果，常常向其里面加入增稠劑，如魔芋膠。壓裂工作結(jié)束后，需要降低壓裂液的黏度，以方便其返排到地面。降低壓裂液黏度的關(guān)鍵是破膠，生物酶破膠劑高效、環(huán)保，所以開發(fā)高效的、新型的生物酶破膠劑是當(dāng)前石油開采中需要解決的重要問題之一。

β- 甘露聚糖酶可以酶解魔芋膠等壓裂液增稠劑，作為生物酶破膠劑具有化學(xué)破膠劑無法比擬的優(yōu)越性；本文對降解魔芋膠產(chǎn)β- 甘露聚糖酶的菌株進(jìn)行物理和化學(xué)誘變，提高其產(chǎn)酶的活性，為油田生物酶破膠劑的開發(fā)和生產(chǎn)提供高效的酶。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 出發(fā)菌株主要試劑及培養(yǎng)基

東北林業(yè)大學(xué)微生物及免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存菌株Bacillus subtilis K。Bacillus subtilis K 經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)可以降解魔芋膠產(chǎn)β- 甘露聚糖酶[1]。

魔芋膠（成都路特實(shí)業(yè)有限公司）；甲基磺酸乙酯（EMS）（Sigma 公司）。

魔芋膠產(chǎn)酶培養(yǎng)基：魔芋膠30g·L-1，酵母膏5g·

L-1，NaCl 4g·L-1，KNO36g·L-1，K2HPO45g·L-1，MgSO4·7H2O 0.2g·L-1，pH 值為8.0。

魔芋膠初篩培養(yǎng)基：魔芋膠3g·L-1，CaCl20.5g·L-1，

KH2PO40.05g·L-1，NaCl 0.8g·L-1，MgSO4·7H2O 0.025g·L-1，KNO30.7g·L-1，酵母膏2g·L-1，蛋白胨5g·L-1，瓊脂18g·L-1，pH7.0。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 出發(fā)菌株生長曲線的測定 取滅菌的牙簽挑取適量菌體接入LB 培養(yǎng)基中，37℃150～160r·min-1，培養(yǎng)約12h。取種子液1mL 移入到50mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃150～160r·min-1培養(yǎng)。間隔2h取樣測菌液的OD600 值，繪制生長曲線。每次測量取3 組平行。

1.2.2 DNS 測定β- 甘露聚糖酶活力 采用改進(jìn)的3,5- 二硝基水楊酸法（DNS 方法）測定酶活力。利用比色法測定酶解后還原產(chǎn)物的生成量，以表示酶的活力。

酶活力定義：在一定溫度和pH 值條件下，以每分鐘生成相當(dāng)于1μmol D- 甘露糖所需酶量為一個(gè)酶活力單位（IU）。

1.2.3 出發(fā)菌株產(chǎn)酶歷程的測定 取滅菌的牙簽挑取適量菌體接入LB 培養(yǎng)基中，37℃150～160r·min-1，培養(yǎng)12h 左右。將600μL 種子液移入到魔芋膠產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，37℃150～160 r·min-1培養(yǎng)。間隔2h 取樣，用DNS 方法測定發(fā)酵液中酶的活性。每次測量取3 組平行。

1.2.4 紫外誘變育種

1.2.4.1 菌懸液的制備 挑取菌體接種于LB 液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)菌種達(dá)到對數(shù)生長期的后期，8000r·min-1離心5min，用生理鹽水洗滌菌體3 次。利用紫外分光光度計(jì)在600nm 波長下，測定OD 值，用生理鹽水配制成20mL 菌懸液，調(diào)整菌懸液中菌體濃度為108cfu·mL-1。

1.2.4.2 誘變處理 首先開啟紫外燈（20W）預(yù)熱20min。取4mL 制備好的菌懸液移入無菌培養(yǎng)皿中。將其置于磁力攪拌器上，放入無菌磁力攪拌棒，在20W 的紫外燈下，25cm 處進(jìn)行照射。照射1min 后打開培養(yǎng)皿蓋，邊攪拌邊照射，劑量分別為0，10，15，20，25，30，35，40，45，50s?？梢岳鄯e照射也可以分別照射，為了防止光復(fù)活，全部無菌操作必須在紅燈下進(jìn)行。

用無菌生理鹽水以10-1-10-6 稀釋度稀釋誘變菌液和未誘變菌液，分別取10-5，10-6 濃度菌液（包括誘變菌液和未誘變菌液）涂布于LB 固體平板培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)過夜，計(jì)算致死率，致死率=（對照菌液的活菌數(shù)－處理菌液的活菌數(shù)）/對照菌液的活菌數(shù)×100%。

1.2.4.3 誘變菌株的篩選 隨機(jī)選取120 個(gè)誘變后的菌株點(diǎn)種在魔芋膠初篩培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。首先測量單菌落直徑，再加入剛果紅染液染色，靜置5min，棄掉剛果紅溶液，用自來水緩慢沖洗平板，測量透明水解圈直徑，計(jì)算H/C（水解圈直徑/菌落直徑）比值。選擇H/C 比值高的菌株進(jìn)行DNS方法復(fù)篩。

1.2.4.4 誘變菌株遺傳穩(wěn)定性研究 對酶活性最高的菌株進(jìn)行7 代的傳代培養(yǎng)，測定各代β- 甘露聚糖酶的活性。

1.2.5 甲基磺酸乙酯誘變育種 選擇紫外誘變活性最高的菌株進(jìn)行甲基磺酸乙酯誘變。

1.2.5.1 菌懸液的制備 挑取菌體接種于LB 液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)菌種達(dá)到對數(shù)生長期的后期，8000r·min-1離心5min，用磷酸緩沖溶液洗滌菌體3 次。利用紫外分光光度計(jì)在600nm 波長下，測定OD 值，用磷酸緩沖溶液配制成20mL 菌懸液，調(diào)整菌懸液中菌體濃度為108cfu·mL-1。

1.2.5.2 誘變處理 取4mL EMS 母液，加入到16mL 的菌懸液中。處理最終濃度是1%（體積分?jǐn)?shù)），分裝到6 個(gè)離心管中，每管3mL?；靹蚝笾糜诤銣卣袷幭渲校?7℃，220r·min-1分別振蕩處理5，10，15，20，25，30min 后，每管立即加入0.15mL 25%硫代硫酸鈉（Na2S2O3）溶液終止反應(yīng)。

用無菌生理鹽水稀釋誘變菌液和未誘變菌液，稀釋梯度從10-1-10-6，分別取10-5，10-6 濃度菌液（包括誘變菌液和未誘變菌液）涂布于LB 固體平板培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)過夜，計(jì)算致死率。致死率=（對照菌液的活菌數(shù)－處理菌液的活菌數(shù)）/對照菌液的活菌數(shù)×100%。1.2.5.3 誘變菌株的篩選方法同1.2.3.3。

1.2.5.4 誘變菌株遺傳穩(wěn)定性研究方法同1.2.3.4。

2 結(jié)果與分析

2.1 出發(fā)菌株的生長曲線

以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600為縱坐標(biāo)繪制生長曲線。

圖1 Bacillus subtilis K 生長曲線Fig.1 Growth curve of Bacillus subtilis K

由圖1 中可以看出，培養(yǎng)時(shí)間增加，菌體數(shù)量也逐漸增加，當(dāng)培養(yǎng)菌體13h 時(shí)數(shù)量達(dá)到最大值，之后隨時(shí)間增加菌體數(shù)量呈下降趨勢，所以紫外誘變和甲基磺酸乙酯誘變時(shí)菌體的培養(yǎng)時(shí)間確定為13h。

2.2 出發(fā)菌株的產(chǎn)酶歷程

出發(fā)菌株的產(chǎn)酶歷程見圖2。

發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)初期產(chǎn)酶量較少，在發(fā)酵培養(yǎng)11h 的時(shí)候酶活性達(dá)到最大值，所以發(fā)酵產(chǎn)酶時(shí)間確定為11h。

圖2 Bacillus subtilis K 的產(chǎn)酶歷程Fig.2 Enzyme production process of Bacillus subtilis K

2.3 紫外誘變結(jié)果和遺傳穩(wěn)定性

2.3.1 紫外誘變的致死率 出發(fā)菌株的紫外誘變致死率結(jié)果見圖3。

圖3 Bacillus subtilis K 紫外誘變致死率Fig.3 Ultraviolet mutagenesis fatality rate of Bacillus subtilis K

由誘變劑量的選擇原則可知，當(dāng)紫外誘變致死率為70%～80%時(shí)候，正突變率最高，所以紫外照射時(shí)間選為30～40s。

2.3.2 初篩和復(fù)篩結(jié)果 誘變菌株經(jīng)剛果紅染色，測量水解圈直徑和菌落直徑后，計(jì)算H/C（水解圈直徑/菌落直徑）的比值，選擇比值大的菌株進(jìn)行DNS方法的復(fù)篩。因?yàn)榫渲睆酱螅砻髟摥h(huán)境有利于菌體的生長。與對照組相比，選擇20 株正突變菌株，進(jìn)行DNS 復(fù)篩，最終獲得酶活最高的正突變菌株為Bacillus subtilis K116，酶活力為3656.68U·mL-1，其出發(fā)菌株酶活力為3208.45U·mL-1，紫外誘變使酶活力提高了13.97%。

2.3.3 遺傳穩(wěn)定性 B.subtilis K116 連續(xù)培養(yǎng)7 代，菌株的酶活力見圖4。

圖4 B.subtilis K116 的遺傳穩(wěn)定性Fig.4 Genetic stability of B. subtilis K116

從圖4 可見，突變菌株遺傳穩(wěn)定性良好，可用于后續(xù)研究。

2.4 甲基磺酸乙酯誘變結(jié)果和遺傳穩(wěn)定性

2.4.1 甲基磺酸乙酯誘變致死率 甲基磺酸乙酯屬于化學(xué)誘變劑，本文中誘變劑濃度選為1%。甲基磺酸乙酯對B.subtilis K116 的致死率見圖5。

圖5 B.subtilis K116 甲基磺酸乙酯1%濃度誘變致死率Fig.5 Induced fatality rate of B. subtilis K116 under 1%ethylmethane sulfonate

當(dāng)致死率應(yīng)在70%～80%之間，正突變率最高，所以菌株K116 的甲基磺酸乙酯誘變時(shí)間選為10min。

2.4.2 初篩和復(fù)篩結(jié)果 在初篩平板上倒入剛果紅溶液染色，測量水解圈直徑和菌落直徑，并計(jì)算H/C 比值，與對照組相比，分別選擇20 株正突變菌株，進(jìn)行復(fù)篩。

測定初篩所得的20 株突變株，最終得到的酶活最高的突變菌株B.subtilis KL-116，酶活力為3801.85U·mL-1，甲基磺酸乙酯使酶活力提高了3.97%。

2.4.3 遺傳穩(wěn)定性 B.subtilis KL-116 連續(xù)傳代7次，菌株的酶活見圖6。

圖6 B.subtilis KL-116 的遺傳穩(wěn)定性Fig.6 Genetic stability of B. subtilis KL-116

由圖6 可以看出，菌株遺傳穩(wěn)定性良好，可用于后續(xù)研究。

3 討論

微生物具有高效的生物轉(zhuǎn)化能力，其產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)在醫(yī)藥、食品和化學(xué)工業(yè)中具有重要地位[2]。微生物的誘變育種一般采用物理誘變（如紫外線、X 射線等）和化學(xué)誘變（如堿基類似物、烷化劑甲基磺酸乙酯等）方法[3]。誘變育種方法是通過人為的誘變手段，改變微生物的遺傳結(jié)構(gòu)和功能，從眾多變異的菌體中篩選出產(chǎn)量高、性狀優(yōu)良的突變株。該方法具有速度快、方法簡單、效果明顯等優(yōu)點(diǎn)，是選育菌種的重要途徑之一。

紫外線誘變的機(jī)制是由于紫外線輻射導(dǎo)致DNA 分子形成胸腺嘧啶二聚體，妨礙堿基正常配對，從而引起突變。甲基磺酸乙酯誘變的機(jī)制是使DNA 分子上的堿基及磷酸部分被烷化，DNA 復(fù)制時(shí)導(dǎo)致堿基配對錯(cuò)誤而引起突變[4]。本研究利用紫外線和甲基磺酸乙酯誘變降解壓裂液增稠劑的菌株，結(jié)果表明物理誘變效果好于化學(xué)誘變劑。

［1] 張婕,趙敏,盧磊,李慧玲.產(chǎn)β- 甘露聚糖酶細(xì)菌的篩選及產(chǎn)酶條件的優(yōu)化［J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2011,33（4）:96-101.

［2] Demain A L，Adrio J L.Contributions of microorganisms to industrial biology［J].Mol Biotechnol,2008,38:41-55．

［3] 許翠,高夢祥.微生物菌種誘變篩選方法及其應(yīng)用［J].長江大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）,2013,35（10）:56-60.

［4] 李榮杰.微生物誘變育種方法研究進(jìn)展［J].河北農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,13（10）:73-76.