微型生物輪蟲(chóng)在水處理生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的應(yīng)用

——以安徽工程大學(xué)為例

徐曉平1，陳延松2

(1.安徽工程大學(xué) 建筑工程學(xué)院，安徽 蕪湖 241000；2.合肥師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 合肥 230601)

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微型生物輪蟲(chóng)在水處理生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的應(yīng)用

——以安徽工程大學(xué)為例

徐曉平1，陳延松2

(1.安徽工程大學(xué) 建筑工程學(xué)院，安徽 蕪湖 241000；2.合肥師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 合肥 230601)

[摘要]水處理生物學(xué)是高等學(xué)校給排水科學(xué)與工程專業(yè)必修的專業(yè)基礎(chǔ)課程，該課程傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中常包括大量的微生物培養(yǎng)和觀察項(xiàng)目，實(shí)驗(yàn)操作難度相對(duì)較大。為了克服這個(gè)問(wèn)題，我們選擇使用具有易培養(yǎng)、繁殖快等特點(diǎn)，且在給水和排水處理系統(tǒng)中常見(jiàn)的一類微型水生生物輪蟲(chóng)作為水處理生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課程的主要實(shí)驗(yàn)教學(xué)材料，并初步篩選了5個(gè)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目。實(shí)驗(yàn)教學(xué)表明微型水生生物輪蟲(chóng)在水處理生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

[關(guān)鍵詞]輪蟲(chóng)；水處理生物學(xué)；實(shí)驗(yàn)教學(xué)

水處理生物學(xué)是高等學(xué)校給排水科學(xué)與工程專業(yè)的專業(yè)基礎(chǔ)課之一，課程學(xué)習(xí)目的是讓學(xué)生理解和掌握與水處理相關(guān)的微生物的基本概念、基本理論、實(shí)驗(yàn)方法以及在給水排水工程中的實(shí)際應(yīng)用方面的知識(shí)，提升學(xué)生綜合素質(zhì)和創(chuàng)新能力，鍛煉學(xué)生理論聯(lián)系實(shí)際的能力，為今后從事城市給水排水工程、工業(yè)水處理工程、環(huán)境治理和管理等方面的工作奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)教學(xué)是把理論的、抽象的知識(shí)具體化，實(shí)現(xiàn)對(duì)理論的深層次理解，培養(yǎng)學(xué)生的動(dòng)手能力。因此，水處理生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)開(kāi)展的好壞直接影響到這門課程的教學(xué)效果。由于給排水科學(xué)與工程專業(yè)學(xué)生普遍比較缺乏生物學(xué)知識(shí)，課程所涉及的生物種類多(有微生物、小型動(dòng)物和大型植物)、范圍廣、形態(tài)多樣，而且很多微型生物存在取材難、培養(yǎng)難、觀察難等問(wèn)題，所以，選擇合適的微型生物種類作為教學(xué)材料關(guān)系到實(shí)驗(yàn)教學(xué)的效果。我們根據(jù)我院實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際情況，選擇微型生物——輪蟲(chóng)作為一種主要的一種教學(xué)材料，整合了實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容，收到了較好的教學(xué)效果。

1輪蟲(chóng)及其在水處理過(guò)程中的出現(xiàn)情況

輪蟲(chóng)(rotifer)是體型最小的一類多細(xì)胞動(dòng)物，其大小一般在100-1000μm之間，最小的僅有40um左右，最大的可達(dá)4mm。輪蟲(chóng)的體型多為縱長(zhǎng)形，一般分為頭、軀干和尾三部分。頭部較寬，具有由1-2圈纖毛組成的頭冠(corona)，頭冠的形式不一，有些種類的頭冠上半部完全裂開(kāi)，形成2個(gè)纖毛輪器(trochus)，纖毛擺動(dòng)時(shí)形似車輪，故稱輪蟲(chóng)。輪蟲(chóng)廣泛分布于各類水體中，是浮游動(dòng)物四大類群之一。目前全世界已被描述的輪蟲(chóng)種類達(dá)2000種以上，我國(guó)已報(bào)道的輪蟲(chóng)亦已超過(guò)400種，在已報(bào)道的輪蟲(chóng)中，95%為淡水種類，其中75%的種類營(yíng)附著生活且大多分布于沿岸帶，真正營(yíng)浮游生活的種類僅有100種左右。雖然輪蟲(chóng)的個(gè)體在所有后生動(dòng)物中為最小，但其繁殖速率卻是最快，因此它們能夠迅速占領(lǐng)環(huán)境中的空生態(tài)位，并將初級(jí)生產(chǎn)量(藻類和細(xì)菌等)轉(zhuǎn)化成次級(jí)消費(fèi)者(昆蟲(chóng)、甲殼動(dòng)物和魚類幼體)可利用的形式，其轉(zhuǎn)換效率極高，以至于總浮游生物現(xiàn)存量的30%由其產(chǎn)生。因此，輪蟲(chóng)在淡水水體生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)功能、能量傳遞及物質(zhì)轉(zhuǎn)換上具有重要意義 。

1.1 輪蟲(chóng)在給水處理中的出現(xiàn)

給水系統(tǒng)中無(wú)脊椎動(dòng)物的出現(xiàn)直接影響到出水水質(zhì)，引起人們的高度關(guān)注。Schreiber等人[1]在顆粒活性炭(GAC)池中無(wú)脊椎動(dòng)物的孳生研究中，指出濾池出水中無(wú)脊椎動(dòng)物總豐度可高達(dá)6800個(gè)/m3，輪蟲(chóng)是炭池出水中占主導(dǎo)地位的無(wú)脊椎動(dòng)物，占到了總數(shù)的97%。李小偉等[2]對(duì)南方某水廠炭池中無(wú)脊椎動(dòng)物的種群進(jìn)行了為期13個(gè)月的調(diào)查，研究發(fā)現(xiàn)，炭池中無(wú)脊椎動(dòng)物共為3綱23種(類)，炭池濾后水中無(wú)脊椎動(dòng)物密度最高可達(dá)825個(gè)/m3，主要為輪蟲(chóng)(58%-100%)，優(yōu)勢(shì)種類有單趾輪蟲(chóng)(36%)、鞍甲輪蟲(chóng)(26%)、狹甲輪蟲(chóng)(10%)、腔輪蟲(chóng)(7%)、蛭態(tài)目(5%)等。劉麗君等[3]在中試模擬炭柱上對(duì)生物活性炭(BAC)吸附池?zé)o脊椎動(dòng)物的孳生繁殖以及群落變化規(guī)律進(jìn)行了為期1年的研究，研究結(jié)果表明，性炭吸附柱中孳生的無(wú)脊椎動(dòng)物中輪蟲(chóng)是占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的類群。尹文超等[4]添加一系列不同粒徑和不同高度的砂墊層于5根活性炭濾柱中，在10個(gè)月的連續(xù)運(yùn)行期間，濾柱出水中共檢出7類無(wú)脊椎動(dòng)物，其中輪蟲(chóng)為優(yōu)勢(shì)種群。

1.2輪蟲(chóng)在廢水處理中的出現(xiàn)

輪蟲(chóng)在活性污泥廢水處理系統(tǒng)正常運(yùn)行時(shí)期、有機(jī)物含量較低以及出水水質(zhì)良好時(shí)才會(huì)出現(xiàn)，故輪蟲(chóng)的存在說(shuō)明處理效果較好。然而，有時(shí)處理系統(tǒng)因污泥齡較長(zhǎng)、負(fù)荷較低，污泥因缺乏營(yíng)養(yǎng)而老化解絮，這時(shí)輪蟲(chóng)可因污泥碎屑增多而大量繁殖，1毫升污泥混合液中可多至近萬(wàn)個(gè)輪蟲(chóng)，這是污泥老化解絮標(biāo)志。污泥中常見(jiàn)的有玫瑰旋輪蟲(chóng)和豬吻輪蟲(chóng)，特別是后者的大量繁殖會(huì)將活性污泥蠶食光，造成污水處理失敗，為避免此類現(xiàn)象發(fā)生，當(dāng)鏡檢到豬吻輪蟲(chóng)有大量繁殖的趨勢(shì)時(shí)，為了保持正常運(yùn)行，可暫時(shí)停止曝氣，制造厭氧環(huán)境抑制豬吻輪蟲(chóng)生長(zhǎng)。此外，大多數(shù)輪蟲(chóng)以細(xì)菌、霉菌、藻類、原生動(dòng)物及有機(jī)顆粒為食，因此，輪蟲(chóng)的出現(xiàn)對(duì)于活性污泥中微型生物種群之間關(guān)系的調(diào)節(jié)起到重要作用[5]。

2輪蟲(chóng)在水處理生物學(xué)教學(xué)中的使用

我們實(shí)驗(yàn)教學(xué)中所用的輪蟲(chóng)，包括萼花臂尾輪蟲(chóng)(Brachionuscalyciflorus)、旋輪蟲(chóng)(Philodinasp.)和豬吻輪蟲(chóng)(Dicraniphorussp.)等，均采自蕪湖市汀棠湖(119°21'E, 31°20'N)，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)在25±1℃、自然光照條件下進(jìn)行培養(yǎng)；所用輪蟲(chóng)培養(yǎng)液采用EPA配方[6]，所用餌料由HB-4培養(yǎng)基[7]培養(yǎng)的、處于指數(shù)增長(zhǎng)期的斜生柵藻(Scenedesmusobliquus)，離心濃縮后使用。

我們所用教材是顧夏聲主編的《水處理生物學(xué)》(第5版)，其中“第4篇-微生物學(xué)的研究方法”中涉及到可以使用輪蟲(chóng)以及斜生柵藻作為實(shí)驗(yàn)材料的實(shí)驗(yàn)教學(xué)環(huán)節(jié)有：顯微鏡使用及微生物形態(tài)的觀察、微型動(dòng)物的計(jì)數(shù)、培養(yǎng)基的制備和滅菌、藻類生長(zhǎng)及其抑制實(shí)驗(yàn)、生物毒性檢測(cè)等。下面分別作介紹：

2.1顯微鏡的使用和微生物形態(tài)的觀察

該實(shí)驗(yàn)的目的是讓學(xué)生掌握普通光學(xué)顯微鏡的使用方法，認(rèn)識(shí)活性污泥中出現(xiàn)的原生動(dòng)物和微型生物，并學(xué)習(xí)測(cè)量微生物大小的方法。我們的做法是：從單獨(dú)培養(yǎng)和混合培養(yǎng)的輪蟲(chóng)的燒杯中分別吸取一滴滴到載玻片上，不蓋蓋玻片，讓學(xué)生低倍鏡下尋找水滴中的活動(dòng)的輪蟲(chóng)，這一過(guò)程中讓學(xué)生了解并掌握顯微鏡的使用方法。之后，蓋上蓋玻片，制備微生物標(biāo)本玻片，在選定的接目鏡下，利用低倍鏡，確定目測(cè)微尺一格的長(zhǎng)度(單位以微米計(jì))，畫出所見(jiàn)輪蟲(chóng)的草圖，并量出其中一個(gè)輪蟲(chóng)的尺寸。記下觀察所使用的接目鏡和接物鏡的放大倍數(shù)和算出顯微鏡的放大倍數(shù)。接下來(lái)改用高倍鏡，更加清楚地觀察輪蟲(chóng)形態(tài)和內(nèi)部構(gòu)造，畫出形態(tài)草圖，并與用低倍鏡所看到的比較，記下顯微鏡的放大倍數(shù)。

2.2微型動(dòng)物的計(jì)數(shù)

教材中設(shè)計(jì)的從活性污泥法曝氣池混合液中取樣計(jì)數(shù)，目的是讓學(xué)生測(cè)定活性污泥法曝氣池混合液中微型動(dòng)物的數(shù)目，但實(shí)際操作過(guò)程中，可能受到污泥培養(yǎng)效果的好壞影響，導(dǎo)致樣品中微型生物的較少，為了使學(xué)生更好地掌握計(jì)數(shù)方法，我們?cè)谌踊钚晕勰嘀埃葟妮喯x(chóng)培養(yǎng)液中定量抽樣(根據(jù)實(shí)際可以選擇用甲醛固定)，在微型動(dòng)物計(jì)數(shù)板或者直接滴到載破片上進(jìn)行全計(jì)數(shù)，進(jìn)而根據(jù)抽樣情況反推培養(yǎng)液中輪蟲(chóng)的實(shí)際密度，同樣的方法還可以開(kāi)展斜生柵藻的抽樣計(jì)數(shù)。在掌握上述計(jì)數(shù)方法后，再讓學(xué)生取活性污泥進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)。

2.3培養(yǎng)基的制備和滅菌

該實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的目的是讓學(xué)生學(xué)會(huì)玻璃器皿的洗滌和滅菌前的準(zhǔn)備工作，掌握培養(yǎng)基配制和無(wú)菌水制備的方法。輪蟲(chóng)培養(yǎng)基我們使用的美國(guó)國(guó)家環(huán)保局的配方[6]，具體配方是：每升蒸餾水中96mg碳酸氫鈉、60mg硫酸鈣、60mg硫酸鎂以及4mg氯化鉀。培養(yǎng)斜生柵藻所用的培養(yǎng)基是HB-4培養(yǎng)基(章宗涉和黃祥飛, 1991)，具體配方是：每10L蒸餾水中2.0g硫酸銨、0.15g磷酸氫二鉀，0.15g無(wú)水氯化鈣，0.8g硫酸鎂、1.0g碳酸氫鈉、0.25g氯化鉀、5ml土壤浸出液、10mlA5液、1.5ml三氯化鐵(1.5%)溶液。這兩種培養(yǎng)基均需高壓滅菌后方可使用。此外，斜生柵藻在培養(yǎng)過(guò)程中，需要每天進(jìn)行擴(kuò)大接種，接種需在無(wú)菌環(huán)境中操作。因此，學(xué)生在完成上述操作過(guò)程中即可掌握電子天平的使用、無(wú)菌水的制備、滅菌以及無(wú)菌操作等技術(shù)。

2.4藻類生長(zhǎng)及其抑制實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖亲寣W(xué)生掌握藻類的培養(yǎng)方法，學(xué)習(xí)藻類檢測(cè)毒物的方法。我們采用投喂輪蟲(chóng)所用的斜生柵藻開(kāi)展此項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，藻種購(gòu)置中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所。斜生柵藻的培養(yǎng)采用半連續(xù)培養(yǎng)法，具體做法是：用無(wú)菌操作法從瓊脂斜面上跳取適量健壯藻種，接種到盛有200mlHB-4培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，置于恒溫光照生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度控制在25℃±1，光照4000-4500lx，每天光照時(shí)間為光/暗為16/8。自接種之日起，每天早中晚輕搖培養(yǎng)瓶3次。第2、3、4天分別加100mlHB-4培養(yǎng)基，第5天離心收集。離心條件是3500-4000轉(zhuǎn)/分鐘，離心結(jié)束后棄去上清液，應(yīng)用細(xì)胞計(jì)數(shù)板抽樣收集的藻細(xì)胞液在顯微鏡下計(jì)數(shù)，確定藻細(xì)胞濃度。

生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)我們采用硫酸銅作為毒物，逐級(jí)稀釋成含Cu2+濃度為0.00001、0.0005、0.001、0.005、0.01mg/L和空白對(duì)照(即0mg/L)的測(cè)試液各200ml，吸取計(jì)數(shù)過(guò)的藻母液分別投入到上述測(cè)試液中，使起始藻細(xì)胞密度為0.1×106個(gè)/ml，之后放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)過(guò)程與上述接種培養(yǎng)過(guò)程一致，第2、3、4、5每天從培養(yǎng)瓶中抽樣1ml進(jìn)行計(jì)數(shù)，每次一個(gè)瓶重復(fù)抽樣3次，取平均值。最后根據(jù)記錄數(shù)據(jù)計(jì)算藻的最大單位生長(zhǎng)率，計(jì)算公式見(jiàn)顧夏聲主編的《水處理生物學(xué)》P386頁(yè)，并對(duì)硫酸銅的毒性進(jìn)行評(píng)定。

2.5生物毒性檢測(cè)

由于工業(yè)廢水性質(zhì)復(fù)雜，其中不少有毒物質(zhì)很難用化學(xué)方法測(cè)得，且這些物質(zhì)往往之間會(huì)發(fā)生復(fù)雜的相互作用，作用結(jié)果常很不易通過(guò)化學(xué)定量來(lái)表征，因此，需要開(kāi)展生物毒性實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)廢水綜合毒性。我們教材中建議的實(shí)驗(yàn)材料是魚類，但是魚類存在難培養(yǎng)、敏感度不夠以及成本大等特點(diǎn)。輪蟲(chóng)具有分布廣泛、繁殖迅速、世代時(shí)間短、易培養(yǎng)以及存活、繁殖和行為等對(duì)環(huán)境理化因子的變化敏感等優(yōu)點(diǎn)，因此在水生態(tài)毒理學(xué)研究和水環(huán)境監(jiān)測(cè)中日益受到研究者的青睞[8]。美國(guó)國(guó)家環(huán)保局將萼花臂尾輪蟲(chóng)和褶皺臂尾輪蟲(chóng)(B.plicatilis)分別作為淡水和海水污染的測(cè)試生物列入了國(guó)家測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)[9]。

我們開(kāi)展此項(xiàng)實(shí)驗(yàn)的具體做法是：第一步，廢水取樣，取工業(yè)廢水和污水處理廠不同工藝段的出水，進(jìn)行常規(guī)理化分析后冷藏保存。第二步，實(shí)驗(yàn)前逐級(jí)稀釋廢

水樣品，按照廢水與輪蟲(chóng)培養(yǎng)液體積比逐級(jí)稀釋，如100%、75%、50%、25%等作為測(cè)試液，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照(即0%)。取5ml測(cè)試液于小燒杯中，每個(gè)處理組設(shè)置3個(gè)平行，每個(gè)小燒杯中放入10個(gè)輪蟲(chóng)(齡長(zhǎng)在10小時(shí)之內(nèi))，24小時(shí)和48小時(shí)后觀察輪蟲(chóng)存活情況，記錄并計(jì)算對(duì)輪蟲(chóng)產(chǎn)生影響的半數(shù)效應(yīng)濃度(Median effective concentration，EC50)和最低無(wú)稀釋效應(yīng)濃度(Lowest ineffective dilution，LID)，并據(jù)此推測(cè)廢水綜合毒性[10]。

上述可見(jiàn)，輪蟲(chóng)作為在給水和排水系統(tǒng)中常見(jiàn)的一類微型生物，它容易取材和培養(yǎng)、操作簡(jiǎn)單，通過(guò)整合實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，在水處理生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中可以有著很好的應(yīng)用；而且，作為一種理想的實(shí)驗(yàn)材料，在教師科研中也有著較好的應(yīng)用[11]，值得進(jìn)一步推廣使用。

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[中圖分類號(hào)]G61

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]B

[文章編號(hào)]1674-2273(2015)06-0098-02

作者簡(jiǎn)介][第一 徐曉平(1979 - )，男，安徽當(dāng)涂人，安徽工程大學(xué)建筑工程學(xué)院講師，博士，研究方向：水污染生態(tài)學(xué)。

[基金項(xiàng)目]安徽工程大學(xué)青年科研基金(2015YQ01)

[收稿日期]2015-06-18