洋蔥黃酮超聲波輔助提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究

賈 楠，趙二勞*，范建鳳，任光明，武宇芳，袁一柯

（忻州師范學(xué)院1.化學(xué)系;2.生物系，山西 忻州 034000）

0 引言

洋蔥（Allium cepa L.）為百合科草本植物，在我國廣為栽培，資源豐富.洋蔥以其肥大的肉質(zhì)鱗莖供食用，為人們所喜愛食物，素有“ 蔬中皇后”之美譽(yù).洋蔥中含有黃酮類化合物，洋蔥中黃酮類化合物具有抑菌、抗癌、降血糖、降血脂、抗血小板凝聚和抗氧化等多種生物活性[1-4]，在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景.但由于黃酮類化合物不能在人體中直接合成，只能從食品中獲得[5]，因此從天然產(chǎn)物中提取黃酮的研究受到人們的廣泛關(guān)注.目前，對洋蔥黃酮類化合物的提取及抗氧化活性研究已有一些報(bào)道，如劉安軍等[6]研究了洋蔥黃酮的熱水浸提工藝，王卓慧等[7]研究了洋蔥黃酮的乙醇提取工藝.王瑩等[8]采用微波輔助法，侯冬巖等[9]采用超聲波輔助法提取洋蔥黃酮，同時(shí)也初步研究了洋蔥黃酮的抗氧化活性[4，10].這些研究均取得了一些有意義的成果，但總體來說，洋蔥黃酮的相關(guān)研究還較少，且不夠系統(tǒng).基于超聲波輔助提取能夠利用超聲波產(chǎn)生的強(qiáng)烈振動(dòng)、強(qiáng)烈空化效應(yīng)和攪拌作用等，造成植物細(xì)胞壁的破壞，加速有效成分進(jìn)入溶劑，從而縮短提取時(shí)間，提高得率，避免高溫長時(shí)間作用對提取成分的影響[11].作者采用超聲波輔助提取洋蔥中黃酮類化合物，通過單因素分析結(jié)合正交試驗(yàn)，優(yōu)化該提取工藝，并以清除DPPH·和·OH 法評價(jià)洋蔥黃酮的抗氧化活性，旨在為洋蔥資源的深度開發(fā)和綜合利用提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

洋蔥購于當(dāng)?shù)厥卟耸袌觯磧羟衅?，烘箱?0 ℃下烘干，過40 目篩制成洋蔥粉，裝瓶備用.

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：北京化學(xué)試劑公司；1，1-二苯基-2-苦肼基(DPPH·)：日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社；2，6-二叔丁基對甲酚（BHT）、無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、水楊酸和硫酸亞鐵銨等試劑均為國產(chǎn)分析純.試驗(yàn)用水為二次去離子水.

1.2 儀器與設(shè)備

KQ-400KDE 型高功率數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；SP-723 型紫外可見分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司；SHZ-DⅢ型循環(huán)水真空泵：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；AL204型電子分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；GZX-9246 MBE 數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱：上海博遠(yuǎn)實(shí)業(yè)有限公司.

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 洋蔥中黃酮類化合物的提取工藝流程

洋蔥粉→稱質(zhì)量→浸泡→超聲提取→過濾→定容→提取液.主要工藝參數(shù)：洋蔥樣品質(zhì)量2.0 g；浸泡時(shí)間10 min；提取液均定容為100 mL.其余按選定試驗(yàn)條件進(jìn)行.

1.3.2 洋蔥黃酮超聲波輔助提取的單因素試驗(yàn)

在基本試驗(yàn)條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、料液比(g/mL) 1 ∶20、超聲波功率280 W、超聲時(shí)間30 min 和提取溫度35 ℃的情況下，分別對乙醇體積分?jǐn)?shù)（30%、40%、50%、60%、70%和80%）、料液比(g/mL)（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 和1∶35）、超聲波功率（200、240、280、320、360 和400 W）、超聲時(shí)間（15、20、25、30、35 和40 min）和提取溫度（30、35、40、45、50 和55 ℃）進(jìn)行單因素試驗(yàn)，分析各因素對洋蔥黃酮得率的影響.

1.3.3 洋蔥黃酮超聲輔助提取的正交試驗(yàn)及驗(yàn)證

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇對洋蔥黃酮得率影響較大的因素，進(jìn)行正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，優(yōu)化洋蔥黃酮超聲提取工藝，并按照優(yōu)化后的條件進(jìn)行提取試驗(yàn).

1.3.4 洋蔥黃酮得率的測定

以蘆丁為對照品，參考文獻(xiàn)[2，4]方法，采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 體系測定洋蔥黃酮含量.試驗(yàn)測得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：A=0.011 4C+0.001 3，R2=0.999 6.試驗(yàn)時(shí)直接吸取或適當(dāng)稀釋后吸取洋蔥提取液1.0 mL，置于10 mL 比色管中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線方法在510 nm 處測定吸光度，由回歸方程計(jì)算洋蔥提取液中黃酮濃度，按下式計(jì)算洋蔥黃酮得率：

黃酮得率（%）=[黃酮提取量 (mg)/洋蔥質(zhì)量(mg)]×100.

1.3.5 洋蔥黃酮抗氧化活性測定

試驗(yàn)采用清除DPPH·法和清除羥自由基（·OH）法評價(jià)洋蔥黃酮抗氧化活性，并以常用抗氧化劑2，6-二叔丁基對甲酚（BHT）作陽性對照.洋蔥黃酮清除自由基能力越強(qiáng)，則反映其抗氧化活性越強(qiáng).

1.3.5.1 清除DPPH·能力的測定

試驗(yàn)參照文獻(xiàn)[12-13]方法進(jìn)行，在10 mL 比色管中，加入2.0 mL 質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL DPPH·溶液和不同體積的待測液，用水定容至刻度.室溫下反應(yīng)30 min 后，在最大波長517 nm 處測定吸光度，計(jì)算洋蔥黃酮對DPPH·的清除率.清除率計(jì)算公式為：

清除率(%)=[1-（Ai-Aj）/A0]×100，

式中：Ai為2 mL DPPH·溶液加入待測液體系的吸光度；Aj為只加待測液體系的吸光度；A0為只加DPPH·溶液體系的吸光度.

同時(shí)利用半清除率(IC50)定量比較洋蔥黃酮與BHT 對DPPH·的清除能力，即抗氧化活性.

1.3.5.2 清除羥自由基（·OH）能力的測定

試驗(yàn)參照文獻(xiàn) [14]-[15]方法進(jìn)行.在10 mL比色管中，依次加入1.0 mL 濃度為7.5×10-3mol/L的硫酸亞鐵銨溶液，1.0 mL 濃度為7.5×10-3mol/L的水楊酸溶液，1.0 mL 0.1%的H2O2溶液，用水定溶至刻度，置于37 ℃水浴中恒溫反應(yīng)30 min 后，在波長510 nm 處測其吸光度為A0，在上述體系中加入洋蔥黃酮提取液測定吸光度為Ai，僅洋蔥黃酮提取液的吸光度為Aj.計(jì)算洋蔥黃酮對·OH 的清除率，清除率計(jì)算公式為：

清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100.

同時(shí)利用半清除率(IC50)定量比較洋蔥黃酮與BHT 對·OH 的清除能力，即抗氧化活性.

2 結(jié)果與分析

2.1 洋蔥黃酮超聲波輔助提取的單因素試驗(yàn)

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響(表1)

表1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對黃酮得率的影響Table 1 Effect of volume fraction of ethanol on flavonoids yield

由表1 可知，隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，洋蔥黃酮得率增加，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，黃酮得率達(dá)到最大.當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于60%時(shí)，黃酮得率有所下降，其原因可能是乙醇體積分?jǐn)?shù)過大，導(dǎo)致一些醇溶性雜質(zhì)溶出增多，干擾了黃酮的溶出.因此，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%.

2.1.2 料液比的影響(表2)

表2 料液比對黃酮得率的影響Table 2 Effect of ratio of material to liquid on flavonoids yield

由表2 可見，料液比對洋蔥黃酮得率的影響較大.在料液比為1∶20 前，隨料液比增大洋蔥黃酮得率增加，當(dāng)料液比大于1∶20 后，得率增加緩慢，從節(jié)約成本和后續(xù)處理的方便考慮，選擇料液比(g/mL)為1∶20.

2.1.3 超聲波功率的影響(表3)

表3 超聲波功率對黃酮得率的影響Table 3 Effect of ultrasound power on flavonoids yield

由表3 可見，洋蔥黃酮得率隨超聲波功率的增大而增加，當(dāng)超聲波功率為320 W 時(shí)，洋蔥黃酮得率達(dá)到最大.但超聲波功率大于320 W，黃酮得率反而有所下降，其原因可能是超聲波功率過高，會(huì)導(dǎo)致黃酮降解和其他雜質(zhì)溶出增加.因此，試驗(yàn)選擇超聲波功率為320 W.

2.1.4 提取時(shí)間的影響(表4)

表4 提取時(shí)間對黃酮得率的影響Table 4 Effect of extracting time on flavonoids yield

由表4 可見，提取時(shí)間為30 min 時(shí)，洋蔥黃酮得率最大，此后得率下降.其原因可能是由于超聲波作用時(shí)間太長，會(huì)使洋蔥組織中大量細(xì)胞破裂，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)許多不溶物和黏液質(zhì)等進(jìn)入提取液，增大傳質(zhì)阻力，影響有效成分黃酮的溶出.因此試驗(yàn)選擇提取時(shí)間為30 min.

2.1.5 提取溫度的影響(表5)

表5 提取溫度對黃酮得率的影響Table 5 Effect of extracting temperature on flavonoids yield

由表5 可見，隨著超聲溫度的升高，洋蔥黃酮得率增加，但增加緩慢.其原因可能是溫度升高，分子運(yùn)動(dòng)速度加快，滲透擴(kuò)散也加快，利于黃酮類化合物溶出.從經(jīng)濟(jì)價(jià)值、操作方便等方面考慮，選擇超聲溫度為35 ℃.

2.2 洋蔥黃酮超聲波輔助提取的正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲波功率、料液比和提取時(shí)間為因素，選用L9（ 34）正交表進(jìn)行4 因素3 水平的正交試驗(yàn)，優(yōu)化超聲波輔助提取洋蔥黃酮的工藝條件，因素與水平設(shè)計(jì)見表6，試驗(yàn)結(jié)果見表7.

由表7 中極差R 直觀分析可知，影響洋蔥黃酮得率因素的大小順序依次為：乙醇體積分?jǐn)?shù)＞超聲波功率＞料液比＞提取時(shí)間，超聲輔助提取洋蔥黃酮的最佳提取工藝條件為A2B3C2D3，即乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，超聲波功率360 W，提取時(shí)間30 min，料液比(g/mL)為1∶25.

表6 因素與水平Table 6 Factors and levels of orthogonal test

表7 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 7 Results of orthogonal test

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

為了進(jìn)一步考察優(yōu)化工藝的可靠性和穩(wěn)定性，精確稱取2.0 g 洋蔥，在確定的優(yōu)化工藝條件下進(jìn)行3 次平行提取試驗(yàn)，測得洋蔥黃酮得率分別為1.18%、1.20%和1.23%，平 均 為1.20%，RSD 為2.13%.試驗(yàn)表明，此工藝穩(wěn)定、重現(xiàn)性好.

2.4 洋蔥黃酮清除DPPH·的能力

洋蔥黃酮與BHT 對DPPH·的清除率測定結(jié)果見圖1.由圖1 可知，洋蔥黃酮對DPPH·的清除率隨其質(zhì)量濃度的增加而增大，呈較好的量效關(guān)系.由圖1 求得洋蔥黃酮與BHT 清除DPPH·的IC50分別為8.5 μg/mL 和10.5 μg/mL.表明洋蔥黃酮清除DPPH·的能力明顯強(qiáng)于抗氧化劑BHT，即洋蔥黃酮具有較強(qiáng)的抗氧化活性.

2.5 洋蔥黃酮清除·OH 的能力

洋蔥黃酮與BHT 對·OH 的清除率測定結(jié)果見圖2.由圖2 可知，洋蔥黃酮對·OH 的清除率隨其質(zhì)量濃度的增加而增大，量效關(guān)系明顯.求得洋蔥黃酮與BHT 清除·OH 的IC50分別為11.8 μg/mL 和12.9 μg/mL.可見洋蔥黃酮清除·OH 的能力略強(qiáng)于BHT，也表明洋蔥黃酮具有較強(qiáng)的抗氧化活性.

圖1 洋蔥黃酮和BHT 對DPPH·的清除率Fig.1 Scavenging rate on DPPH·of flavonoids and BHT

圖2 洋蔥黃酮和BHT 對·OH 的清除率Fig.2 Scavenging rate on·OH of flavonoids and BHT

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過正交試驗(yàn)，確定了影響洋蔥黃酮得率的大小因素依次為：乙醇體積分?jǐn)?shù)＞超聲功率＞料液比＞提取時(shí)間，超聲波輔助提取洋蔥黃酮的最佳工藝條件為A2B3C2D3，即以體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇為提取劑，在35 ℃、料液比(g/mL)為1∶25、超聲功率360 W 的條件下，超聲波輔助提取30 min.在此條件下，洋蔥黃酮得率可達(dá)1.20%.洋蔥黃酮與BHT 清除DPPH·的IC50分別為8.5 μg/mL 和10.5 μg/mL；清除·OH 的IC50分別為11.8 μg/mL 和12.9 μg/mL，洋蔥黃酮對DPPH·和·OH的清除能力均強(qiáng)于BHT，表明洋蔥黃酮具有較強(qiáng)的抗氧化活性.

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