擠壓膨化麥仁輔料麥汁和啤酒中蛋白質(zhì)分析

張東亮，何媛媛，杜 菲，李宏軍

（山東理工大學(xué) 農(nóng)業(yè)工程與食品科學(xué)學(xué)院，山東 淄博 255049）

0 引言

麥仁是小麥脫去種皮后的籽仁，為全麥谷物顆粒，擠壓膨化后處理的麥仁能夠使淀粉分子發(fā)生重排、蛋白適度變性，將膨化后的麥仁用作啤酒釀制輔料，能明顯增加成品酒的出品率[1-2].小麥中谷蛋白和醇溶蛋白的含量占蛋白質(zhì)總量的80%～90%，將小麥用于啤酒釀造中，其高分子氮比例明顯提高，并對啤酒泡沫穩(wěn)定性有明顯改善作用[3-4].

泡沫的評價可分為起泡性、泡沫穩(wěn)定性和泡沫質(zhì)量3 個方面，而在這3 個泡沫性能中，泡沫穩(wěn)定性因使得消費者能最為直觀地評價啤酒的好壞而備受關(guān)注[5].國內(nèi)外研究者證實，蛋白質(zhì)對泡沫的穩(wěn)定性起非常重要的作用，其中分子質(zhì)量在15～40 ku 的高分子質(zhì)量蛋白是起主要穩(wěn)定作用的蛋白[6-9].另外蛋白質(zhì)是引起啤酒渾濁的主要因素之一，又是呈現(xiàn)口感、構(gòu)成泡沫、泡持性、掛杯等特性不可或缺的物質(zhì)，蛋白質(zhì)含量過低，會顯著降低啤酒的口感，影響啤酒泡沫的形成及其品質(zhì)；而蛋白質(zhì)含量過高，又可影響啤酒膠體溶液的非生物穩(wěn)定性[10].

在啤酒釀造過程中大分子蛋白質(zhì)的含量明顯減少，中分子蛋白質(zhì)的含量基本保持不變，而小分子蛋白質(zhì)含量所占比例明顯有所提高[11]，其中蛋白質(zhì)在制麥及糖化過程中的變化最顯著，其含量和分布均呈下降的趨勢[12].

應(yīng)用葡聚糖凝膠過濾色譜法對以擠壓膨化麥仁為輔料制得的麥汁及發(fā)酵后啤酒中蛋白質(zhì)組分進行分離，并利用Folin-酚法和SDS-PAGE 技術(shù)分別對分離出的麥仁麥汁和啤酒中的蛋白質(zhì)組分進行測定，得到麥仁麥汁和啤酒中蛋白質(zhì)的含量和分子質(zhì)量的分布范圍.

1 材料與方法

1.1 主要儀器

自制單螺桿擠壓機：自制，山東理工大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品精深加工中心；DWF-100 型電動植物粉碎機：河北省黃驊市科研器械廠；AuY-220 型電子分析天平：島津制作所試驗計測事業(yè)部；UV-1700 型紫外分光光度計：日本島津公司；722S 型分光光度計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；TGLl-16C 型臺式離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠；BSZ-100 型自動部分收集器、HL-2 型恒流泵：上海青浦滬西儀器廠；層析柱：2.6 mm×100 mm，上海滬西分析儀器廠；DYT-8C 型電泳儀、DYCZ-24DN 型電泳槽：北京六一儀器廠.

1.2 擠壓麥仁輔料啤酒麥汁制備

麥仁調(diào)整水分含量為20%，擠壓機套筒溫度為120 ℃，?？字睆? mm，螺桿轉(zhuǎn)速180 r/min，擠壓后粉碎作為輔料加入水及大麥芽制備麥汁，圖1為麥汁制備工藝流程.

圖1 麥汁制備過程Fig.1 Wort-making process

1.3 擠壓麥仁輔料啤酒發(fā)酵工藝

啤酒酵母麥汁中培養(yǎng)3 d，接入冷卻后的麥汁中（7 ℃），接種量為2 L/100 L 麥汁，發(fā)酵過程溫度控制見圖2，發(fā)酵完畢后過濾，并取樣檢測.

圖2 發(fā)酵過程溫度控制過程Fig.2 Temperature control of fermentation

1.4 G-75 葡聚糖凝膠層析

首先將麥汁和啤酒樣品在10 000 r·min-1的條件下離心20 min，然后以超聲波（20 kHz）進行30 min 脫氣處理.取處理后的樣品10 mL 上柱，用緩沖鹽（醋酸-醋酸鈉）溶液洗脫，溫度控制在室溫（18～20 ℃），流速為0.7 mL·min-1，每7.0 min 收集一管，即每管樣品體積為4.9 mL，麥汁和啤酒試樣各收集120 管，每個樣品平行測定3 次.為保證試驗結(jié)果的準確性，每個樣品分離完，在相同的條件下，用緩沖液沖洗柱子12 h，然后再進行下一個樣品的收集.將紫外分光光度計的波長設(shè)置在280 nm 處，測定每管洗脫后收集液的吸光度值，并繪制凝膠過濾色譜圖.

1.5 福林-酚法測定樣品中蛋白質(zhì)的含量

采用福林-酚法測定各分離組分中蛋白質(zhì)的含量[13]，并以下列公式計算樣品蛋白質(zhì)濃度.

1.6 SDS-PAGE 測定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量

上樣緩沖液10 mL 含2.5 mL 1 mol/L 的Tris-HCL（pH 6.8），1 g SDS，50 mg BPB，5 mL 甘油.麥汁過濾后，取2 mL，1:1 加入丙酮，5 000 r·min-1離心5 min，沉淀物加蒸餾水100 μL 溶解，以4∶1 的體積比加入上樣緩沖液，煮沸5 min.電泳采用垂直電泳法，分離膠和濃縮膠濃度分別為12%和5%.

2 結(jié)果與分析

2.1 G-75 葡聚糖凝膠層析

將低溫擠壓膨化麥仁輔料麥汁和啤酒中的蛋白質(zhì)和多肽組分在1.4 所述條件下進行凝膠色譜層析，繪制的色譜分離圖見圖3.

圖3 啤酒和麥汁中蛋白質(zhì)和多肽的凝膠色譜分離圖Fig.3 Gel chromatography of protein and polypeptide in beer and wort

從圖3 可以看出，麥汁和啤酒中均有兩個較顯著的峰，且峰形相似.出峰位置稍有不同，但基本一致，峰高和峰面積不同.兩種試樣均分離出3種組分，首先被層析分離出來的物質(zhì)為組分一，此組分為高分子質(zhì)量蛋白質(zhì)，因含有此組分的收集管數(shù)量較少，故兩種試樣中的高分子質(zhì)量蛋白質(zhì)含量較低.因組分三的峰值較為明顯，且組分三的成分為小分子質(zhì)量蛋白質(zhì)，兩種試樣中的小分子質(zhì)量蛋白質(zhì)含量較高.

2.2 Folin-酚法測定樣品中蛋白質(zhì)的含量

2.2.1 蛋白質(zhì)分離液收集

將上述相同組分試管中的收集液混合，因組分一和組分二中蛋白質(zhì)含量較低，所以將該兩種組分混合在一起，然后使用福林酚法測定混合液中蛋白質(zhì)含量.各混合液收集方法如表1 所示.

表1 蛋白質(zhì)收集方法Table 1 Collection method of protein

2.2.2 Folin-酚法標準曲線

以標準蛋白質(zhì)的含量（μg·mL-1）為橫坐標，以500 nm 處的吸光值為縱坐標繪制標準曲線，如圖4 所示，線性回歸方程是y=0.002 1x+0.006 6，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 9.說明蛋白質(zhì)濃度與500 nm 處的吸光值在溶液濃度為0～250 μg·mL-1范圍內(nèi)具有較好的線性相關(guān)性，所以此方法可以應(yīng)用于蛋白質(zhì)的定量分析.

圖4 福林-酚法標準曲線Fig.4 Standard line of foline-phenol

2.2.3 福林-酚法測定樣品中蛋白質(zhì)的含量

采用福林-酚法測定各分離組分中蛋白質(zhì)的含量，由于組分一、二混合液中蛋白質(zhì)的含量較低，將該混合液濃縮至1/10，測出組分一、二混合液及組分三的吸光度值，每個試樣平行測定3 次，然后根據(jù)標準曲線方程得出蛋白質(zhì)含量，在測定過程中適當稀釋樣品濃度，使稀釋后樣品中蛋白濃度在標準曲線范圍以內(nèi)，以提高精確度，結(jié)果如表2 所示.

表2 蛋白含量測定結(jié)果Table 2 Results of protein content

從表3 可以看出，麥仁麥汁中組分一、二的總蛋白質(zhì)含量為48 μg·mL-1，組分三的蛋白質(zhì)含量為6 842 μg·mL-1，則麥仁麥汁中的總蛋白質(zhì)含量為6 890 μg·mL-1；麥仁啤酒中組分一、二的總蛋白質(zhì)含量為67 μg·mL-1，組分三的蛋白質(zhì)含量為4 072 μg·mL-1，麥仁啤酒中總蛋白質(zhì)含量為4 139 μg·mL-1.

2.3 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量測定

聚丙烯酰胺凝膠電泳測定3 種組分的分子質(zhì)量范圍，結(jié)果如圖5 所示，A、B 條帶為麥汁，上樣量分別為10 μL 和5 μL；C、D 條帶為啤酒中蛋白，上樣量分別為10 μL 和5 μL；E、F 為標準蛋白，條帶E 為低分子質(zhì)量標準蛋白（分子質(zhì)量范圍120～20 ku），條帶F 為超低分子質(zhì)量標準蛋白（分子質(zhì)量范圍40～10 ku）.

圖5 樣品蛋白質(zhì)及標準蛋白電泳圖Fig.5 Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis（SDS-PAGE）of protein in sample and standard marker

用10 μL 上樣量的條帶與標準蛋白相比較，根據(jù)標準蛋白分子質(zhì)量和相對距離求出低溫擠壓膨化麥仁輔料麥汁及啤酒中蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量，采用Gelpro32 軟件對電泳圖中的條帶進行標記處理，得到標準蛋白條帶相對偏移距離（圖6）及樣品蛋白條帶相對偏移距離（圖7）.

圖6 標準蛋白條帶相對偏移距離Fig.6 Relative offset distance of protein marker

圖7 樣品蛋白條帶相對偏移距離Fig.7 Relative offset distance of protein in sample

以標準蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量的對數(shù)和相對遷移率[14]繪制標準曲線，將樣品蛋白質(zhì)的相對遷移率與得到的標準曲線相比較，求出樣品蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量.

以Gelpro analysis 分析圖6、圖7，可得出低溫擠壓膨化麥仁輔料啤酒麥汁中的蛋白質(zhì)和多肽分子質(zhì)量主要集中在8～18.4 ku（組分三）、31～36 ku（組分二）和37～45 ku（組分一）3 個范圍區(qū)間內(nèi)，其中分子質(zhì)量范圍在8～18.4 ku 的小分子質(zhì)量蛋白能導(dǎo)致啤酒渾濁，而較大分子質(zhì)量蛋白則有利于泡沫穩(wěn)定性.由于這三部分范圍區(qū)間之外還存在著部分顏色較淺的條帶，這說明麥汁還存在著介于這三部分之間且含量較少的蛋白質(zhì)和多肽組分.

3 結(jié)論

采用葡聚糖凝膠過濾色譜法對低溫擠壓膨化麥仁輔料所得麥汁和啤酒中的蛋白質(zhì)組分進行分離，結(jié)果表明：麥汁以及啤酒中蛋白質(zhì)的組成和分子質(zhì)量分布相似，都有兩個比較明顯的蛋白質(zhì)和多肽組分，且出峰位置相似，只是峰高和面積有所不同；采用福林酚法測定分離出的麥汁和啤酒中各組分的蛋白質(zhì)含量結(jié)果表明：麥仁麥汁中組分一、二的總蛋白質(zhì)含量為48 μg·mL-1，組分三的蛋白質(zhì)含量為6 842 μg·mL-1，則麥仁麥汁中的總蛋白質(zhì)含量為6 890 μg·mL-1；麥仁啤酒中組分一、二的總蛋白質(zhì)含量為67 μg·mL-1，組分三的蛋白質(zhì)含量為4 072 μg·mL-1，則麥仁啤酒中總蛋白質(zhì)含量為4 139 μg·mL-1.采用SDS-PAGE 技術(shù)測定麥汁和啤酒中蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量，結(jié)果表明：擠壓膨化麥仁輔料啤酒及麥汁中的蛋白質(zhì)和多肽分子質(zhì)量主要集中在8～18.4 ku、31～36 ku 和37～45 ku 3 個區(qū)間內(nèi).在這3 部分之間還存在著顏色較淺的條帶，這說明麥汁中還存在著分子質(zhì)量介于這3部分之間且含量較少的蛋白質(zhì)和多肽組分.

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