胸水p16基因純合性缺失的檢測(cè)及臨床應(yīng)用價(jià)值

于薇

[摘要] 目的 探討胸水p16基因純合性缺失的檢測(cè)及其在臨床上的應(yīng)用價(jià)值。方法 選取該院2010年12月—2014年6月收治的伴有胸水的肺癌患者176例，隨機(jī)分為對(duì)照組和PCR組各88例，對(duì)照組應(yīng)用胸水脫落細(xì)胞學(xué)檢測(cè)，PCR組應(yīng)用PCR技術(shù)檢測(cè)純合性缺失，比較陽(yáng)性率。 結(jié)果對(duì)照組88例肺癌所致癌性胸水患者的標(biāo)本中有52例出現(xiàn)胸水脫落細(xì)胞血陽(yáng)性結(jié)果，其陽(yáng)性率為59.09%；PCR組88例肺癌所致癌性胸水患者的標(biāo)本中沒(méi)有出現(xiàn)一例p16基因第一外顯子純合性缺失，但是有35例p16基因第二外顯子純合性缺失，其陽(yáng)性率為39.77%。陽(yáng)性對(duì)照組優(yōu)于PCR組，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論 將p16基因作為肺癌治療的靶基因具有可行性，同時(shí)胸水p16基因純合性缺失的檢測(cè)方法不僅方便，而且準(zhǔn)確率高，可以作為癌癥檢測(cè)和預(yù)后的重要輔助手段，為廣大的肺癌患者帶來(lái)福音，值得臨床推廣。

[關(guān)鍵詞] 胸水；p16基因；純合性缺失；檢測(cè)；應(yīng)用價(jià)值

[中圖分類號(hào)] R [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-0742（2014）12（c）-0034-02

肺癌是治愈率低和致死率高的呼吸系統(tǒng)腫瘤疾病，其發(fā)病率和死亡率逐年急劇上升且具有性別差異，對(duì)人類生命健康造成嚴(yán)重威脅。肺癌的發(fā)病原因主要是吸煙、電離輻射、職業(yè)與環(huán)境接觸、大氣污染、遺傳因素和既往肺部慢性感染。其臨床表現(xiàn)主要包括局部癥狀、全身癥狀、肺外癥狀、侵潤(rùn)和轉(zhuǎn)移癥狀，其中局部癥狀有咳嗽、胸痛、胸悶、氣急、咯血和聲音嘶啞，而咳嗽是最常見的局部癥狀，也是肺癌的首發(fā)癥狀[1]。由于缺乏有效的早期診斷方法，40%以上的患者在診斷時(shí)病灶已發(fā)生轉(zhuǎn)移，經(jīng)過(guò)傳統(tǒng)的治療方法效果也差強(qiáng)人意，尤其是小細(xì)胞肺癌患者5年生存率不足5%[2]。因此，如何對(duì)伴有胸水的肺癌患者進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)，成為了醫(yī)學(xué)熱點(diǎn)。p16基因又稱為MTS1基因，于1994年被Kamb等發(fā)現(xiàn)的一種新的抗癌基因，它是細(xì)胞周期中的一種基本基因，其作用是直接參與細(xì)胞周期的調(diào)控，對(duì)細(xì)胞增殖和分裂進(jìn)行負(fù)調(diào)節(jié)[3]。目前，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)有細(xì)胞周期剎車裝置之稱的p16基因，在人類腫瘤細(xì)胞中出現(xiàn)純合性缺失的現(xiàn)象，同時(shí)經(jīng)臨床研究證實(shí)很多癌癥的形成都與p16基因的缺失和突變有關(guān)[4]。因此，對(duì)p16基因進(jìn)行純合性缺失的檢測(cè)具有重要的臨床意義。將該院2010年12月—2014年6月收治的患者為研究對(duì)象，采用胸水p16基因純合性缺失的檢測(cè)肺癌收到了較好的效果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

將該院收治的伴有胸水的肺癌患者176例，隨機(jī)分為兩組，其中對(duì)照組88例，男61例，女27例，年齡41～75歲，平均年齡58歲；PCR組88例，男62例，女26例；年齡42～74歲，平均年齡58歲。兩組在年齡和性別方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。

1.2 治療方法

1.2.1 對(duì)照組 在征得患者同意的情況下，對(duì)患者的穿刺部位通過(guò)超聲定位后，協(xié)助患者采取合適的體位，局部消毒和麻醉后，進(jìn)行常規(guī)的胸腔穿刺。其具體步驟如下：用左手食指和中指將穿刺部位的皮膚固定，右手調(diào)整穿刺針的三通活栓裝置，使其與胸腔處于關(guān)閉狀態(tài)后，在麻醉處將穿刺針緩緩刺入，若針鋒的抵抗感突然消失時(shí)，則調(diào)整三通活栓使其與胸腔相通，進(jìn)行抽取胸水，抽取結(jié)束方可拔出穿刺針。取出一定量的胸水后，進(jìn)行胸水脫落細(xì)胞學(xué)檢測(cè)，其檢測(cè)步驟如下：離心、制片、干燥、染色，其中染色尤為重要，若染色較深，則背景會(huì)影響判斷；若染色較淺，則不易看出細(xì)胞的形態(tài)。染色后，將固定好的片子放在顯微鏡下觀察，檢測(cè)細(xì)胞學(xué)變化，進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.2 PCR組 胸水采集的方法與對(duì)照組一致，取患者的一定量（10 mL）的胸水后，離心（3 000轉(zhuǎn)/min，10 min），沉淀物加生理鹽水混懸后，再加DNA提取液和相關(guān)試劑逐步提取和純化DNA模板。在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，要加入PCR試劑，其中PCR的五種關(guān)鍵要素是p16第一外顯子和第二外顯子引物、dNTP、Taq酶、Mg2+和模板，放入PCR儀中擴(kuò)增，其PCR條件是預(yù)變性94℃、5 min后，變性94℃、30 s，復(fù)性55℃、30 s，延伸72℃、30 s，將變性、復(fù)性和延伸循環(huán)30次后，再延伸70℃、5 min，最后4℃保存產(chǎn)品。配制2%的瓊脂糖凝膠，用水平電泳儀進(jìn)行電泳40 min后，紫外下掃描照相后，檢測(cè)吸光度值，進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

應(yīng)用SPSS11.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料用率表示，行χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

兩組數(shù)據(jù)比較，陽(yáng)性率行χ2檢驗(yàn)，χ2 =6.17，P=0.034，P<0.05，說(shuō)明經(jīng)處理差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

表1 對(duì)照組與PCR組檢測(cè)結(jié)果對(duì)比[n（%）]

3 討論

肺癌是發(fā)病率較高的呼吸系統(tǒng)腫瘤疾病，其發(fā)病率和死亡率逐年急劇上升，并且該病的發(fā)病率和死亡率具有性別差異，其中男性患者的發(fā)病率和死亡率位居惡性腫瘤的榜首，女性患者的發(fā)病率和死亡率位居惡性腫瘤的第二位[5]，但具有較低治愈率和較高致死率的特點(diǎn)，對(duì)人類生命健康造成嚴(yán)重威脅。目前，肺癌的發(fā)病原因還沒(méi)有得到明確闡述，有大量研究資料表明[6]：該病可能與吸煙、環(huán)境有重大聯(lián)系，其中不吸煙的肺癌患者占吸煙肺癌患者的1/10～1/20，并且年齡越小就開始吸煙越容易患有肺癌，城市居民患有肺癌的幾率比農(nóng)村的患者高，其主要原因是城市大氣污染要比農(nóng)村更為嚴(yán)重。肺癌的發(fā)病原因主要是吸煙、電離輻射、職業(yè)與環(huán)境接觸、大氣污染、遺傳因素和既往肺部慢性感染，其中吸煙是最嚴(yán)重的肺癌高危因素，而職業(yè)癌是常見的肺癌疾病。肺癌具有直接擴(kuò)散、血行轉(zhuǎn)移和淋巴道轉(zhuǎn)移三種播散轉(zhuǎn)移方式，其中淋巴道轉(zhuǎn)移是最常見的肺癌轉(zhuǎn)移方式。肺癌的臨床表現(xiàn)主要包括局部癥狀、全身癥狀、肺外癥狀、侵潤(rùn)和轉(zhuǎn)移癥狀，其中局部癥狀有咳嗽、胸痛、胸悶、氣急、咯血和聲音嘶啞，而咳嗽是最常見的局部癥狀，也是肺癌的首發(fā)癥狀。p16基因又稱為MTS1基因，于1994年被Kamb等發(fā)現(xiàn)的一種新的抗癌基因，它是細(xì)胞周期中的一種基本基因，其作用是直接參與細(xì)胞周期的調(diào)控，對(duì)細(xì)胞增殖和分裂進(jìn)行負(fù)調(diào)節(jié)[7]。目前，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)人類腫瘤細(xì)胞的p16基因有一半會(huì)發(fā)生純合性缺失和突變，因此被稱為細(xì)胞周期的剎車裝置，一旦失靈，則細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)惡性增殖，最終導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生[8]。近幾年，臨床研究發(fā)現(xiàn)，在肺癌、乳腺癌、骨腫瘤、皮膚癌、膀胱癌、腦腫瘤、腎癌、卵巢癌和淋巴瘤等癌細(xì)胞中p16基因出現(xiàn)純合性缺失和突變等現(xiàn)象，證明了p16基因通過(guò)缺失和突變的形式，參與了腫瘤的形成。因此在腫瘤患者的易感性和預(yù)后方面，對(duì)p16基因進(jìn)行純合性缺失的檢測(cè)具有重要的臨床意義[9-11]。由于胸水收集方便，該院將肺癌所致胸膜轉(zhuǎn)移后的胸水標(biāo)本作為研究對(duì)象，結(jié)果表明，PCR組88例肺癌所致癌性胸水患者的標(biāo)本中沒(méi)有出現(xiàn)1例p16基因第一外顯子純合性缺失，但是有35例p16基因第二外顯子純合性缺失，其陽(yáng)性率為39.77%；對(duì)照組88例肺癌所致癌性胸水患者的標(biāo)本中有52例出現(xiàn)胸水脫落細(xì)胞血陽(yáng)性結(jié)果，其陽(yáng)性率為59.09%。胸水細(xì)胞學(xué)檢測(cè)是一種特異性檢查手段，病理狀態(tài)下，在胸水形成的同時(shí)，胸膜間皮細(xì)胞和惡性腫瘤細(xì)胞都會(huì)脫落至胸水中，因此可以通過(guò)胸水脫落細(xì)胞學(xué)的檢測(cè)來(lái)診斷疾病。p16基因的編碼蛋白是細(xì)胞周期素D和依賴性激酶的特異性抑制劑，其抑制腫瘤的機(jī)制是通過(guò)抑制細(xì)胞周期進(jìn)程而抑制細(xì)胞增殖[12-13]。絕大多數(shù)腫瘤中存在p16 基因的缺失或突變，并且純合性缺失發(fā)生的頻率更高，而且主要發(fā)生于第二外顯子上，經(jīng)葉玉坤等研究發(fā)現(xiàn)在肺癌組織p16 基因的表達(dá)率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于癌組織旁邊的正常組織和良性腫瘤的表達(dá)率，且表達(dá)率的高低與臨床分期密切相關(guān)，尤其是在Ⅰ期和Ⅱ期肺癌中，p16 基因的純合性缺失率達(dá)到30%以上，并且是非小細(xì)胞肺癌[3]。因此，將p16基因作為肺癌治療的靶基因具有可行性，同時(shí)胸水p16基因純合性缺失的檢測(cè)方法不僅方便，而且準(zhǔn)確率高，可以作為癌癥檢測(cè)和預(yù)后的重要輔助手段，值得臨床推廣。endprint

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（收稿日期：2014-11-24）endprint