南京辣椒上一種斑駁類型病毒病的分子鑒定

吳淑華， 趙文浩，2， 李廷芳，3， 程兆榜， 潘寶貴， 郭青云， 王述彬， 季英華，周益軍

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，江蘇 南京 210014;2.南京農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，江蘇 南京 210014;3.青海大學農(nóng)牧學院，青海 西寧 810016;4.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所，江蘇 南京 210014;5.青海省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，青海 西寧 810016)

辣椒是中國重要的蔬菜作物，常年栽培面積為1.33×106hm2，在蔬菜的周年供應中起著重要的作用。由于辣椒種植面積廣，栽培品種多，辣椒上的病毒種類也很多，國外報道至少有45種病毒可以侵染辣椒引起危害［1］，中國早前有報道的病毒包括煙草花葉病毒(TMV)、黃瓜花葉病毒(CMV)、馬鈴薯Y病毒(PVY)、馬鈴薯X病毒(PVX)、煙草蝕紋病毒(TEV)、苜?；ㄈ~病毒(AMV)、蠶豆萎蔫病毒(BBWV)和煙草脆裂病毒(TRV)等，其中以TMV和CMV最為普遍［2］。2013年姚玉榮等［3］對廣東、海南等地的辣椒病毒病進行調查時發(fā)現(xiàn)當?shù)氐牟《疽渣S瓜花葉病毒和辣椒輕斑駁病毒(PMMoV)為主，伴有少量的馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯X病毒等。

江蘇省辣椒常年栽培面積在8.00×104hm2以上，特別是近年來隨著設施栽培技術的推廣，辣椒的種植面積也在不斷擴大，隨之也出現(xiàn)了一些新的病毒病。2014年6-11月，我們在對江蘇省南京市辣椒作物上的病毒病進行調查時發(fā)現(xiàn)，一種葉片表現(xiàn)斑駁癥狀的辣椒病毒病在田間非常常見，危害也相對較為嚴重，對此我們對其進行分子診斷。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試病毒樣品 辣椒病樣為2014年6-11月采自江蘇省南京市表現(xiàn)出斑駁癥狀的辣椒葉片，樣品采集后保存于-70℃冰箱，對照為防蟲溫室里培育的健康辣椒苗葉片。

1.1.2 試劑 Trizol Reagent購自北京康為世紀生物技術有限公司，反轉錄試劑盒PrimerScriptTMRTMaster Mix和DNA LA Taq酶購自寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa)，氯仿、異戊醇等其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。吸頭、離心管等用0.1%DEPC水浸泡過夜后，高壓滅菌。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 根據(jù)已報道煙草花葉病毒屬(Tobamovirus)成員的序列，分別設計3對引物:煙草花葉病毒屬簡并引物Tob-Uni1(5′-ATTTAAGTGGASGGAAAAVCACT-3′)和Tob-Uni2(5′-GTYGTTGATGAGTTCRTGGA-3′)，擴增病毒外殼蛋白基因及部分運動蛋白基因，目的片段約800 bp［4］;煙草花葉病毒特異引物TMV-F(5′-TTCTTGTCATCAGCGTGGGCCGA-3′)和 TMV-R(5′-AAGTTGCAGGACCAGAGGTCCA-3′)，擴增病毒外殼蛋白基因，目的片段約440 bp［5］;辣椒輕斑駁病毒特異引物PMMoV-F (5′-AGAACTCGGAGTCATCGGC-3′)和 PMMoV-R (5′-GAGTTATCGTACTCGCCACG-3′)，擴增病毒外殼蛋白基因，目的片段約580 bp［6］，分別用于煙草花葉病毒屬成員的檢測及TMV和PMMoV的特異性檢測。引物委托英濰捷(上海)貿(mào)易有限公司合成。

1.2.2 病毒RNA的提取 取0.05～0.10 g病葉于已滅菌的2 ml進口離心管中，加液氮迅速充分研磨成粉狀，加入1 ml Trizol Reagent混合，室溫放置5 min。加200 μ氯仿、異戊醇混合液(氯仿∶異戊醇=24∶1，體積比)，手搖劇烈震蕩15 s，室溫放置2～3 min后，4℃12 000 r/min離心15 min。取上清液至1.5 ml離心管中，加等體積的冰異丙醇，混勻，-20℃冰箱放置20 min以上。4℃12 000 r/min離心10 min后棄上清液，用l ml 75%乙醇(0.1% DEPC水配制)洗沉淀2次，每次洗滌后4℃ 5 000 r/min離心5 min。棄上清液，超凈臺中風干，將RNA溶于35 μl 0.1%DEPC水中，檢測RNA的含量和質量后，-20℃保存?zhèn)溆?，同時提取健康辣椒葉片總RNA作為陰性對照。

1.2.3 病毒RT-PCR檢測 cDNA合成:以提純總RNA為模板，用PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒反轉錄合成病毒的cDNA第1條鏈。RT反應體系:在10 μl反轉錄反應體系中，PCR管中加入5×PrimeScriptTMRT Master Mix buffer 2 μl，加入含500 ng體積的RNA，用RNase Free超純水補足到10 μl。輕輕混合，37℃15 min，85℃5 s，反應結束后，將反轉錄產(chǎn)物-20℃冰箱中保存。

PCR的擴增體系:在25 μl PCR反應體系中，加入10×Buffer 2.5 μl，MgCl21.5 μl，dNTP2.0 μl，cDNA產(chǎn)物1 μl，特異性上下游引物各1 μl，超純水15.8 μl，LA Taq酶0.2 μl。PCR反應過程為95℃預變性5 min;95℃變性45 s，49℃(Tob-Uni1/Tob-Uni2)或59℃(TMV-F/TMV-R)或54℃(PMMoVF/PMMoV-R)退火45 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。擴增結束后，取5 μl PCR產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠電泳中檢測擴增產(chǎn)物，并用培清JS-680D全自動凝膠成像系統(tǒng)記錄結果。

1.2.4 序列測定及分析 序列測定委托金斯瑞生物技術有限公司完成，序列分析使用DNAstar軟件及 NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ BLAST/Blast.cgi)上的BLAST程序進行，系統(tǒng)進化分析使用MEGA6完成。

2 結果與分析

2.1 病害田間調查

2014年6-11月，我們在對江蘇省南京地區(qū)的辣椒病毒病進行調查時發(fā)現(xiàn)一種斑駁類型的病毒病在辣椒上非常常見，特別是在管理粗放的田塊，該病的發(fā)病率較高。該病在辣椒上主要表現(xiàn)為葉片不規(guī)則褪綠，伴有黃綠相間的斑駁、葉面凹凸不平、皺縮，有時葉緣上卷(圖1)，早期發(fā)病的植株常常伴有矮縮癥狀，對果實產(chǎn)量影響較大，有些辣椒品種的果實上也出現(xiàn)褪綠的斑駁，對果實的品質產(chǎn)生影響。

2.2 煙草花葉病毒屬病毒檢測

在辣椒上煙草花葉病毒屬(Tobamovirus)病毒感染常常造成葉片斑駁花葉等癥狀，為明確2014年南京采集的樣品中是否有Tobamovirus感染，我們對采集到的病樣用煙草花葉病毒屬簡并引物Tob-Uni1和Tob-Uni2進行RT-PCR檢測，結果有61份樣品擴增到804 bp的預期目的片段(部分樣品檢測結果見圖2)，表明南京地區(qū)2014年采集到的辣椒病樣中含有煙草花葉病毒屬病毒。

圖1 感病辣椒樣品與健康辣椒樣品的對比Fig.1 Comparison of healthy pepper sample and virus-infected pepper sample

2.3 擴增片段的序列測定及分析

為了明確南京辣椒樣品上煙草花葉病毒屬(Tobamovirus)的病毒類型，我們隨機抽選5份樣品進行序列測定并進行同源性分析，發(fā)現(xiàn)它們同源性非常高(＞99.1%)，說明它們可能是同一分離物。序列BLAST分析結果顯示其與辣椒輕斑駁病毒(PMMoV)的同源性最高(＞98.3%)，暗示其可能是PMMoV的分離物。將本試驗測定序列與Tobamovirus代表性成員(表1)及目前已測定基因組序列的PMMoV各分離物(表2)利用MEGA6比對后進行聚類分析，使用臨近法(Neighbor-Joining，NJ)、Kimura 2-parameter模型重建系統(tǒng)進化樹(圖3)，各個分枝的Bootstrap置信度用1 000次自導復制來評價。

圖2 用引物Tob-Uni1/Tob-Uni2得到的PCR檢測結果Fig.2 Detection of pepper samples by PCR with Tob-Uni1/Tob-Uni2

由圖3可以看出，PMMoV分離物可以分為3簇:西班牙Ia株系單獨成為第1簇(Cluster I)，韓國Kr株系、日本 Iw和日本 L4BV株系聚于第2簇(Cluster II);日本C-1421株系、日本J株系、日本TPO-2-19株系、日本Pa18株系、西班牙S株系、中國CN株系、巴西BR-DF01株系及印度HP1株系聚于第3簇(Cluster III)。江蘇南京2014年辣椒上檢測到的5個分離物分別聚類于第2簇及第3簇，其中NJ14-C11-Tob-1、NJ14-G07-Tob-2、NJ14-G03-Tob-1和NJ14-G08-Tob-2與日本的Iw、L4BV株系及韓國的Kr株系的同源關系較近，共同聚類于第2簇; NJ14-F02-P1與印度的HP1株系及巴西的BR-DF01株系同源關系較近，共同聚類于第3簇。表明2014年江蘇南京地區(qū)辣椒上分離到的煙草花葉病毒屬成員為辣椒輕斑駁病毒。

表1 本試驗中所涉及的煙草花葉病毒屬病毒序列信息Table 1 Information of Tobamovirus

表2 本試驗中所涉及的辣椒輕斑駁病毒(PMMoV)信息Table 2 Information of pepper mild mottle virus(PMMoV)

圖3 根據(jù)病毒核苷酸序列一致性構建的系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree based on nucleotide sequences identities of Tobamovirus

2.4 PMMoV/TMV檢測

利用辣椒輕型斑駁病毒的特異性引物PMMoVF和PMMoV-R對田間采集的70份辣椒病樣進行RT-PCR檢測，結果61份擴增出大小576 bp的預期目的片段，檢測結果同簡并引物Tob-Uni1和Tob-Uni2的RT-PCR檢測結果一致(部分樣品檢測結果見圖4)。對其中代表性樣品PCR產(chǎn)物進行序列測定，BLAST序列分析結果顯示，其序列與PMMoV有最高的同源性(98%～99%)，表明檢測到的病毒為辣椒輕斑駁病毒。

鑒于該病的癥狀表現(xiàn)主要為斑駁花葉，在中國早期的研究中發(fā)現(xiàn)煙草花葉病毒屬典型成員——煙草花葉病毒是侵染辣椒導致辣椒病毒病的重要病原，我們也對田間采集的70份病樣用煙草花葉病毒的特異引物TMV-F和TMV-R進行RT-PCR檢測，結果都沒有擴增到目的條帶，確定樣品沒有感染TMV。

圖4 引物PMMoV-F/PMMoV-R的PCR檢測結果Fig.4 Detection of pepper samples by PCR with PMMoV-F/PMMoV-R

3 討論

辣椒輕斑駁病毒(PMMoV)為煙草花葉病毒屬(Tobamovirus)的(+)ssRNA病毒，最早在美國發(fā)現(xiàn)［7］，其后在德國、荷蘭、英國、西班牙、保加利亞、匈牙利、加拿大、澳大利亞、阿根廷等國均有報道，給辣椒生產(chǎn)造成嚴重的危害［8］。1994年，中國在新疆辣椒上首次發(fā)現(xiàn)該病毒，目前此病毒已蔓延至海南省等地區(qū)［3，9-15］。該病毒可以通過種子、植株摩擦汁液傳毒，在干燥的植物病殘體上可存活25年，帶毒的種子、感病植株和病土是重要的侵染來源［15-16］，通過國外種子的引入和種質資源的頻繁交流，PMMoV不斷蔓延，并且已經(jīng)在一些地區(qū)上升為優(yōu)勢病毒種類［3，15］，成為溫室和大棚辣椒的重要致病病原之一［1］，因此在生產(chǎn)上要密切監(jiān)測該病毒引起的危害情況，加強種子檢疫和脫毒處理，及時控制該病毒的蔓延與擴散。

1986年報道南京郊區(qū)辣椒病毒病原主要為TMV、CMV，次要為PYV、PVX［17］，1995報道中國六省市辣(甜)椒病毒種群及其分布的研究中，江蘇的病原主要為TMV、CMV，次要為PYV、PVX、TRV和BBWV［2］，隨后辣椒病毒病病原的演變情況沒有查到相關的報道。隨著栽培技術的進步，環(huán)境的變化，種子資源的交流，病毒的種類也會隨之變化。2014年，我們對南京地區(qū)采集的70份辣椒病樣的檢測結果顯示，61份樣品中檢出PMMoV(87.14%)，暗示了PMMoV已逐漸成為南京地區(qū)辣椒病毒病(斑駁癥狀)的主要伴隨病毒，之前辣椒上的優(yōu)勢病毒TMV反而未檢測到，鑒于該病毒近年來在中國的發(fā)生危害逐漸蔓延，生產(chǎn)上應當特別關注。對于本研究中未檢測到PMMoV的9份病樣，因其田間也表現(xiàn)斑駁等癥狀，推測可能由其他病原侵染引起。

在對江蘇南京地區(qū)2014年分離到的PMMoV分離物進行序列分析時發(fā)現(xiàn)雖然他們有較高的序列同源性，但是他們分別聚于不同的簇，因此他們有可能屬于不同的類型，而且5個分離物中除NJ14-F02-P外，其他4個在系統(tǒng)進化樹上與中國之前報道的北京分離物親緣關系也相對較遠，反而與韓國、日本等地分離物的親緣關系較近，暗示了南京地區(qū)PMMoV的來源可能比較復雜。同時由于辣椒上的病毒病種類比較復雜，因此生產(chǎn)上不排除有復合侵染的可能，我們對一些常見病毒的檢測中也發(fā)現(xiàn)復合侵染的現(xiàn)象，因此要明確辣椒上的病毒病種類需要更大范圍的樣品普查及多種類型病毒的系統(tǒng)調查。

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