擬南芥抗根結(jié)線蟲和蚜蟲的功能基因鑒定

陳 曦， 馮 輝， 張金鳳， 盧小雪， 陳懷谷， 魏利輝

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所，江蘇 南京 210014)

根結(jié)線蟲和蚜蟲的寄主范圍廣泛，經(jīng)常同時出現(xiàn)，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大危害。根結(jié)線蟲寄生根系導(dǎo)致根系出現(xiàn)根結(jié)甚至根瘤，根組織的運輸系統(tǒng)被破壞，水分和養(yǎng)分的輸送嚴(yán)重受阻，植株枝葉生長緩慢萎縮黃化［1-2］;蚜蟲取食莖葉損耗光合作用產(chǎn)生的營養(yǎng)物質(zhì)，蚜蟲分泌的蜜露附著葉片表面滋生真菌病害［3-4］。最經(jīng)濟有效的病蟲害防治方法是培育使用抗性品種，而鑒定出參與植株抗病蟲害的功能基因是先決條件。

目前，從番茄中鑒定到的Mi基因是唯一同時對根結(jié)線蟲和蚜蟲產(chǎn)生抗性的基因［5］。通過將根結(jié)線蟲抗性番茄品系與感病栽培品系雜交構(gòu)建出多個作圖群體，利用分子標(biāo)記技術(shù)結(jié)合圖位克隆技術(shù)逐步分離鑒定出根結(jié)線蟲抗性基因Mi［6-8］。在隨后篩選番茄對蚜蟲抗性的試驗中發(fā)現(xiàn)凡是攜帶Mi基因的番茄品系都表現(xiàn)出對蚜蟲的抗性，由此將Mi基因介導(dǎo)的抗性作用范圍拓展到刺吸式口器昆蟲［9］。Mi基因產(chǎn)生的對根結(jié)線蟲的抗性反應(yīng)是在線蟲入侵位點出現(xiàn)局部細胞死亡，即超敏反應(yīng)，從而限制線蟲進一步入侵或遷徙。超敏反應(yīng)很可能由持續(xù)過量積累的過氧化物(Reactive oxygen species，ROS)導(dǎo)致［9］。Mi基因?qū)ρ料x的抗性作用不出現(xiàn)超敏反應(yīng)，而是限制蚜蟲在韌皮部的取食［10］。

在隨后的研究中，若干參與Mi基因抗性反應(yīng)通路中的其他因子陸續(xù)被發(fā)掘出來。例如，研究人員通過篩選攜帶Mi基因卻又喪失抗性的番茄突變體鑒定出Rme1基因［11］;Bhattarai等通過分析抗性反應(yīng)通路通用原件獲得Hsp90和Sgt1基因［12］;此外，研究者通過比較攜帶和不攜帶Mi基因的番茄在根結(jié)線蟲侵染后表達譜的差異鑒定出轉(zhuǎn)錄因子WRKY家族成員［13-14］，以及通過篩選超敏反應(yīng)抑制子分離出番茄SERK基因家族［15］。然而，Mi基因介導(dǎo)的抗性對溫度敏感，在高于28℃條件下抗性水平顯著降低［16］，嚴(yán)重制約了Mi基因及其通路中抗性因子的作用。因此，迫切需要通過其他策略來鑒定抗根結(jié)線蟲和蚜蟲的功能基因。

擬南芥具有豐富的突變體資源，測序完成的基因組和完備的基因注釋數(shù)據(jù)庫，是篩選根結(jié)線蟲和蚜蟲抗性以及鑒定功能基因的理想材料。擬南芥激活標(biāo)簽突變體包含可以隨機插入基因組的標(biāo)簽，標(biāo)簽上攜帶的增強子可以激發(fā)插入位點上下游基因過量表達，從而使植株出現(xiàn)在基因正常表達水平下體現(xiàn)不出來的表型［17］。我們在前期的研究中從這類突變體庫中成功篩選到9個抗蚜蟲的突變體［18］，本研究擬進一步鑒定這些突變體對根結(jié)線蟲的抗性，采用分子生物學(xué)和遺傳學(xué)手段鑒定擬南芥抗根結(jié)線蟲和蚜蟲的關(guān)鍵基因。

1 材料與方法

1.1 擬南芥的種植

擬南芥種植在裝有蛭石的穴盤中，穴孔大小為40 mm×40 mm×55 mm，每穴種植1棵植株。生長條件:24℃，光照度180 μmol/(m2·s)，16 h光照/8 h黑暗。擬南芥發(fā)芽后28 d用于試驗，試驗前用剪刀將穴盤分離成獨立的穴孔。

1.2 抗根結(jié)線蟲試驗和抗蚜蟲試驗

試驗用根結(jié)線蟲為南方根結(jié)線蟲，用感病番茄培養(yǎng)保存。取接種后56 d的番茄根組織，用水輕輕沖洗，從根系表面挑取新鮮卵塊，用0.5%次氯酸鈉消毒3 min，用無菌水沖洗3次，室溫(24℃左右)下置于貝曼漏斗中，每天收集孵化的二齡幼蟲，4℃保存待用。試驗前，將二齡幼蟲懸液以2 500 r/min離心3 min棄大部分上清混勻，取3滴蟲懸液于計數(shù)板上，在顯微鏡下計數(shù)，取平均值計算蟲口密度，加入適量滅菌水調(diào)節(jié)至1 ml蟲懸液含250頭二齡幼蟲。用移液器將1 ml二齡幼蟲懸液接種在穴孔一半深度的擬南芥根系周圍。接種后7 d用細水流將根系從蛭石中洗脫，用酸性品紅染色法檢測入侵擬南芥根系的線蟲數(shù)量［19］。

試驗用蚜蟲為桃蚜，在白菜上飼養(yǎng)保存。試驗前將一片離體白菜葉鋪在放有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，用細毛筆將蚜蟲成蟲轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中的白菜葉上，次日，將新生的蚜蟲用細毛筆轉(zhuǎn)移到擬南芥葉片上，14 d后記錄植株上蚜蟲數(shù)量。試驗期間將每棵植株置于小培養(yǎng)皿上，放在盛有水的托盤中，以避免蚜蟲在株系之間移動。

新生蚜蟲在離體白菜上飼養(yǎng)6 d后用于刺探電位圖譜試驗，飼養(yǎng)過程中每2 d更新1次菜葉。用水溶性導(dǎo)電銀膠將直徑約10 μm的金絲粘在蚜蟲前胸背板上形成蚜蟲電極，將植物電極插入植株生長的蛭石中(保持蛭石濕潤)。將蚜蟲電極和植物電極接入生物電流放大器。每棵植株上放置1只蚜蟲，連續(xù)監(jiān)測8 h。產(chǎn)生的刺吸電位圖譜(EPG)數(shù)據(jù)用PROBE3.0軟件分析以區(qū)分各種波形。Np波表示非刺探，C波表示穿刺，E1波表示韌皮部水溶性唾液分泌，E2波表示韌皮部被動吸食，F(xiàn)波表示遭受物理阻力，G波表示在木質(zhì)部主動吸食汁液。

以上試驗中，每個擬南芥株系檢測15棵植株，采用SPSS19軟件獨立樣本t檢驗或Mann-Whitney U測試進行差異顯著性分析。

1.3 反向PCR

采用CTAB法提取擬南芥DNA，用限制性內(nèi)切酶RcoR I(TaKaRa公司產(chǎn)品)處理提取的DNA，以T4連接酶(TaKaRa公司產(chǎn)品)處理酶切產(chǎn)物。以5 μl連接產(chǎn)物為模板用于反向PCR。PCR反應(yīng)體系為50.0 μl:ddH2O 24.6 μl，5×Buffer 10.0 μl，2 mmol/L dNTP 5.0 μl，10 μmol/L引物各2.5 μl，Phusion聚合酶(Finnzymes)0.4 μl。擴增反應(yīng)條件是: 98℃ 30 s;98℃10 s，64℃10 s，72℃3 min，35個循環(huán);72℃10 min，保持12℃。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分離后連接到pMD18-T載體，涂板轉(zhuǎn)化后挑選陽性克隆進行測序。將測序結(jié)果中激活標(biāo)簽旁側(cè)序列與擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫進行比對。本研究所用引物見表1。

表1 試驗中使用的引物Table 1 Primers used in this study

1.4 熒光定量PCR

用于熒光定量PCR檢測的每個株系有3個生物學(xué)重復(fù)的樣品，每個樣品由15棵植株混合而成。采用 TRIzol法提取植株的總 RNA，經(jīng) DNA酶(DNase I，Promega)消化處理后，利用MMLV Reverse Transcriptase試劑盒(Promega)將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并經(jīng)RNase H(TaKaRa公司)處理，-20℃保存待用。以稀釋20倍的cDNA作為實時定量PCR的模板。按照SYBR Premix Ex Taq TM II (TaKaRa公司)說明書，利用iCycleriQ(Bio-Rad)進行實時熒光定量PCR反應(yīng)。每個樣品做2個重復(fù)。反應(yīng)條件是:95℃3 min，95℃15 s，60℃1 min，40個循環(huán)。以擬南芥持家基因ACTIN8(At1g49240)作為內(nèi)參，參照2-△△CT法計算基因相對表達量。用SPSS19軟件獨立樣本的 t檢驗進行差異顯著性分析。

1.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的獲得

根據(jù)基因編碼框上下游序列設(shè)計特異引物并連接attB位點序列，以cDNA為模板擴增基因全序列，擴增條件與反向PCR相同。PCR產(chǎn)物經(jīng)測序確定后，在B/P重組酶(Invitrogen)的作用下，與帶有attP位點的載體pDONR207通過B/P反應(yīng)產(chǎn)生入門載體。將入門載體與目標(biāo)載體FAST-R02通過B/P反應(yīng)產(chǎn)生表達載體，此時基因由CaMV 35S啟動子驅(qū)動表達。將表達載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，用AttB通用引物進行PCR驗證基因序列的正確性，隨后將表達載體轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌株GV3101。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法將表達載體轉(zhuǎn)化到野生型擬南芥植株中。利用紅色熒光顯微鏡檢測帶有表達載體的擬南芥種子［20］，T2代植株用于抗根結(jié)線蟲和蚜蟲試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 擬南芥根結(jié)線蟲抗性株系的鑒定

以9個抗蚜蟲的擬南芥突變體接種根結(jié)線蟲后7 d檢測侵入根系中的線蟲數(shù)量，結(jié)果顯示所有突變株系的侵入線蟲數(shù)量低于野生型，其中株系2018、3790和4619與野生型差異顯著(圖1)。形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果表明，突變株系的莖葉與野生型植株相比明顯較小，根系也較野生型短，但這些差異在3個雙抗株系與6個單抗蚜蟲的株系之間并不明顯。

圖1 根結(jié)線蟲在野生型擬南芥和突變株系根中的入侵數(shù)量Fig.1 Number of infected root knot nematodes(RKNs)on wild type Arabidopsis and its mutants

2.2 擬南芥抗性株系中功能基因的鑒定

Chen等［21］已經(jīng)報道了對株系3790的鑒定，本研究通過反向PCR擴增激活標(biāo)簽旁側(cè)序列，結(jié)合擬南芥基因組序列比對，對抗性株系中激活標(biāo)簽進行定位。結(jié)果顯示突變體2018中激活標(biāo)簽插入在第3條染色體4 350 851位點，與突變體3790中激活標(biāo)簽插入位點只相差2個堿基;突變體4619中激活標(biāo)簽定位于第3條染色體8 862 904位點At3g24420基因的3′非編碼區(qū)。

突變體2018中激活標(biāo)簽插入位點與突變體3790幾乎相同，以此判斷這2個突變體中影響表達水平的基因也一致。基于增強子對其上下游基因表達水平能夠產(chǎn)生影響的范圍不超過8 kb的原則，對突變體 4619中基因表達水平的檢測鎖定在At3g24400、At3g24420、At3g24430和At3g24440。熒光定量PCR結(jié)果顯示只有At3g24400(PERK2)表達水平顯著高于野生植株，其他基因的表達水平均與野生型植株相當(dāng)(圖2)。

前期研究結(jié)果證實突變體3790對蚜蟲的抗性是由SKS13過量表達產(chǎn)生，本研究以SKS13過表達轉(zhuǎn)基因株系G101、G102和G103為材料檢測根結(jié)線蟲的侵染水平，結(jié)果(圖3)顯示入侵轉(zhuǎn)基因植株的線蟲數(shù)量明顯低于野生型植株，表明基因SKS13過量表達是突變體3790抗根結(jié)線蟲的原因。突變體4619中PERK2是檢測到的唯一表達量上調(diào)基因。以CaMV 35S啟動子驅(qū)動PERK2基因表達，構(gòu)建過量表達轉(zhuǎn)基因植株G201、G202和G203。熒光定量PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因株系中該基因表達水平顯著高于野生型(圖4)。抗根結(jié)線蟲和蚜蟲試驗結(jié)果顯示，與野生型相比侵入轉(zhuǎn)基因植株根系的線蟲數(shù)量顯著減少(圖3)，轉(zhuǎn)基因植株葉片上的蚜蟲數(shù)量也顯著降低(圖4)。這些結(jié)果證實PERK2是抗根結(jié)線蟲和蚜蟲的功能基因。

圖3 根結(jié)線蟲在SKS13轉(zhuǎn)基因過量表達擬南芥植株上的侵染水平Fig.3 RKN infection levels on wild type and transgenic Arabidopsis lines overexpressing SKS13

圖4 根結(jié)線蟲和蚜蟲在PERK2轉(zhuǎn)基因過量表達擬南芥植株上的表現(xiàn)Fig.4 RKN and aphid performance on wild type and transgenic lines overexpressing PERK2

2.3 突變體4619上蚜蟲刺吸取食行為分析

通過刺探電位圖譜技術(shù)了解蚜蟲在植株上穿刺取食行為，可以為鎖定植株抗性因子作用位點提供線索。與野生型植株相比，在突變體4619上的蚜蟲取食過程出現(xiàn)更長的總穿刺時間(C波)，口針進行更多次的嘗試性穿刺，而且?guī)缀趺恐谎料x都出現(xiàn)物理阻力的F波(而在野生型上的蚜蟲沒有一只出現(xiàn)F波)(表2)，表明在突變休4619上蚜蟲口針穿刺植物組織時遇到明顯阻力。此外，在突變體4619上蚜蟲在韌皮部取食過程也受到限制，表現(xiàn)為需要更長時間開始在韌皮部取食，且取食次數(shù)和總歷時(E1和E2波)也不到在野生型植株上蚜蟲的一半(表2)。

表2 蚜蟲刺探電位圖譜Table 2 Electrical penetration graph(EPG)of aphid

3 討論

根結(jié)線蟲和蚜蟲經(jīng)常同時危害作物，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大損失，鑒定并使用對二者都能產(chǎn)生抗性的基因具有重要意義。本研究以抗蚜蟲擬南芥突變體為材料進一步挖掘其對根結(jié)線蟲的抗性，篩選到具有雙重抗性的突變體，并鑒定了其產(chǎn)生抗性的功能基因。

根結(jié)線蟲和蚜蟲對植物寄生或取食的過程存在諸多相似。比如根結(jié)線蟲和蚜蟲口針在植物組織細胞間隙活動，產(chǎn)生包含多種蛋白酶的分泌物。當(dāng)尋找到合適的寄生位點根結(jié)線蟲停止遷徙開始發(fā)育直至完成生活史，而蚜蟲也可以從固定的細胞長時間連續(xù)取食［22-23］?；谶@些相似性，推測植物某些抗性因子可能會同時作用于這2種病蟲害。本研究中9個抗蚜蟲的突變體中有1/3表現(xiàn)出對根結(jié)線蟲的抗性就印證了這一推測。

在3個雙抗突變體中2018和3790的抗性是由SKS13基因過量表達導(dǎo)致。前期研究結(jié)果證明SKS13過量表達植株中存在ROS的過量積累，抑制蚜蟲從韌皮部取食［21］。ROS持續(xù)過量積累會導(dǎo)致超敏反應(yīng)，但這一現(xiàn)象沒有出現(xiàn)在被根結(jié)線蟲侵染的SKS13過量表達植株根系中，表明ROS很可能作用于根結(jié)線蟲其他寄生階段。ROS還可以作為信號分子與植株激素信號通路(如茉莉酸信號通路)協(xié)同調(diào)控防御反應(yīng)［24］。茉莉酸信號通路的表達對植物抗根結(jié)線蟲和蚜蟲的作用不同，阻斷茉莉酸信號通路的植株對蚜蟲敏感性增強［25］，對根結(jié)線蟲的敏感性卻降低［26］。前期研究結(jié)果表明，茉莉酸信號通路過量表達只出現(xiàn)在SKS13過量表達的轉(zhuǎn)基因植株中，沒有出現(xiàn)在突變體3790中，而本研究結(jié)果顯示這些植株的抗性水平并沒有差異，說明SKS13過量表達產(chǎn)生的抗性獨立于茉莉酸信號通路。

突變體4619對根結(jié)線蟲和蚜蟲的抗性是由受體蛋白激酶基因PERK2過量表達產(chǎn)生。受體蛋白激酶在植物識別入侵病原的過程中發(fā)揮重要作用，番茄受體蛋白激酶SERK家族中SERK1是番茄對蚜蟲產(chǎn)生抗性反應(yīng)的必須因子，SERK3A和SERK3B是番茄對根結(jié)線蟲的基礎(chǔ)防衛(wèi)反應(yīng)重要原件［15］。本研究中鑒定到的PERK2屬于富含脯氨酸的受體蛋白激酶家族。這個基因家族包含15個成員，其中perk4突變體細胞長度增加，根系較野生型更長［27］。PERK1基因表達水平在植株受到損傷或被病原侵染時顯著上升，推測該基因家族在植物抗病反應(yīng)中發(fā)揮作用［28］。PERK基因家族編碼細胞壁結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，對保持細胞壁的穩(wěn)定性發(fā)揮作用［29］。在突變體4619上蚜蟲穿刺植物組織時遭遇明顯的物理阻力，說明PERK2過量表達可能導(dǎo)致細胞壁結(jié)構(gòu)被強化，這可能也是導(dǎo)致根結(jié)線蟲入侵數(shù)量降低的原因。

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