晚期肺腺癌組織中TYMS基因表達(dá)水平判定及其臨床意義驗(yàn)證

張志豪，朱有才，鄔冬強(qiáng)，肖懷清，郭大為，王細(xì)勇，陳華飛，李曉峰，杜開齊

晚期肺腺癌組織中TYMS基因表達(dá)水平判定及其臨床意義驗(yàn)證

張志豪，朱有才，鄔冬強(qiáng)，肖懷清，郭大為，王細(xì)勇，陳華飛，李曉峰，杜開齊

目的 確定用于TYMS基因表達(dá)水平判定的臨界值，并對(duì)TYMS基因表達(dá)水平判定方法的臨床指導(dǎo)意義進(jìn)行驗(yàn)證。方法 通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)平臺(tái)及2-ΔCt法計(jì)算TYMS基因相對(duì)于內(nèi)參基因的表達(dá)量。將中位值作為判定TYMS基因表達(dá)水平的臨界值，并通過患者接受培美曲塞化療的短期、長期療效對(duì)該臨界值進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果 在150例FFPE樣本中，TYMS基因、內(nèi)參基因同時(shí)可檢出的檢出率為89.3%，TYMS基因相對(duì)表達(dá)量在晚期肺腺癌患者不同年齡組中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.025)，但與患者性別、癌癥分型、分期及吸煙史差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TYMS基因高表達(dá)、低表達(dá)患者在接受培美曲塞化療后的客觀有效率分別為9.8%、35.4%(P<0.05)。TYMS基因高表達(dá)、低表達(dá)患者接受培美曲塞化療的中位無進(jìn)展生存時(shí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，分別為2.1個(gè)月、4.9個(gè)月(P=0.047)；TYMS基因高表達(dá)、低表達(dá)患者中位總體生存時(shí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，分別為9.1個(gè)月、16.7個(gè)月(P=0.024)。結(jié)論 TYMS基因表達(dá)水平判定方法適用于判定晚期肺腺癌FFPE樣本中TYMS基因表達(dá)水平等級(jí)，有利于TYMS基因表達(dá)量檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化，且該方法可用來預(yù)測(cè)培美曲塞化療的療效。

肺腺癌；TYMS基因；表達(dá)量；臨界值

近年來，肺癌在我國的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年攀升的態(tài)勢(shì)，嚴(yán)重威脅人民的身體健康[1]?；熥鳛榉伟┑闹饕委熓侄沃唬溲芯糠桨敢苍谌找娓?。培美曲塞作為新一代抗腫瘤化療藥物，抑制胸苷酸合成酶、二氫葉酸還原酶和甘氨酰胺核苷酸轉(zhuǎn)甲酰酶，干擾胸腺嘧啶和嘌呤的合成，進(jìn)而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞生長的目的[2-4]。研究表明,TYMS可作為培美曲塞療效預(yù)測(cè)的分子指標(biāo)之一，低水平表達(dá)TYMS的惡性腫瘤對(duì)培美曲塞更加敏感[5]。目前，檢測(cè)TYMS基因表達(dá)量的常用方法包括免疫組化[6,7]、實(shí)時(shí)熒光PCR[8,9]等，臨床尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)可供參考。本研究對(duì)150例晚期肺腺癌患者樣本進(jìn)行分析，采用實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)TYMS基因的相對(duì)表達(dá)量，并通過計(jì)算其臨界值來判定患者TYMS基因表達(dá)水平的高低。同時(shí)，筆者也通過回顧性分析來驗(yàn)證該方法在晚期肺腺癌患者中的臨床應(yīng)用價(jià)值，包括預(yù)測(cè)培美曲塞化療的療效。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 2008-04至2012-05我院收治非小細(xì)胞肺癌患者中，隨機(jī)挑選符合下述條件的患者150例，病理分型為腺癌或腺鱗癌；臨床分期為ⅢB或Ⅳ期；根據(jù)于單徑測(cè)量基礎(chǔ)上實(shí)體瘤療效反應(yīng)的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(response evaluation criteria in solid tumors，RECIST)，有至少一個(gè)可測(cè)量病灶；預(yù)計(jì)生存期>12周；化療期間未接受其他抗腫瘤治療。150例中，男81例，女69例；35～87歲，中位年齡61歲；腺癌139例，腺鱗癌11例；臨床分期ⅢB期89例，Ⅳ期61例；有吸煙史103例，無吸煙史47例。

1.2 標(biāo)本來源 采用FFPE(甲醛固定、石蠟包埋)組織切片樣本，5 μm厚切片不少于5片，室溫存放。樣本保存時(shí)間在5年內(nèi)，其中腫瘤組織至少占整個(gè)樣本70%。

1.3 治療方法 采用培美曲塞聯(lián)合順鉑方案，即第1天培美曲塞500 mg/m2、順鉑75 mg/m2，每3周為1個(gè)周期重復(fù)?；?個(gè)周期后評(píng)價(jià)療效。

1.4 療效評(píng)價(jià) 按RECIST標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)腫瘤短期療效，分為完全緩解(complete response，CR)、部分緩解(partial response，PR)、疾病穩(wěn)定(stable disease，SD)和疾病進(jìn)展(progressive disease，PD)。若評(píng)價(jià)為CR和PR，需在4 周后重新評(píng)價(jià)，確認(rèn)療效。生存期按月記錄，自開始治療至患者腫瘤復(fù)發(fā)或進(jìn)展的時(shí)間為無進(jìn)展生存時(shí)間，自開始治療至患者死亡或末次隨訪時(shí)間為總體生存時(shí)間。遺漏值定義為截止到末次隨訪之日未發(fā)生腫瘤復(fù)發(fā)或進(jìn)展(對(duì)于無進(jìn)展生存時(shí)間)或仍然存活(對(duì)于總體生存時(shí)間)的患者。末次隨訪截止日期為2012年5月。

1.5 FFPE樣本RNA提取 采用RNA提取試劑盒(Qiagen公司，RNeasy FFPE Kit)，按照使用說明書的操作，提取FFPE樣本總RNA。通過微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度和純度，稀釋至20～200 ng/μl，于-80 ℃貯存。

1.6 cDNA合成及TYMS基因表達(dá)量檢測(cè) 采用人TYMS基因表達(dá)量相對(duì)定量檢測(cè)試劑盒(北京雅康博生物科技有限公司，熒光PCR法)，按照使用說明書進(jìn)行操作。RNA逆轉(zhuǎn)錄程序：25 ℃ 10 min，37 ℃ 60 min。反應(yīng)后迅速將cDNA置于冰上，于-20 ℃保存。

采用Stratagene Mx3000P實(shí)時(shí)熒光PCR儀，TYMS基因的引物和探針序列如下：上游引物5′-GGCACCCTGTCGGTATTCG-3′，下游引物5′-CCCTTCCAGAACACACGTT-3′， 探針5′-CGCGCTACAGCCTGAGAGATGAA-3′； 內(nèi)參基因β-actin引物和探針序列如下：上游引物5′-CATCCTCACCCTGAAGTA-3′，下游引物5′-ACACGCAGCTCATTGTAG-3′，探針5′-CCCATCGAGCACGGCATCGT-TAMRA-3′。實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)循環(huán)為：95 ℃10 min；95 ℃15 s，60 ℃60 s，共40個(gè)循環(huán)。將實(shí)時(shí)熒光PCR儀輸出的Ct值通過2-ΔCt法(ΔCt=CtTYMS-Ct內(nèi)參基因)計(jì)算得出TYMS基因相對(duì)于內(nèi)參基因的表達(dá)量。以TYMS基因相對(duì)表達(dá)量的中位值為臨界值，大于該臨界值判定為高表達(dá)，小于或等于該臨界值判定為低表達(dá)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)通過SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，雙側(cè)檢驗(yàn)P<0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Mann-Whitney檢驗(yàn)分析不同臨床病理學(xué)特征患者樣本TYMS基因表達(dá)量間的差異；采用Fisher精確檢驗(yàn)分析不同表達(dá)量等級(jí)的患者服藥的客觀有效率間的差異；采用Kaplan-Meier分析和Log rank檢驗(yàn)來確定不同TYMS基因表達(dá)等級(jí)患者的無進(jìn)展生存期、總體生存期間的差異；采用GraphPad Prism 5 Project軟件制作生存曲線。

2 結(jié) 果

2.1 TYMS基因表達(dá)量檢測(cè) 150例FFPE樣本中，10例樣本中的TYMS基因及內(nèi)參基因均無擴(kuò)增信號(hào)；6例樣本中TYMS基因無擴(kuò)增信號(hào)，但內(nèi)參基因有擴(kuò)增。將這16例剔除后，計(jì)算可同時(shí)檢出TYMS及內(nèi)參基因的余下134例(89.3%)樣本的TYMS基因的相對(duì)表達(dá)量。在上述134例樣本中，TYMS基因相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果為0.1×10-3～368.6×10-3，中位值為6.5×10-3。

2.2 TYMS基因表達(dá)量與肺腺癌患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系 分別按照患者年齡、性別、組織分型、臨床分期及吸煙史進(jìn)行分類，采用Mann-Whitney檢驗(yàn)分析上述134例肺腺癌患者樣本中TYMS基因的表達(dá)量與其臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)系(表1)。

表1 晚期肺腺癌134例TYMS基因表達(dá)量與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

從表1可見，這組肺腺癌患者中的低年齡組TYMS基因相對(duì)表達(dá)量顯著高于高年齡組(P=0.025)，而TYMS基因相對(duì)表達(dá)量與這組肺腺癌患者的性別、癌癥分型、分期及吸煙史均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 TYMS基因表達(dá)量與短期療效的關(guān)系 筆者采用TYMS基因相對(duì)表達(dá)量的中位值作為臨界值，將這組肺腺癌患者分為TYMS高表達(dá)組、低表達(dá)組。在上述134例肺腺癌中，有99例的短期療效數(shù)據(jù)可用，因此筆者進(jìn)一步分析了TYMS高表達(dá)組、低表達(dá)組患者服用培美曲塞后的短期療效之間的差異(表2)。從表 2可見，高表達(dá)、低表達(dá)TYMS的患者在應(yīng)用培美曲塞后的客觀有效率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且TYMS低表達(dá)組客觀有效率是高表達(dá)客觀有效率的3倍以上。

表2 不同TYMS表達(dá)量等級(jí)晚期肺腺癌患者短期療效比較 (n)

注：ORR(客觀有效率)為CR+PR所占比例

2.4 TYMS基因表達(dá)量與無進(jìn)展生存、總體生存的關(guān)系 在上述99例具備短期療效數(shù)據(jù)的患者中，有83例的隨訪數(shù)據(jù)可供無進(jìn)展生存、總體生存分析。采用Kaplan-Meier曲線分析TYMS表達(dá)量等級(jí)(高表達(dá)或者低表達(dá))與上述83例無進(jìn)展生存(圖1)、總體生存(圖2)之間的關(guān)系。

圖1 TYMS基因表達(dá)與晚期肺腺癌患者無進(jìn)展生存的關(guān)系

圖2 TYMS基因表達(dá)與晚期肺腺癌患者總體生存的關(guān)系

TYMS高表達(dá)組一年無進(jìn)展生存率為15.0%，總體生存率為36.8%；低表達(dá)組一年無進(jìn)展生存率為34.9%，總體生存率為76.7%。TYMS基因高表達(dá)、低表達(dá)患者接受培美曲塞化療的中位無進(jìn)展生存時(shí)間分別為2.1個(gè)月、4.9個(gè)月，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.047)；TYMS基因高表達(dá)、低表達(dá)患者中位總體生存時(shí)間分別為9.1個(gè)月、16.7個(gè)月，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.024)。

3 討 論

多項(xiàng)研究數(shù)據(jù)表明，TYMS基因的表達(dá)量可用于預(yù)測(cè)培美曲塞化療的療效[10-12]。然而，到目前為止，檢測(cè)基因表達(dá)量的方法并不統(tǒng)一；即使用相同的技術(shù)平臺(tái)，其評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)也存在差異。

3.1 免疫組化法(IHC)檢測(cè)基因表達(dá)量 免疫組化(IHC)是病理檢測(cè)中常用的檢測(cè)技術(shù)之一，是檢測(cè)目標(biāo)蛋白含量的常用方法。在TYMS基因表達(dá)量與培美曲塞化療效果之間關(guān)系的研究中，部分研究者便是采用IHC技術(shù)來檢測(cè)TYMS蛋白水平的含量[6,7,12-14]。但是，由于IHC僅可給出表達(dá)量等級(jí)的結(jié)果，不能給出較為精確的數(shù)值，因此無法對(duì)不同患者癌組織中基因的表達(dá)量進(jìn)行細(xì)分。另外，IHC的實(shí)驗(yàn)流程較為復(fù)雜，人為主觀判定結(jié)果也提高了結(jié)果誤判的機(jī)會(huì)。

3.2 熒光定量PCR檢測(cè)基因表達(dá)量 目前，熒光定量PCR 技術(shù)在臨床檢測(cè)中主要應(yīng)用于病原體檢測(cè)，本研究通過熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)癌組織樣本中TYMS的mRNA水平表達(dá)量。熒光定量PCR的主要技術(shù)特點(diǎn)包括實(shí)驗(yàn)通量高、靈敏度高。相對(duì)于普通PCR結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳對(duì)基因表達(dá)量進(jìn)行半定量的方法，準(zhǔn)確度更高。同時(shí)，由于反應(yīng)結(jié)束后不需要開蓋，不易產(chǎn)生PCR產(chǎn)物氣溶膠的污染。

3.3 熒光定量PCR檢測(cè)基因表達(dá)量的結(jié)果判讀 目前，不同的研究組對(duì)于TYMS基因表達(dá)量高低的判定標(biāo)準(zhǔn)存在差別[8,9,14-16]，原因在于不同的設(shè)計(jì)原理與引物、探針序列可以影響基因表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果及其判定標(biāo)準(zhǔn)，且熒光定量PCR反應(yīng)靈敏度高，相同原料通過不同方式配制也可能得到不同的檢測(cè)結(jié)果。本研究中使用商品化試劑盒，采用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)了150例晚期肺腺癌患者FFPE樣本中TYMS基因mRNA水平的表達(dá)量，并通過計(jì)算得出判定TYMS基因表達(dá)量水平高、低的臨界值。通過回顧性研究發(fā)現(xiàn)，TYMS高表達(dá)、低表達(dá)患者接受培美曲塞化療的客觀緩解率分別為9.8%、35.4%，且存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；兩組患者接受培美曲塞化療的無進(jìn)展生存期、總體生存期之間也存在顯著性差異(P<0.05)，且TYMS基因低表達(dá)的患者用藥效果較好。

綜上所述，筆者推薦采用商品化的試劑盒進(jìn)行基因表達(dá)量的檢測(cè)，以提高檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性，同時(shí)針對(duì)基因表達(dá)量檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化工作也可進(jìn)一步提高檢測(cè)的穩(wěn)定性及結(jié)果的可比性。以上回顧性驗(yàn)證數(shù)據(jù)表明，本研究選擇的TYMS基因表達(dá)量的臨界值判定方法對(duì)晚期肺腺癌患者具有應(yīng)用價(jià)值，可供臨床醫(yī)師參考預(yù)測(cè)培美曲塞化療的療效，但該方法仍需在更大樣本量的回顧性實(shí)驗(yàn)及前瞻性實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。

[1] Jemal A, Bray F, Center M M,etal. Global cancer statistics[J]. CA: A Cancer Journal for Clinicians, 2011, 61(2): 69-90.

[2] Muhsin M, Gricks C, Kirkpatrick P. Pemetrexed disodium[J]. Nat Rev Drug Discov, 2004, 3(10): 825-826.

[3] 李蘭芳,胡 歌,劉 賢,等.吉西他濱聯(lián)合培美曲塞治療晚期非小細(xì)胞肺癌[J]. 實(shí)用腫瘤雜志, 2010, (5): 578-580.

[4] 張雪艷,黃艾彌,白 皓,等.培美曲塞單藥或聯(lián)合化療治療晚期復(fù)發(fā)性非小細(xì)胞肺癌68例分析[J]. 中國癌癥雜志, 2009,26(2): 118-121.

[5] Rouquette I, Mazieres J. A brief overview of a lung cancer biomarker: thymidylate synthase[J]. Revue des maladies respiratoires, 2011,28(6):773-777.

[6] 李 艷, 章明放, 郭雪西, 等. 胃腺癌中P-gp、ToPoⅡ、GSTπ、MGMT和TS的表達(dá)及意義[J]. 臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志, 2011,23(11):45-48.

[7] 鄭巧榮,崔金全. 宮頸上皮內(nèi)瘤變及宮頸癌中TS、PCNA的表達(dá)及其意義[J]. 中國婦幼保健, 2011,21(7):125-127.

[8] 黃慧敏, 李惠翔,張 紅, 等. RNAi對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞E2F1、TS基因表達(dá)的抑制作用[J]. 山東醫(yī)藥, 2008,43(1):14-15.

[9] 李世擁,于 波,安 萍,等.胸苷酸合成酶基因表達(dá)與結(jié)腸直腸癌復(fù)發(fā)的關(guān)系及其臨床意義[J]. 中華外科雜志, 2000,52(10):60-62.

[10] Ozasa H, Oguri T, Uemura T,etal. Significance of thymidylate synthase for resistance to pemetrexed in lung cancer[J]. Cancer science, 2010, 101(1):161-166.

[11] Roe O D, Szulkin A, Anderssen E,etal. Molecular resistance fingerprint of pemetrexed and platinum in a long-term survivor of mesothelioma[J]. PloS one, 2012, 7(8): e40521.

[12] Takezawa K, Okamoto I, Okamoto W,etal. Thymidylate synthase as a determinant of pemetrexed sensitivity in non-small cell lung cancer[J]. British J cancer, 2011, 104(10): 1594-1601.

[13] Mairinger F, Vollbrecht C, Halbwedl I,etal. Reduced folate carrier and folylpolyglutamate synthetase, but not thymidylate synthase predict survival in pemetrexed-treated patients suffering from malignant pleural mesothelioma[J]. J Thorac Oncol，2013, 8(5): 644-653.

[14] Zucali P A, Giovannetti E, Destro A,etal. Thymidylate synthase and excision repair cross-complementing group-1 as predictors of responsiveness in mesothelioma patients treated with pemetrexed/carboplatin[J]. Clinical Cancer Research, 2011, 17(8): 2581-2590.

[15] Bepler G, Sommers K E, Cantor A,etal. Clinical efficacy and predictive molecular markers of neoadjuvant gemcitabine and pemetrexed in resectable non-small cell lung cancer[J]. J Thorac Oncol，2008,3(10):1112-1118.

[16] Shirota Y, Stoehlmacher J, Brabender J,etal. ERCC1 and thymidylate synthase mRNA levels predict survival for colorectal cancer patients receiving combination oxaliplatin and fluorouracil chemotherapy[J]. J Clini Oncol, 2001,19(23):4298-4304.

(2014-04-17收稿 2014-10-21修回)

(責(zé)任編輯 岳建華)

Evaluation of TYMS gene expression level and its clinical significance in advanced lung adenocarcinoma

ZHANG Zhihao, ZHU Youcai, WU Dongqiang, XIAO Huaiqing, GUO Dawei, WANG Xiyong, CHEN Huafei, LI Xiaofeng,and DU Kaiqi.

Department of Cardiothoracic Surgery，Jiaxing Hospital of Zhejiang Provincial Corps,Chinese People’s Armed Police Forces, Jiaxing 314000, China

Objective To examine the relative expression of TYMS gene in 150 FFPE samples of advanced lung adenocarcinoma patients and to validate the method for differentiating TYMS gene expression levels in term of clinical significance. Methods Real time quantitative PCR and 2-ΔCtmethod was used to detect the expression of TYMS and internal reference gene. The median value was used as the cut-off value and retrospective validation was performed including the short and long term therapeutic response towards pemetrexed based chemotherapy. Results In the 150 samples we examined, the detection rate was 89.3% when both the TYMS and the internal reference gene were successfully amplified. TYMS expression was significantly correlated with late stage adenocarcinoma patients’ age groups (P=0.025) but not significantly correlated with patients’ gender, histology, stage or smoking history (P>0.05). The ORR (objective response rate) in TYMS high and low expression groups was 9.8% and 35.4%, respectively (P<0.05). The median progression free survival time in TYMS high and low expression group was 2.1 and 4.9 months, respectively (P=0.047). The median overall survival time in TYMS high and low expression group was 9.1 and 16.7 months, respectively (P=0.024). Conclusions The method for differentiating TYMS gene expression levels in the present study is suitable in late stage adenocarcinoma patients and sheds light on the standardization of TYMS expression detection. This method can also be used to predict the therapeutic efficiency of pemetrexed chemotherapy.

lung adenocarcinoma; TYMS; expression; cut-off value

張志豪，碩士，主任醫(yī)師，E-mail：zhangzhihaowj@126.com

314000，武警浙江總隊(duì)嘉興醫(yī)院胸心外科

杜開齊， E-mail：dukaiqi_wj@126.com

R734.2