青蒿琥酯聯(lián)合卡鉑治療視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究

王慧燕，苗麗霞，孫巖峰，李彥珊，劉紅艷，王 軍，袁海蓮，張向蘭，劉秋玲

青蒿琥酯聯(lián)合卡鉑治療視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究

王慧燕1,2，苗麗霞2，孫巖峰2，李彥珊2，劉紅艷2，王 軍2，袁海蓮2，張向蘭2，劉秋玲2

目的 通過對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(retinoblastoma, RB)移植瘤小鼠進(jìn)行青蒿琥酯(artesunate, ART)聯(lián)合卡鉑治療，并與單獨(dú)采用卡鉑、ART治療組分別進(jìn)行比較，以觀察ART聯(lián)合卡鉑在RB治療中的協(xié)同作用。方法 (1)將濃度為3.5×107/ml RBY-79腫瘤細(xì)胞注入新生小鼠右眼玻璃體內(nèi)，建立RB移植瘤小鼠模型。(2)將建模成功的RB移植瘤小鼠隨機(jī)分為4組，實(shí)驗(yàn)組為ART聯(lián)合卡鉑組；對(duì)照組分3組，分別為卡鉑組、ART組、空白對(duì)照組，對(duì)各組移植瘤小鼠分別給藥，觀察腫瘤變化及移植瘤小鼠生存時(shí)間，進(jìn)行組間比較,并觀察ART聯(lián)合卡鉑的協(xié)同作用。結(jié)果 (1)成功建立RB移植瘤小鼠模型，移植瘤小鼠右眼重量明顯大于正常左眼(P<0.0001)。(2)與空白對(duì)照組相比，聯(lián)合用藥組、卡鉑組、ART組移植瘤小鼠的腫瘤均明顯縮小，P值分別為<0.0001，<0.0001，0.0015；聯(lián)合用藥組、卡鉑組移植瘤小鼠生存時(shí)間明顯延長，P值分別為0.0253，0.0253；ART組移植瘤小鼠生存時(shí)間較空白對(duì)照組無明顯延長，P值為0.8722。(3)與ART組相比，聯(lián)合用藥組及卡鉑組移植瘤小鼠的腫瘤均明顯縮小，P值分別為0.0084及0.0015；聯(lián)合用藥組與卡鉑組移植瘤小鼠生存時(shí)間明顯延長，P值分別為0.0240，0.0239。(4)聯(lián)合用藥組與卡鉑組相比，移植瘤小鼠的腫瘤無明顯縮小(P=0.7980)；移植瘤小鼠生存時(shí)間無明顯延長(P=1.0000)。結(jié)論 ART、卡鉑及兩藥聯(lián)合對(duì)RB均有明顯抑制作用，但ART聯(lián)合卡鉑對(duì)RB無協(xié)同治療作用。

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤；青蒿琥酯；卡鉑；聯(lián)合用藥

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(retinoblastoma, RB)是嬰幼兒時(shí)期最常見眼內(nèi)惡性腫瘤[1,2]。目前，其主要治療方法包括手術(shù)、放療、化療和局部治療等[3]，而化療是其中最重要的治療手段?？ㄣK、長春新堿、依托泊苷是最主要的化療藥物，其次還有環(huán)磷酰胺、環(huán)孢素A等[4-6]。這些化療藥物在殺死腫瘤細(xì)胞、抑制腫瘤生長的同時(shí)會(huì)給患者帶來各種不良反應(yīng)，包括免疫功能下降，骨髓抑制，心、肝、腎毒性等[7,8]。由于這些毒性反應(yīng)，很大程度上限制了RB患者化療藥物的劑量與療程，造成許多晚期患者的預(yù)后目前仍很差[9,10]。因此，迫切需要尋找一種既能抑制腫瘤生長、毒性反應(yīng)又小的藥物，用于RB患者的治療。青蒿琥酯(artesunate, ART)是青蒿素的衍生物。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，ART除了具有較好的抗瘧活性外，還具有抗多種腫瘤細(xì)胞的作用，并且具有毒性低、與常規(guī)化療藥物不存在交叉耐藥、可以逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的多重耐藥性等優(yōu)點(diǎn)[11]。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，ART對(duì)RB細(xì)胞株[12]、RB移植瘤小鼠均有明顯殺瘤作用；體外實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，ART與常用治療RB的化療藥物卡鉑具有協(xié)同殺瘤作用[12]。但ART與卡鉑在體內(nèi)是否也具有協(xié)同抗RB作用，目前國內(nèi)外尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。為此，筆者通過對(duì)RB移植瘤模型小鼠進(jìn)行ART聯(lián)合卡鉑治療，以觀察ART在體內(nèi)是否與卡鉑具有協(xié)同殺瘤作用，為ART應(yīng)用于臨床提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 注射用ART粉針劑(桂林南藥股份有限公司)，注射用卡鉑(山東齊魯制藥廠)，多聚甲醛(St. Louis, MO, USA)，OCT(Sakura)等。

1.1.2 細(xì)胞株和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 (1)細(xì)胞株：人RBY-79細(xì)胞株，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心。腫瘤細(xì)胞接種于完全培養(yǎng)基中，在溫度為37 ℃，CO2濃度為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，完全培養(yǎng)基由90%RPMI1640(GIBCO, USA)，10%胎牛血清(BRL, Merelbeke, Belgium)，1%青霉素/鏈霉素(GIBCO, USA)以及15 mmol/L HEPES(St.Louis, MO, USA)配置而成。實(shí)驗(yàn)中所用的腫瘤細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)生長期。(2)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：飼養(yǎng)于北京生命科學(xué)研究所SPF級(jí)動(dòng)物房的出生24 h內(nèi)的CD1小鼠。母鼠飼養(yǎng)條件為室溫23～25 ℃，空氣濕度40%～50%，光照12 h(06:00～18:00)，黑暗12 h(18:00～06:00)，動(dòng)物自由攝食飲水。

1.2 方法

1.2.1 建立RB移植瘤小鼠模型 選取出生24 h內(nèi)的CD1小鼠20只，收集對(duì)數(shù)生長期的RBY-79細(xì)胞并制成細(xì)胞濃度為3.5×107/ml腫瘤細(xì)胞懸液，在無菌條件下，用微量注射器依次刺破新生小鼠右眼眼瞼、角膜，將4 μl腫瘤細(xì)胞懸液注入小鼠右眼玻璃體內(nèi)。操作過程中要避免刺破晶狀體和視網(wǎng)膜。腫瘤建模7 d后，CO2處死小鼠，完整剖出含腫瘤組織的右眼眼球和左眼正常眼球，稱重并記錄。用1×PBS洗去眼球周圍的血液，并在體式顯微鏡下拍照。隨后用4%PFA 4 ℃過夜固定，1×PBS沖洗，不同濃度梯度的甲醇脫水、復(fù)水，30%蔗糖過夜沉降，OCT包埋，切片，最后運(yùn)用蘇木精-伊紅(H﹠E)染色，顯微鏡下觀察含腫瘤組織的右眼眼球和左眼正常眼球的細(xì)胞結(jié)構(gòu)差異，確定RB移植瘤小鼠建模是否成功。

1.2.2 ART、卡鉑聯(lián)合用藥對(duì)RB移植瘤小鼠腫瘤的影響 將48只同一天出生并確認(rèn)腫瘤建模成功的新生移植瘤小鼠隨機(jī)分為4組，每組12只，各組給藥途徑均為腹腔注射。(1)聯(lián)合用藥組：ART 50 mg/(kg·d)，腫瘤建模成功后第3～9天連續(xù)給藥，1次/d，共7 d；卡鉑20 mg/(kg·d)，腫瘤建模成功后第3天給藥，1次/d，共1 d；(2)卡鉑組：卡鉑20 mg/(kg·d)，腫瘤建模成功后第3天給藥，1次/d，共1 d；(3)ART組：ART 50 mg/(kg·d)，腫瘤建模成功后第3～9天連續(xù)給藥，1次/d，共7 d；(4)空白對(duì)照組：腫瘤建模成功后第3～9天腹腔注射同等體積的生理鹽水，1次/d，共7 d。用藥期間密切觀察各組移植瘤小鼠的生活狀態(tài)，并記錄各組實(shí)驗(yàn)小鼠的死亡數(shù)量。根據(jù)所得數(shù)據(jù)，繪制Kaplan-Meier小鼠生存曲線。用藥結(jié)束后次日處死各組小鼠并稱重；將腫瘤組織剖出并稱瘤重。用1×PBS洗去腫瘤組織周圍血液，并在體式顯微鏡下拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用Graph Prism統(tǒng)計(jì)軟件，兩組樣本均數(shù)的比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)，多組樣本均數(shù)的兩兩比較采用ANOVA(Tukey檢驗(yàn))，各組生存曲線的比較采用log-rank檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 成功建立RB移植瘤小鼠模型 新生小鼠右眼玻璃體內(nèi)注射了RBY-79細(xì)胞后成瘤率可達(dá)100%，腫瘤建模后第6天移植瘤小鼠開始出現(xiàn)死亡，建模7 d內(nèi)移植瘤小鼠病死率為20%(圖1)。新生小鼠右眼玻璃體內(nèi)注射RBY-79后第1天右眼眼球與左眼眼球相比稍突出；建模后第3天，可見右眼眼球較左眼正常眼球突出；5 d后移植瘤突出更加明顯；注射7 d后，含移植瘤的右眼眼球已明顯突出于眶外。建模后第7天，CO2處死移植瘤小鼠，剖出右眼和左眼，可見注射了RBY-79的右眼(圖2A)明顯比左眼(圖2B)大，右眼眼球呈瓷白色，表面凹凸不平、血管豐富；左眼保留了眼球的完整結(jié)構(gòu)。含腫瘤組織的右眼眼球重量(0.1213±0.01181)g明顯高于左眼(0.01372±0.00033)g，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0001)(圖3)。HE染色示正常左眼：可見清晰完整的眼球結(jié)構(gòu)，玻璃體由紅染的膠原纖維和少量圓形、橢圓形、梭形或扁平型細(xì)胞組成；視網(wǎng)膜的完整性和連續(xù)性仍存在(圖4A)。右眼可見病態(tài)眼球結(jié)構(gòu)：正常眼球結(jié)構(gòu)已破壞，玻璃體內(nèi)充滿圓形、橢圓形、多邊形或不規(guī)則形的腫瘤細(xì)胞；胞核大、圓形、卵圓形或不規(guī)則形，染色深，有1～2個(gè)以上核樣結(jié)構(gòu)體。核內(nèi)常見1～2個(gè)不規(guī)則核仁，胞質(zhì)少(圖4B)。

圖1 各組移植瘤小鼠生存時(shí)間與生存率的關(guān)系

圖2 腫瘤建模7 d后含腫瘤組織的右眼與正常左眼

圖3 含腫瘤組織的右眼與正常左眼重量比較

2.2 聯(lián)合用藥對(duì)RB移植瘤小鼠腫瘤生長影響 (1)聯(lián)合用藥組、卡鉑組、ART組移植瘤小鼠的腫瘤重量均明顯小于空白對(duì)照組(圖5，圖6，表1)(P<0.0001，P<0.0001，P=0.0015)，且前兩組移植瘤小鼠的生存時(shí)間與空白對(duì)照組相比明顯延長(圖1，P=0.0253，P=0.0253)，但ART組移植瘤小鼠生存時(shí)間無明顯延長(圖1，P=0.8722)；(2)聯(lián)合用藥組、卡鉑組移植瘤小鼠的腫瘤均明顯小于ART組(圖5，圖6，表1，P=0.0084，P=0.0015)，移植瘤小鼠生存時(shí)間明顯延長(圖1，P=0.0240，P=0.0239)；(3)聯(lián)合用藥組與卡鉑組相比，移植瘤小鼠的腫瘤未見明顯縮小(圖5，圖6，表1，P=0.7980)，移植瘤小鼠生存時(shí)間未見明顯延長(圖1，P=1.000)；(4)聯(lián)合用藥組、ART組、卡鉑組移植瘤小鼠的體重較空白對(duì)照組均有輕微下降，但均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，用藥組間移植瘤小鼠的體重也無明顯差異。

圖4 含腫瘤組織的右眼與正常左眼眼球冷凍切片(HE，5×)

注:與空白對(duì)照組比較，①P<0.05；與ART組比較，②P<0.05；與卡鉑組比較，③P<0.05

圖5 各組移植瘤小鼠用藥結(jié)束后外觀比較

圖6 各組移植瘤小鼠用藥結(jié)束后腫瘤組織重量的比較

3 討 論

既往研究發(fā)現(xiàn)，ART對(duì)人體多種腫瘤細(xì)胞系，或是腫瘤模型動(dòng)物均有較好的抗腫瘤作用；ART對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用具有高度的選擇性；ART對(duì)多重耐藥的腫瘤細(xì)胞亦有顯著抑制作用[13-15]。近幾年來，本課題組對(duì)ART對(duì)RB的作用進(jìn)行了系列研究。我們發(fā)現(xiàn)，ART對(duì)RB細(xì)胞株具有明顯殺瘤活性，且與公認(rèn)的治療RB的化療藥物卡鉑有協(xié)同抗瘤作用[12]。進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，ART對(duì)RB移植瘤小鼠的腫瘤具有顯著殺瘤作用，初步研究認(rèn)為ART對(duì)RB體內(nèi)的殺瘤機(jī)制可能為抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、減少腫瘤組織新生血管的形成。ART與卡鉑在體內(nèi)是否具有協(xié)同抗RB作用，目前國內(nèi)外未見文獻(xiàn)報(bào)道。

本研究通過建立RB移植瘤小鼠模型，選取腫瘤建模后第3天的移植瘤小鼠進(jìn)行ART聯(lián)合卡鉑治療，并分別與卡鉑組、ART組、空白對(duì)照組進(jìn)行比較。筆者發(fā)現(xiàn)，注射RBY-79 3 d的移植瘤小鼠，右眼腫瘤明顯突出眼眶，更符合臨床晚期RB患兒的發(fā)病特點(diǎn)。因此，筆者選擇腫瘤建模后第3天開始用藥。本實(shí)驗(yàn)中，筆者發(fā)現(xiàn)卡鉑、ART這兩種藥物均對(duì)RB移植瘤小鼠的腫瘤細(xì)胞有殺瘤作用，明顯抑制腫瘤組織的生長，從而延長移植瘤小鼠生存時(shí)間；與ART相比，傳統(tǒng)化療藥物卡鉑抑制RB生長的效果更顯著?？ㄣK、ART聯(lián)合用藥對(duì)RB移植瘤小鼠腫瘤組織的殺瘤作用明顯高于ART單獨(dú)用藥，但與卡鉑單獨(dú)用藥相比，其對(duì)腫瘤的抑制作用并沒有增加，所以說ART聯(lián)合卡鉑對(duì)RB并無明顯的協(xié)同治療作用，這與筆者前期的關(guān)于ART體外與卡鉑有協(xié)同抗瘤作用的結(jié)果不一致。

筆者分析這種結(jié)果的可能原因：ART是通過抗腫瘤的活性結(jié)構(gòu)-過氧化橋，對(duì)人類腫瘤細(xì)胞系產(chǎn)生明顯的殺瘤作用。但是，ART這種抗腫瘤的活性結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性極差。而卡鉑，作為一種常見的鉑類抗腫瘤藥物，是通過其活性結(jié)構(gòu)-鉑分子與腫瘤細(xì)胞的DNA分子結(jié)合，改變腫瘤分子結(jié)構(gòu)、破壞DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄序列，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮殺死腫瘤的作用[13]。本研究中聯(lián)合用藥組的RB移植瘤小鼠開始給予卡鉑治療時(shí)，體內(nèi)的ART可能尚未完全代謝，過氧化橋活性結(jié)構(gòu)極可能會(huì)與卡鉑的活性結(jié)構(gòu)-鉑分子相結(jié)合，最終減弱二者抑制腫瘤的作用，發(fā)揮不了協(xié)同抗腫瘤的效果。另外，大部分殺瘤藥物是通過相近或相似的作用機(jī)制殺死腫瘤細(xì)胞、達(dá)到抑制腫瘤生長的治療目的。目前，國內(nèi)外對(duì)ART體內(nèi)抑制腫瘤生長機(jī)制的研究還不是很清楚，如果ART、卡鉑對(duì)RB移植瘤小鼠的抑制腫瘤生長的機(jī)制相同或相近，ART用藥結(jié)束后，除已經(jīng)被殺死的腫瘤細(xì)胞外，體內(nèi)殘存的大部分腫瘤細(xì)胞正處于對(duì)卡鉑不敏感的細(xì)胞周期，從而發(fā)揮不了ART、卡鉑的協(xié)同抗腫瘤作用。此外，兩種藥物的用藥順序、用藥途徑也可能會(huì)影響其對(duì)腫瘤的抑制作用[14]。

在以后的工作中，筆者會(huì)利用化學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，進(jìn)一步測試ART與卡鉑在體外可能的結(jié)構(gòu)相互作用；同時(shí)利用免疫熒光等技術(shù)探究ART、卡鉑體內(nèi)抑制RB生長的作用機(jī)理，尋找本實(shí)驗(yàn)中ART、卡鉑聯(lián)合用藥對(duì)RB移植瘤小鼠不能產(chǎn)生協(xié)同抗腫瘤作用的原因。通過改變兩種藥物的用藥時(shí)機(jī)、用藥順序，嘗試不同的給藥途徑，尋求一種治療RB的毒性反應(yīng)小，腫瘤殺傷性強(qiáng)的聯(lián)合用藥方法，為ART應(yīng)用于臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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(2015-03-03收稿 2015-05-21修回)

(責(zé)任編輯 張 楠)

A primary study of artesunate accociated with carboplatin on retinoblastoma in mice

WANG Huiyan1,2,MIAO Lixia2，SUN Yanfeng2，LI Yanshan2，LIU Hongyan2, WANG Jun2,YUAN Hailian2,ZHANG Xianglan2,and LIU Qiuling2.

1.Xuzhou Medical College, Xuzhou 221002,China;2.Department of Pediatrics, The General Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces, Beijing 100039,China

Objective This study was designed to determine the combined therapeutic effects of artesunate and carboplatin in treating retinoblastoma, compared with carboplatin alone, artesunate alone and control groups after having established newborn mice retinoblastoma model successfully. Methods (1)The cell line RBY-79 in a single-cell suspension was implanted into the right vitreous body of newborn littermates to set up a retinoblastoma xenograft model.(2)Mice bearing palpable tumors were randomly divided into four independent groups after all retinoblastoma xenograft models had been established, respectively, combined group, carboplatin group, ART group and control group. Our aims were to observe and compare the tumor size and survival time of retinoblastoma newborn mice in different groups. Results (1)Retinoblastoma xenograft models of newborn mice were successfully established and a consistent and statistically significant difference was found in the tumor weight between the right and left eyes (P<0.0001).(2)①The tumor weights in combined group, carboplatin group and ART group were significantly less than that in control (P<0.0001,P<0.0001,P=0.0015), at the same time, the survival time in these the former two groups were longer (P=0.0253,P=0.0253), that in ART group was not longer(P=0.8722). ②The tumor weights in combined group, carboplatin group were significantly less than that in ART group (P=0.0084,P=0.0015), and the survival time in the two groups were longer (P=0.0240,P=0.0239). ③The tumor weight in combined group was significantly no less than that in carboplatin group and the survival time was not longer (P=0.7980,P=1.0000). Conclusions In our study, we can find that combined treatment, carboplatin and ART can significantly inhibit the growth of retinoblastomainvivo. However, ART does not significantly enhance the antitumor effects of carboplatin during the treatment.

retinoblastoma; artesunate; carboplatin; combined treatment

首都臨床特色應(yīng)用研究專項(xiàng)(Z121107001012055)

王慧燕，碩士研究生，E-mail：wangfengfeng0327@126.com

1.221004，徐州醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院；2.100039 北京，武警總醫(yī)院兒科

劉秋玲，E-mail：wj670@vip.sina.com.

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