實(shí)驗(yàn)性精索靜脈曲張對(duì)大鼠睪丸結(jié)構(gòu)及內(nèi)分泌功能變化的影響

賈曉鵬，苗 蕊，李 斌,孫亞楠

·論著·

實(shí)驗(yàn)性精索靜脈曲張對(duì)大鼠睪丸結(jié)構(gòu)及內(nèi)分泌功能變化的影響

賈曉鵬，苗 蕊，李 斌,孫亞楠

目的 揭示精索靜脈曲張導(dǎo)致男性不育的機(jī)制。方法 將SD(Sprayue-Dawley)三級(jí)雄性大鼠40只隨機(jī)分為精索靜脈曲張組、假手術(shù)組，每組20只。按Turner法建立精索靜脈曲張動(dòng)物模型，造模后12周將兩組大鼠分別脫頸處死，摘取左側(cè)睪丸，以透射電鏡觀察睪丸的超微結(jié)構(gòu)；摘取兩組大鼠的附睪分離出精子觀察其形態(tài)；檢測(cè)睪丸組織內(nèi)雄激素結(jié)合蛋白、抑制素B，計(jì)算出免疫組化評(píng)分(IHS)；檢測(cè)睪丸組織內(nèi)睪酮水平。結(jié)果 精索靜脈曲張組與假手術(shù)組比較，支持細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞及精子細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化；睪丸組織雄激素結(jié)合蛋白IHS差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；抑制素B IHS及睪酮水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。結(jié)論 精索靜脈曲張通過(guò)影響大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞、支持細(xì)胞的結(jié)構(gòu)改變其功能，通過(guò)影響生殖系統(tǒng)內(nèi)分泌環(huán)境及性激素水平影響精子的成熟與發(fā)育使精子數(shù)量和形態(tài)發(fā)生改變，造成不育。

精索靜脈曲張；超微結(jié)構(gòu)；雄激素結(jié)合蛋白；抑制素B；睪酮；大鼠,Sprague-Dawley

精索靜脈曲張是男科常見(jiàn)疾病，男性不育癥患者中精索靜脈曲張者占19%～41%[1]。精索靜脈曲張導(dǎo)致不育的原因眾多，但具體機(jī)制不明[2]。本課題通過(guò)研究精索靜脈曲張對(duì)大鼠睪丸結(jié)構(gòu)及內(nèi)分泌功能的影響，探討男性不育的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組 選擇40只健康的SD三級(jí)青春期雄性大鼠(購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，鼠齡40～60 d，體重240～280 g。在相同的飼養(yǎng)條件下飼養(yǎng)12周。將40只大鼠隨機(jī)編號(hào)，雙數(shù)組為精索靜脈曲張組(20只)，單數(shù)組為假手術(shù)組(20只)。

1.2 動(dòng)物模型制備 動(dòng)物模型按文獻(xiàn)[3]的方法制備:腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛3.33 ml/kg麻醉。精索靜脈曲張組：將大鼠固定于手術(shù)臺(tái)上，取腹正中縱向切口，暴露腹腔，將左腎靜脈及左腎上腺靜脈、下腔靜脈分別游離，將直徑為0.8 mm的8#注射器針頭放置于左腎上腺靜脈和下腔靜脈之間,在左腎靜脈及下腔靜脈交叉處用3-0絲線將針頭和左腎靜脈一并結(jié)扎，拔出針頭，左腎靜脈直徑可縮小一半。0.9%氯化鈉注射液沖洗腹腔后，將切口依次縫合；假手術(shù)組：步驟與靜索靜脈曲張組相同，不結(jié)扎左腎靜脈。在腹腔內(nèi)注射抗生素預(yù)防感染，青霉素劑量為20萬(wàn)單位/次、1/d，連用3 d。所有大鼠在術(shù)后第12周均脫頸處死，精索靜脈曲張組解剖發(fā)現(xiàn)左側(cè)精索靜脈曲張，直徑大于1 mm，雙腎重量、體積無(wú)差別，表示動(dòng)物模型制備成功[4]。

1.3 標(biāo)本的采集及檢測(cè)

1.3.1 睪丸病理切片制備：①取材和固定: 仔細(xì)剪除附睪及周?chē)钅さ雀綄俳M織，將睪丸平均切成兩半，一半研磨、離心15 min，取上層液置于Eppendof管-20℃保存待測(cè)。另一半立即投放入含1%多聚甲醛及2%戊二醛混合液中固定6～24 h。固定后橫切成厚1～2 mm薄片。②洗滌:倒出固定液,加入洗滌液(pH值7.4的PBS液)洗滌，再將標(biāo)本固定2 h。固定液為1%四氧化鋨酸液。③脫水與透明：梯度乙醇脫水，順序放入85%乙醇，95%乙醇，100%乙醇,在浸蠟前除去酒精,用二甲苯進(jìn)行媒浸,該過(guò)程可使組織透明，將透明后的組織投入環(huán)氧樹(shù)脂中包埋，最后切片，切片厚度4 μm，于60℃溫箱中烘干。用醋酸雙氧鈾及枸櫞酸鉛染色,用HITACHI-H7500型透射電子顯微鏡觀察標(biāo)本。

1.3.2 精液標(biāo)本的采集和檢測(cè)：摘取兩組大鼠的附睪后，將附睪游離出，分離出其頭部、體部、尾部，漂洗附睪，切取附睪尾部，將切取的尾部組織縱向做3個(gè)切口，放入離心管內(nèi)，將PBS液加到2 ml,將盛有兩組標(biāo)本的離心管分別放入水浴箱內(nèi)，水溫為37℃，精子可自由游出，20 min后，取出離心管。將上層精子懸液用微量移液器吸取10 μl，滴在精子計(jì)數(shù)板上。將可調(diào)節(jié)加樣器吸取的40 μl精子懸液滴在載玻片上，自然晾干，固定10 min，再自然晾干，用1%伊紅染液染色1.5 h，清水沖洗載玻片，自然晾干。用光學(xué)顯微鏡觀察精子的形態(tài)，包括4個(gè)角及正中部5個(gè)視野。

1.3.3 檢測(cè)睪丸組織內(nèi)雄激素結(jié)合蛋白(ABP)：將厚度4 μm的組織乙醇脫水，中性樹(shù)脂封片。隨機(jī)選取5個(gè)視野，陽(yáng)性對(duì)照為表達(dá)ABP陽(yáng)性的生精上皮，陰性對(duì)照為PBS代替一抗，在細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜內(nèi)見(jiàn)到黃色或棕黃色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞。參考Soslow等[4]的方法依照細(xì)胞著色密度(A)和著色強(qiáng)度(B)建立以下半定量評(píng)分方法：依陽(yáng)性細(xì)胞的密度：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為0分；陽(yáng)性細(xì)胞1%～10%為1分；10%～50%為2分；50%～80%為3分；80%～100%為4分。依陽(yáng)性細(xì)胞的著色強(qiáng)度：陰性，0分；輕度著色(淺棕黃色)，1分；中度著色(棕黃色)，2分；強(qiáng)染色(深棕黃色)，3分。著色密度和強(qiáng)度之積作為結(jié)果判定的最后得分[免疫組化評(píng)分(IHS)=A×B]。

1.3.4 測(cè)定睪丸組織內(nèi)抑制素B(Inh B)、睪酮：Inh B測(cè)定方法同“1.3.3”；使用BECKMAN COULTER DXⅠ 800全自動(dòng)免疫分析儀測(cè)定睪丸組織內(nèi)睪酮水平。

2 結(jié)果

2.1 睪丸組織鏡下觀察結(jié)果

2.1.1 支持細(xì)胞：假手術(shù)組表現(xiàn)為支持細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，基部跟基膜緊貼，頂部突向腔面，核大形態(tài)不規(guī)則，核膜有向內(nèi)的凹陷，胞質(zhì)基質(zhì)致密，有大量的線粒體及滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，Sertoli-Sertoli細(xì)胞連接連續(xù)未斷裂。精索靜脈曲張組表現(xiàn)為支持細(xì)胞基底膜發(fā)生改變、水腫，基膜內(nèi)可見(jiàn)大量的肌樣細(xì)胞，Sertoli-Sertoli細(xì)胞間連接普遍斷裂，胞質(zhì)內(nèi)線粒體及滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)顯著減少，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量溶酶體顆粒。見(jiàn)圖1、2。

2.1.2 間質(zhì)細(xì)胞：假手術(shù)組表現(xiàn)為間質(zhì)細(xì)胞表面細(xì)長(zhǎng)微絨毛存在，彌漫均勻的胞質(zhì)內(nèi)染色質(zhì)內(nèi)有大量的線粒體、高爾基復(fù)合體、滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及少量粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，細(xì)胞核清晰并有較大的核仁。精索靜脈曲張組表現(xiàn)為間質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，出現(xiàn)空泡樣變性，細(xì)胞核內(nèi)核仁不清，染色質(zhì)出現(xiàn)成塊凝集，并核周積聚，胞質(zhì)內(nèi)有大量溶酶體顆粒；細(xì)胞表面微絨毛數(shù)量、線粒體、滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)顯著減少。見(jiàn)圖3、4。

2.1.3 精子細(xì)胞：假手術(shù)組表現(xiàn)為精子細(xì)胞核細(xì)長(zhǎng)，頭部含極少量的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核以及特化的高爾基體(頂體)染色質(zhì)正常；精索靜脈曲張組表現(xiàn)為精子細(xì)胞核畸形，核內(nèi)有大量空泡、核膜、頂體消失，染色質(zhì)濃縮成塊狀。見(jiàn)圖5、6。

圖1 假手術(shù)組大鼠睪丸支持細(xì)胞電鏡觀察結(jié)果(×15 000)；圖2 精索靜脈曲張組大鼠睪丸支持細(xì)胞電鏡觀察結(jié)果(×15 000)；圖3 假手術(shù)組大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞電鏡觀察結(jié)果(20 000)；圖4 精索靜脈曲張組大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞電鏡觀察結(jié)果(×20 000)；圖5 假手術(shù)組大鼠精子細(xì)胞光鏡觀察結(jié)果(DAB×400)；圖6 精索靜脈曲張組大鼠精子細(xì)胞電鏡觀察結(jié)果(×20 000)

2.2 睪丸組織ABP IHS比較 假手術(shù)組、精索靜脈曲張組大鼠睪丸組織ABP HIS中位數(shù)(四分位數(shù)間距)分別為6(4.5)、6(4.25)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-1.078，P=0.281)。

2.3 睪丸組織內(nèi)Inh B比較 假手術(shù)組、精索靜脈曲張組大鼠睪丸組織Inh B HIS中位數(shù)(四分位數(shù)間距)分別為7.5(4.5)、5.0(2.0)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-2.114，P=0.035)。

2.4 睪丸組織睪酮濃度比較 假手術(shù)組、精索靜脈曲張組大鼠睪丸組織睪酮濃度分別為(109.10±6.37)、(94.79±3.31)nmol/L，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.52，P<0.001)。

3 討論

精索靜脈曲張是指精索內(nèi)蔓狀靜脈叢的異常伸長(zhǎng)、擴(kuò)張和迂曲[5]。在男性不育癥的諸多病因中，精索靜脈曲張位居首位，其對(duì)男性生育能力的影響越來(lái)越受到重視[6-7]。足夠數(shù)量的正常形態(tài)精子是受孕的基礎(chǔ)，睪丸支持細(xì)胞對(duì)生精細(xì)胞的作用除直接的營(yíng)養(yǎng)支持、維持局部免疫豁免的作用外，更多的是通過(guò)各種因子的分泌維持生精細(xì)胞的發(fā)育。睪丸間質(zhì)細(xì)胞的主要功能是睪酮的合成與分泌及生精的發(fā)生，因此對(duì)睪丸間質(zhì)細(xì)胞功能障礙的研究已成為男性不育的一個(gè)重要研究領(lǐng)域[8]。Venkatesh等[9]研究表明，睪丸支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的損害是導(dǎo)致精子異常的重要原因。

本研究發(fā)現(xiàn)，精索靜脈曲張大鼠精子密度、形態(tài)均發(fā)生變化，精子畸形率明顯增加。精子畸形特別是頂體結(jié)構(gòu)的改變會(huì)嚴(yán)重影響大鼠生育能力，因?yàn)榫优c卵子相遇前，精子在子宮和輸卵管處頂體獲能后才有迅速運(yùn)動(dòng)與受精的能力。精索靜脈曲張導(dǎo)致精子數(shù)量減少和形態(tài)改變的可能機(jī)制除了造成睪丸間質(zhì)細(xì)胞、支持細(xì)胞的損害使精子產(chǎn)生減少與成熟障礙外，還破壞了血-生精小管屏障，觸發(fā)了免疫機(jī)制，精子、精漿在體內(nèi)產(chǎn)生大量的抗精子抗體，影響正常精子的生成及成熟，并加速生精細(xì)胞的凋亡，因此精子密度明顯降低，畸形率明顯增加，從而影響男性的生育能力。

本研究通過(guò)對(duì)精索靜脈曲張大鼠睪丸超微結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn)，精索靜脈曲張可導(dǎo)致睪丸支持細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞的改變。在眾多因子中，ABP與Inh B對(duì)于睪丸生精功能的維持和調(diào)節(jié)作用顯著。ABP是一種分子量為85 kd的異二聚體糖蛋白，與雄激素共同參與性功能的產(chǎn)生維持作用[10]；Inh是一種糖蛋白二聚體，有A和B兩種亞單位，亞單位A與兩種亞單位B通過(guò)二硫鍵鏈接，分別形成抑制素Inh A及Inh B，其中Inh B是主要作用形式。在男性，睪丸支持細(xì)胞分泌抑制素，它的主要作用是通過(guò)負(fù)反饋調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-性腺軸使促卵泡激素(FSH)分泌減少，從而使睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌睪酮減少，同時(shí)也可通過(guò)cAMP途徑對(duì)間質(zhì)細(xì)胞功能起調(diào)節(jié)作用[11-12]。本研究結(jié)果顯示，精索靜脈曲張組睪丸組織Inh B濃度較假手術(shù)組明顯降低，說(shuō)明精索靜脈曲張能引起睪丸支持細(xì)胞Inh B表達(dá)減少，進(jìn)而導(dǎo)致精子的發(fā)育、成熟障礙，最終引起生精功能低下。

本研究同樣證明，造模后12周，精索靜脈曲張組大鼠睪丸組織睪酮水平較假手術(shù)組明顯下降，其機(jī)制為調(diào)節(jié)作用導(dǎo)致睪丸間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)源性睪酮分泌減少，影響精子的發(fā)育和成熟，最終引起不育。睪丸細(xì)胞一旦出現(xiàn)損傷必然造成睪酮分泌下降，在睪丸細(xì)胞損傷較輕的情況下，F(xiàn)SH和黃體生成素(LH)分泌增加，會(huì)增強(qiáng)對(duì)間質(zhì)細(xì)胞的作用，使血液中的睪酮恢復(fù)到正常水平[13]。有研究表明,精索靜脈曲張可引起睪丸間質(zhì)細(xì)胞、支持細(xì)胞的功能下降,使外周血中的性激素水平下降,反饋至下丘腦-垂體-睪丸軸,使血液促性腺激素分泌水平升高,從而影響睪丸生精作用的內(nèi)分泌環(huán)境而致生育力下降[14-15]。

綜上所述，精索靜脈曲張通過(guò)影響睪丸間質(zhì)細(xì)胞、支持細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，造成其功能的改變，影響生殖系統(tǒng)內(nèi)分泌環(huán)境和性激素的水平，以及精子的成熟與發(fā)育，使精子數(shù)量和形態(tài)發(fā)生改變，造成不育。另外，精索靜脈曲張本身也能引起精子數(shù)量的減少及畸形的增加。因此，本實(shí)驗(yàn)是從睪丸的超微結(jié)構(gòu)及內(nèi)分泌等方面揭示了精索靜脈曲張導(dǎo)致男性不育的機(jī)制，為臨床治療精索靜脈曲張?zhí)峁┝丝煽康睦碚撘罁?jù)。

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Effect of Experimental Varicocele on the Structure and Endocrinic Function of Testis in Rats

JIA Xiao-peng1, MIAO Rui2, LI Bin3， SUN Ya-nan2

(1. Department of Urinary Surgery, the Third Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000, China; 2. Department of Obstetrics and Gynecology, Bethune International Peace Hospital of PLA, Shijiazhuang 050082, China; 3. Department of Urinary Surgery, Tangshan Workers' Hospital, Tangshan, Hebei 063000, China)

Objective To study the mechanisms of male infertility caused by varicocele. Methods The 40 grade Ⅲ Sprayue-Dawley (SD) male mice were randomly divided into varicocele group (n=20) and sham operation group (SH group,n=20). Turner method was used to establish animal varicocele models. The models were executed by breaking their necks 12 weeks after establishment, and the left testises were obtained to observe testis ultrastructure under transmission electron microscope. The epididymides of the two groups were obtained to isolate the sperm for observing its form, and the levels of testicular androgen binding protein (ABP) and inhibin-B (INH-B) were detected, and the immunohistochemical score (IHS) was calculated, and the testosterone level in testis tissue was also detected. Results Compared with those in SH group, in varicocele group, the microstructures of sertoli, stromal and sperm cells changed significantly; the difference of IHS value of ABP was not statistically significant in the two groups (P>0.05); the differences of IHS value of INH-B and testosterone level were statistically significant in the two groups (P<0.05，P<0.01). Conclusion Varicocele can change the cell functions by affecting sertoli and stromal microstructures in male mice. Furthermore, it can affect spermatic mature and development by changing reproductive and endocrine environment and sex hormone levels, and then sperm counts and morphological will be changed, eventually leading to infertility.

Varicocele; Ultrastructure; Androgen binding protein; Inhibin B; Testosterone; Rat, Sprague-Dawley

河北省人口和計(jì)劃生育委員2012年科研計(jì)劃課題(2012-A09)

050000 石家莊,河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院泌尿外科(賈曉鵬);050082 石家莊,解放軍白求恩國(guó)際和平醫(yī)院婦產(chǎn)科(苗蕊、孫亞楠);063000 河北 唐山，唐山市工人醫(yī)院泌尿外科(李斌)

R698.2；R-332

A

2095-140X(2015)08-0056-04

10.3969/j.issn.2095-140X.2015.08.014

2015-05-04 修回時(shí)間：2015-05-26)