腺苷酸活化蛋白激酶在哺乳動物卵巢發(fā)育中的調(diào)控作用及其機(jī)制

摘 要：腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信號通路作為調(diào)節(jié)細(xì)胞能量代謝狀態(tài)的中心環(huán)節(jié)，是調(diào)控哺乳動物繁殖性能的關(guān)鍵因子。已有研究表明，AMPK在哺乳動物卵巢發(fā)育中主要通過介導(dǎo)葡萄糖、胰島素樣生長因子－1（IGF?1）、促卵泡素（FSH）、脂聯(lián)素等發(fā)揮功能。本文就AMPK在哺乳動物卵巢發(fā)育中的調(diào)控作用及其機(jī)制進(jìn)行綜述，旨在引起人們對AMPK調(diào)控卵巢發(fā)育的關(guān)注，并為卵巢疾病的治療提供一定參考。

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1006?267X（2015）10?3006?06

doi：10．3969／j．issn．1006?267x．2015．10．003

收稿日期：2015－04－28

基金項目：四川省教育廳重點項目（13ZA0259）；四川農(nóng)業(yè)大學(xué)引進(jìn)人才科研啟動項目；川豬遺傳改良與安全生產(chǎn)教育部創(chuàng)新團(tuán)隊（IRT13083）

作者簡介：許蒙蒙（1988—），女，河南安陽人，碩士研究生，從事動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)研究。E?mail：xumengmeng2013＠126．com

?通信作者：徐盛玉，副研究員，碩士生導(dǎo)師，E?mail：shengyuxu＠sicau．edu．cn

繁殖性能的高低是雌性動物生產(chǎn)力的重要體現(xiàn)。卵巢在雌性動物繁殖功能發(fā)揮中起著不可替代的作用，其中卵泡、卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞作為卵巢的主要組成成分，對卵巢發(fā)育起著至關(guān)重要的作用 ［1］。若卵巢發(fā)育發(fā)生異常，將會導(dǎo)致女性出現(xiàn)閉經(jīng)、月經(jīng)紊亂、生育力下降等繁殖疾病 ［2］，在母豬上則表現(xiàn)為排卵率、發(fā)情率、產(chǎn)仔數(shù)均降低 ［3］。研究表明，飼糧能量限制引起血清代謝底物變化，促性腺激素釋放激素（GnRH）神經(jīng)元感知后，導(dǎo)致促黃體素（luteinizing hormone，LH）脈沖受限，從而降低卵母細(xì)胞成熟率 ［4］。Zhou等 ［5］對后備母豬飼喂能量水平為112．5%NRC推薦水平飼糧，第2情期第19天屠宰，發(fā)現(xiàn)大于4 mm的卵泡數(shù)較低能量（能量水平為87．5%NRC推薦水平飼糧）飼喂組多。給泌乳期母豬飼喂凈能為44 MJ／d的飼糧，下一情期的排卵率高于凈能為33 MJ／d飼糧飼喂組 ［6］?？梢姡芰繉β殉舶l(fā)育的影響不僅表現(xiàn)在其飼喂期間，而且對下一生產(chǎn)周期也起著至關(guān)重要的調(diào)控作用。AMPK作為一個調(diào)節(jié)能量狀態(tài)的異源三聚體蛋白激酶，包括催化亞基α（PRKAA1、PRKAA2）和調(diào)節(jié)亞基β（PRK?AB1、PRKAB2）、γ（PRKAG1、PRKAG2、PRKAG3） ［7］。細(xì)胞能量狀態(tài)出現(xiàn)異常或處于應(yīng)激、缺氧狀態(tài)將會導(dǎo)致一磷腺苷酸（AMP）含量增加，促使AMP與AMPK的調(diào)節(jié)亞基γ結(jié)合，產(chǎn)生變構(gòu)效應(yīng)，最終AMPK被激活 ［8］。研究表明，不同物種（豬、羊、牛、兔）卵巢均有AMPK存在 ［9］。多種因素［葡萄糖、胰島素樣生長因子－1（insulin?like growth factor?1，IGF?1）、促卵泡素（follicle stimula?ting hormone，F(xiàn)SH）、脂聯(lián)素］可通過激活或抑制AMPK調(diào)節(jié)能量平衡，進(jìn)而調(diào)控卵巢發(fā)育。

1 卵巢的發(fā)育

卵巢是決定雌性動物繁殖力的動態(tài)發(fā)育器官，其卵母細(xì)胞、卵泡、顆粒細(xì)胞經(jīng)歷著不同發(fā)育階段的多樣轉(zhuǎn)化。原始生殖細(xì)胞遷移至生殖脊形成卵原細(xì)胞，歷經(jīng)初級卵母細(xì)胞、次級卵母細(xì)胞、成熟卵母細(xì)胞等復(fù)雜變化為雌性哺乳動物排卵提供必要條件。卵泡是為卵母細(xì)胞生存、發(fā)育提供必要環(huán)境的組織，隨著卵母細(xì)胞的發(fā)育也經(jīng)歷了原始卵泡、初級卵泡、竇前卵泡、竇狀卵泡和成熟卵泡的復(fù)雜過程。顆粒細(xì)胞作為為卵母細(xì)胞提供代謝底物的關(guān)鍵組織，在發(fā)揮作用的過程中其形態(tài)和層數(shù)也發(fā)生著變化，單層扁平的顆粒細(xì)胞隨著其發(fā)育的進(jìn)行變?yōu)榱⒎叫?，隨后層數(shù)逐漸增加直至最終的多層。

2 AMPK對卵巢發(fā)育的影響

卵巢內(nèi)外的許多因子對其復(fù)雜發(fā)育過程進(jìn)行調(diào)控。而在卵巢發(fā)育為具有繁殖性能器官的過程中，需要能量的產(chǎn)生和消耗，AMPK作為調(diào)節(jié)細(xì)胞能量代謝狀態(tài)的中心物質(zhì)，是調(diào)控哺乳動物卵巢發(fā)育的關(guān)鍵因子。前人研究發(fā)現(xiàn)，分離獲得20～23日齡的小鼠卵母細(xì)胞，用二丁酰環(huán)腺苷酸、AMPK失活劑（dead kinase，D139A）、AMPK激活劑（5?aminoimidazole?4?carboxamide1?β?D?ribofurano?side，AICAR）進(jìn)行處理，結(jié)果表明，AICAR組生發(fā)泡破裂（germinal vesicle breakdown，GVBD）率顯著高于其他組（高于其他組23%～71%），二丁酰環(huán)腺苷酸組GVBD率也顯著高于其他2組 ［10］。對豬卵母細(xì)胞進(jìn)行脂聯(lián)素處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AMPK磷酸化水平升高，未成熟卵母細(xì)胞數(shù)量顯著降低（12．90 vs．23．04） ［11］。以上研究表明，AMPK可提高卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的恢復(fù)能力和卵母細(xì)胞的成熟率。而另有證據(jù)表明AMPK抑制卵泡發(fā)育。Gallet等 ［12］探討了AMPK磷酸化水平對羊卵泡發(fā)育的影響，以相同劑量［10 mmol／（L·h）］的生理鹽水、葡萄糖處理卵泡，發(fā)現(xiàn)生理鹽水組AMPK磷酸化水平為68．3%，葡萄糖組AMPK磷酸化水平為45．1%，而低磷酸化水平組卵泡總數(shù)（36．40± 5．48 vs．16．70±2．60）和小卵泡數(shù)（28．20±6．40 vs．10．00±2．24）顯著高于高磷酸化水平組，同時發(fā)現(xiàn)2組之間的卵泡凋亡也有差異（4．40±0．51 vs．3．70±0．92）。對牛顆粒細(xì)胞進(jìn)行AMPK激活劑——二甲雙胍（metformin）處理以提高AMPK磷酸化水平，利用3H－胸腺嘧啶核苷摻入法測定顆粒細(xì)胞增殖狀況，發(fā)現(xiàn)AMPK抑制了顆粒細(xì)胞增殖（100%vs．80%） ［13］。

綜上，AMPK對卵巢的發(fā)育起著至關(guān)重要的作用，活化的AMPK對卵母細(xì)胞減數(shù)分裂和成熟起著重要的促進(jìn)作用，但是對卵泡、顆粒細(xì)胞的發(fā)育卻有一定的負(fù)面影響。

3 AMPK對卵巢發(fā)育的調(diào)節(jié)途徑

3．1 介導(dǎo)葡萄糖調(diào)控卵巢發(fā)育

哺乳動物卵巢中，不同類型的代謝應(yīng)激、藥物等均可改變AMP、二磷酸腺苷（ADP）與三磷酸腺苷（ATP）的比值，導(dǎo)致AMPK被激活。近期研究發(fā)現(xiàn)，葡萄糖作為一種營養(yǎng)物質(zhì)，調(diào)控卵母細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)。葡萄糖濃度過高，導(dǎo)致ATP水平在排卵期顯著降低 ［14］，激活A(yù)MPK，影響排卵率，即葡萄糖為典型的影響AMPK活性，抑制分解代謝產(chǎn)生ATP，進(jìn)而調(diào)控卵巢發(fā)育途徑的關(guān)鍵因素。Ratchford等 ［15］考察了高濃度葡萄糖對鼠卵母細(xì)胞發(fā)育能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)糖尿病鼠卵母細(xì)胞中AMP與ATP比值增加，促進(jìn)了卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)。這可能是由于高糖狀態(tài)下細(xì)胞受到應(yīng)激，ATP消耗增加，激活A(yù)MPK所致。

對經(jīng)典的人卵巢癌上皮細(xì)胞系SKOV3、TOV21G、OVCA429進(jìn)行葡萄糖饑餓、2－脫氧－D－葡萄糖（2?deoxy?D?glucose，2DG）處理，結(jié)果顯示，葡萄糖饑餓組、2DG組AMPK磷酸化水平上調(diào)，隨后對3種細(xì)胞系分別進(jìn)行AMPK激活劑AIC?AR、二甲雙胍處理，發(fā)現(xiàn)AMPK磷酸化水平進(jìn)一步上調(diào) ［16］，進(jìn)而誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞死亡。這暗示著低糖狀態(tài)下，為了滿足機(jī)體自身生長需要，糖分解過程受阻，導(dǎo)致AMPK磷酸化水平改變，促進(jìn)機(jī)體分解代謝，進(jìn)而影響卵巢發(fā)育。

值得注意的是，長期膳食高濃度葡萄糖產(chǎn)生大量乳酸鹽，導(dǎo)致卵巢生理功能紊亂，產(chǎn)生卵巢癌。Priebe等 ［16］探討卵巢癌細(xì)胞治療方法時發(fā)現(xiàn)葡萄糖饑餓激活A(yù)MPK，進(jìn)而增加了卵巢癌細(xì)胞的死亡。這就提示治療卵巢癌可以進(jìn)行AMPK激活劑治療，使依賴葡萄糖生長和存活的癌細(xì)胞凋亡。

以上研究表明短期膳食高濃度葡萄糖可改變ATP含量，進(jìn)而激活A(yù)MPK，促進(jìn)卵母細(xì)胞發(fā)育。但是長期的高濃度葡萄糖卻可導(dǎo)致卵巢疾病，同時葡萄糖缺乏也可提高AMPK磷酸化水平，影響卵巢發(fā)育。盡管葡萄糖濃度不論高低均會激活A(yù)MPK，但是高濃度葡萄糖介導(dǎo)AMPK活化對卵母細(xì)胞發(fā)育、低濃度葡萄糖介導(dǎo)AMPK活化對癌細(xì)胞增殖抑制均起正調(diào)控效應(yīng)，其具體的機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。

3．2 介導(dǎo)IGF?1調(diào)控卵巢發(fā)育

IGF?1對哺乳動物卵巢細(xì)胞類固醇激素分泌和增殖起著關(guān)鍵作用 ［17］。AMPK信號通路作為調(diào)節(jié)細(xì)胞能量代謝狀態(tài)的中心環(huán)節(jié)，可增加卵巢對IGF?1的敏感性 ［18］。Tosca等 ［19］研究發(fā)現(xiàn)，在牛顆粒細(xì)胞中，二甲雙胍可通過激活A(yù)MPK降低類固醇的分泌，同時還可治療與胰島素抵抗密切相關(guān)的多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）。這主要是由于胰島素可刺激IGF?1的合成，進(jìn)而激活哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammali?an target of rapamycin，mTOR），進(jìn)行合成代謝，消耗ATP，從而抑制AMPK活化，即二甲雙胍添加激活A(yù)MPK可達(dá)到治療繁殖疾病的目的。卵巢顆粒細(xì)胞表達(dá)IGF?1受體（IGF?1R），適宜濃度的IGF?1可通過與其受體結(jié)合，抑制AMPK活化，上調(diào)3β－羥類固醇脫氫酶（3βHSD）、類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白（steroidogenic acute regulatory protein，StAR）、P450scc的表達(dá)以及細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（mitogen?activated protein kinase／extracellular?regu?lated kinase，ERK）磷酸化，從而提高卵巢細(xì)胞孕酮（P）和雌二醇（E2）的分泌 ［20］。與此觀點一致的研究發(fā)現(xiàn)IGF?1處理的顆粒細(xì)胞（分別處理1、5 min），AMPK磷酸化水平降低（分別降低10%、30%），增加P的分泌 ［21］，影響卵巢發(fā)育。AMPK介導(dǎo)IGF?1調(diào)控卵巢發(fā)育主要是通過調(diào)控IGF?1R信號通路的磷酸化。Reverchon等 ［22］發(fā)現(xiàn)10和100 ng／mL脂肪細(xì)胞因子趨化素（chemerin）處理人的卵巢顆粒細(xì)胞顯著降低了P和E2分泌，同時IGF?1R表達(dá)上調(diào)，AMPK磷酸化水平增加；而缺乏IGF?1組進(jìn)行趨化素處理，P和E2分泌無變化，但是2種處理均抑制了細(xì)胞的增殖。這就說明趨化素活化AMPK導(dǎo)致細(xì)胞增殖受阻需要IGF?1作用。AMPK介導(dǎo)IGF?1異常時會導(dǎo)致卵巢發(fā)生疾病。與代謝異常密切相關(guān)的高胰島素水平與AMPK有密切聯(lián)系。妊娠前的高胰島素水平，將導(dǎo)致卵母細(xì)胞發(fā)育能力降低及卵泡液內(nèi)環(huán)境紊亂，可能是通過對胰島素、IGF?1敏感的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（glucose transporters 4，SLC2A4）調(diào)節(jié)葡萄糖代謝，使卵巢處于較高濃度的葡萄糖下，進(jìn)而影響AMPK的磷酸化，導(dǎo)致卵巢處于疾病狀態(tài)。

總之，AMPK介導(dǎo)IGF?1為卵巢細(xì)胞類固醇的分泌和細(xì)胞的增殖提供條件，在此過程中AMPK可調(diào)節(jié)IGF?1R信號通路調(diào)控卵巢發(fā)育，同時AMPK介導(dǎo)IGF?1異常將會導(dǎo)致卵巢疾病。因此，卵巢中AMPK介導(dǎo)IGF?1受到機(jī)體復(fù)雜協(xié)調(diào)的調(diào)控。

3．3 介導(dǎo)FSH調(diào)控卵巢發(fā)育

FSH可通過復(fù)雜的信號通路增加顆粒細(xì)胞的有絲分裂，對卵泡正常生長發(fā)育起著關(guān)鍵作用。近期有研究表明，F(xiàn)SH刺激顆粒細(xì)胞增殖主要是通過抑制AMPK的活化，暗示AMPK是調(diào)節(jié)卵巢細(xì)胞增殖功能的關(guān)鍵信號 ［23］。Kayampilly等 ［23］體外培養(yǎng)鼠的顆粒細(xì)胞時發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SH增加有絲分裂數(shù)目，主要是通過AMPK依賴途徑降低細(xì)胞周期抑制蛋白P27（cell cycle inhibitor protein，p27kip）、增加細(xì)胞周期蛋白D2（cyclin D2）表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。若雌性動物機(jī)體處于高雄激素狀態(tài)下，雄激素代謝產(chǎn)物5α－雙氫睪酮（5α?dihydrotestos?terone，DHT）可提高AMPK磷酸化水平，而且抑制ERK磷酸化水平，導(dǎo)致FSH對AMPK的抑制作用失效，使顆粒細(xì)胞增殖受到抑制，同時該學(xué)者還發(fā)現(xiàn)ERK可能是AMPK下游因子 ［24］。此外，也有研究報道AMPK磷酸化可在不同程度上影響mTOR，而mTOR在介導(dǎo)FSH影響哺乳動物細(xì)胞增殖方面起著重要作用 ［25］，這說明FSH與AMPK作用，除了通過ERK調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖外，還可能通過其他途徑進(jìn)行調(diào)控，總之，F(xiàn)SH可抑制AMPK磷酸化水平，在卵巢顆粒細(xì)胞增殖方面起著至關(guān)重要的作用，但在一定條件下FSH對AMPK的抑制作用無應(yīng)答。因此，關(guān)于AMPK是如何與FSH相互協(xié)調(diào)促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

3．4 介導(dǎo)脂聯(lián)素調(diào)控卵巢發(fā)育

脂聯(lián)素是脂肪細(xì)胞分泌的可調(diào)節(jié)卵巢發(fā)育的一種重要的細(xì)胞因子 ［26］，研究表明不同哺乳動物（豬、羊、牛、兔、人）卵巢均有脂聯(lián)素表達(dá)，但不同物種其存在部位有差異 ［9］。卵巢細(xì)胞上具有脂聯(lián)素受體（AdipoR）1和AdipoR2 ［27］。脂聯(lián)素通過與其受體結(jié)合調(diào)節(jié)AMPK磷酸化影響卵巢顆粒細(xì)胞增殖和卵母細(xì)胞成熟。

Chabrolle等 ［28］通過對鼠顆粒細(xì)胞添加5 mg／mL重組脂聯(lián)素，發(fā)現(xiàn)3βHSD、p450scc和StAR等與類固醇合成相關(guān)的關(guān)鍵酶以及類固醇的表達(dá)與對照組無差異，但P、E 2的含量和AMPK磷酸化水平提高，同時對顆粒細(xì)胞數(shù)目有影響，這可能是由于脂聯(lián)素通過改變AMPK磷酸化水平，導(dǎo)致卵巢類固醇合成過程中關(guān)鍵酶的敏感性增強(qiáng)。也有觀點表明，脂聯(lián)素可通過調(diào)節(jié)AMPK磷酸化，增加IGF?1誘導(dǎo)IGF?1Rβ亞基酪氨酸磷酸化，促進(jìn)P、E2的生成，即脂聯(lián)素在顆粒細(xì)胞中可增加IGF?1誘導(dǎo)類固醇的分泌。進(jìn)行重組脂聯(lián)素處理，可使GnRH受體轉(zhuǎn)錄水平降低，進(jìn)一步導(dǎo)致LH分泌降低，同時發(fā)現(xiàn)AMPK磷酸化水平上調(diào)，即脂聯(lián)素可通過調(diào)節(jié)AMPK磷酸化水平，抑制LH釋放調(diào)節(jié)卵巢發(fā)育 ［29］。

Ledoux等 ［13］體外培養(yǎng)豬卵泡，濃度為10～25 g／mL的脂聯(lián)素增加AMPK磷酸化，進(jìn)而調(diào)節(jié)類固醇合成中關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，而且AMPK磷酸化水平與CYP19 mRNA表達(dá)量呈現(xiàn)相反趨勢，可能是由于脂聯(lián)素調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育的不僅僅是通過AMPK信號途徑，或者由于培養(yǎng)基中沒有添加葡萄糖致使卵泡發(fā)育過程中糖分解過程受阻，基因表達(dá)出現(xiàn)異常。另外，體外受精試驗發(fā)現(xiàn)，脂聯(lián)素介導(dǎo)AMPK磷酸化，對卵母細(xì)胞成熟起重要作用 ［11］。10 μg／mL脂聯(lián)素提高AMPK磷酸化，增加豬大卵泡中卵母細(xì)胞的成熟率，但是奇怪的是脂聯(lián)素對小卵泡中卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂沒有影響，具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探究?？傊?，AMPK介導(dǎo)脂聯(lián)素對卵母細(xì)胞成熟起著不可忽視的作用。

綜上，AMPK介導(dǎo)脂聯(lián)素影響卵巢發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)，調(diào)控卵母細(xì)胞的成熟和顆粒細(xì)胞的增殖。同時脂聯(lián)素調(diào)節(jié)AMPK磷酸化后，可影響IGF?1R、LH的分泌，從而對卵巢發(fā)育產(chǎn)生一定影響，但其具體的調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。這一問題的研究將對闡明哺乳動物卵巢發(fā)育的分子機(jī)制具有重要的理論意義。

4 小 結(jié)

細(xì)胞能量代謝中心物質(zhì)AMPK作為調(diào)控卵巢發(fā)育的關(guān)鍵因子，在卵巢發(fā)育過程中起著不可忽視的作用。葡萄糖、脂聯(lián)素可促進(jìn)AMPK磷酸化，而IGF?1、FSH則抑制AMPK磷酸化。磷酸化的AMPK促進(jìn)卵母細(xì)胞發(fā)育，但對卵泡、顆粒細(xì)胞發(fā)育起負(fù)調(diào)控作用。但是，目前以動物為模型研究體內(nèi)AMPK的調(diào)控作用，主要集中于下丘腦中AMPK對采食量和情期啟動的影響等方面，而體內(nèi)卵巢上表達(dá)的AMPK如何影響卵巢發(fā)育的相關(guān)內(nèi)容未見報道，值得探究。同時，目前AMPK調(diào)控卵巢細(xì)胞的分子機(jī)制研究較少，有關(guān)AMPK介導(dǎo)葡萄糖、IGF?1、FSH和脂聯(lián)素調(diào)控卵巢類固醇的分泌以及細(xì)胞增殖和凋亡的具體調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。特別是高、低濃度葡萄糖均可激活A(yù)MPK的具體分子機(jī)制以及FSH在一定條件下抑制AMPK應(yīng)答失效的分子機(jī)制需更深入的探究。