99Tc-MDP抑制膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠DKK1表達(dá)的研究

顧志琴，王美美

(1.東南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210009； 2.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，江蘇 南京 210009)

·論 著·

99Tc-MDP抑制膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠DKK1表達(dá)的研究

顧志琴1，王美美2

(1.東南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210009； 2.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，江蘇 南京 210009)

目的:觀察膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(CIA)大鼠DKK1的表達(dá)及99锝-亞甲基二磷酸鹽(99Tc-MDP，商品名：云克)對(duì)骨侵蝕的治療作用，探討云克治療骨侵蝕的可能作用機(jī)制。方法:建立CIA大鼠模型，分為模型組、甲氨蝶呤(MTX)組、云克小劑量組、云克大劑量組；通過Larsen評(píng)分和病理組織形態(tài)學(xué)評(píng)分評(píng)價(jià)骨質(zhì)破壞；ELISA法檢測(cè)關(guān)節(jié)液和血清DKK1、腫瘤壞死因子(TNF)-α水平；免疫組化法檢測(cè)踝關(guān)節(jié)區(qū)滑膜及軟骨的DKK1、TNF-α表達(dá)；采用方差分析、t檢驗(yàn)和相關(guān)分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。結(jié)果:云克干預(yù)組和MTX組大鼠骨質(zhì)破壞，血清和關(guān)節(jié)液DKK1、TNF-α水平，踝關(guān)節(jié)區(qū)滑膜及軟骨DKK1、TNF-α表達(dá)均低于模型組(P<0.05)；云克干預(yù)組骨質(zhì)破壞、血清和關(guān)節(jié)液DKK1水平、踝關(guān)節(jié)區(qū)滑膜及軟骨DKK1表達(dá)低于MTX組(P<0.05)，但云克組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；云克干預(yù)組和MTX組血清和關(guān)節(jié)液TNF-α水平、踝關(guān)節(jié)區(qū)滑膜及軟骨TNF-α表達(dá)組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；相關(guān)性分析顯示模型組及藥物干預(yù)組大鼠血清和關(guān)節(jié)液DKK1與TNF-α水平呈正相關(guān)(r=0.439，P<0.05)。結(jié)論:云克可以減輕CIA大鼠骨侵蝕，療效優(yōu)于MTX，可能是通過直接降低DKK1或通過抑制TNF-α間接下調(diào)DKK1，增強(qiáng)Wnt信號(hào)通路保護(hù)骨侵蝕。

膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎； 骨侵蝕； DKK1； 腫瘤壞死因子-α；99锝-亞甲基二磷酸鹽

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性炎癥性疾病，以滑膜炎癥及骨侵蝕為特征。進(jìn)展性的骨侵蝕是RA區(qū)別于其他關(guān)節(jié)炎最主要的特征，發(fā)生較早，致殘率高，并缺乏伴隨的新骨形成[1]。最新研究發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞增殖活化主要由Wnt信號(hào)通路調(diào)節(jié)，包括骨形成和骨重塑，dickkopf-1(DKKl)作為Wnt信號(hào)通路的抑制劑被認(rèn)為是骨侵蝕的關(guān)鍵因素[2]。另有研究[3-4]表明腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)可以增加DKK1表達(dá)，且TNF-α是RA炎癥因子網(wǎng)絡(luò)中主要的炎癥因子，從而使骨形成進(jìn)一步減少，骨破壞增多。99锝-亞甲基二磷酸鹽(99Tc-MDP，商品名：云克)是我國自主研發(fā)的新型的抗風(fēng)濕藥，目前臨床用于治療RA效果顯著，尤其是在保護(hù)骨侵蝕方面[5]，作用機(jī)制尚不完全明確，甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)為傳統(tǒng)DMARDs類藥物，是經(jīng)典的治療RA藥物及聯(lián)合用藥的基礎(chǔ)藥。本研究采用膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis，CIA)大鼠模型觀察CIA大鼠DKK1的表達(dá)，及不同劑量云克治療CIA大鼠骨侵蝕的作用，并探討云克治療骨侵蝕的可能作用機(jī)制。

1 材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康清潔級(jí)雄性(Sprague-Dawley，SD)大鼠55只，體重160～180g，東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供并飼養(yǎng)，合格證號(hào)為SYXK(蘇)2010-0004。

1.2 試劑及儀器

雞Ⅱ型膠原、完全弗氏佐劑(Sigma公司)，99Tc-MDP(成都云克藥業(yè)有限責(zé)任公司)，MTX注射液(上海華聯(lián)制藥廠)，大鼠TNF-α、DKK1酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒(ADL公司)，兔抗大鼠TNF-α一抗(NOVUS生物公司)，兔抗大鼠DKK1一抗(Santa Cruz公司)，免疫組化SP試劑盒、羊抗兔二抗和二氨基聯(lián)苯胺(3，3′-diaminobenzidine，DAB)顯色試劑盒(北京中杉金橋公司)；切片機(jī)(德國LEICA公司)、光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)、X線攝片機(jī)(德國GE公司)、酶標(biāo)儀(美國Biorad公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1CIA大鼠模型建立 健康雄性SD大鼠伺養(yǎng)1周后隨機(jī)選取8只作為空白組，其余用于造模。將雞Ⅱ型膠原30mg溶于0.1mol·L-1醋酸15ml中，4℃過夜后與15ml完全弗氏佐劑充分乳化，制成1g·L-1膠原乳劑。隨后于大鼠尾背部及根部多點(diǎn)皮下注射，每只0.5ml，1周后再次皮下等量注射?？瞻捉M皮下注射等量體積的生理鹽水。

1.3.2分組與處理 初次免疫后28d對(duì)大鼠四肢關(guān)節(jié)炎進(jìn)行評(píng)分，關(guān)節(jié)炎指數(shù)(arthritis index，AI)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：0分，無紅腫；1分，足趾關(guān)節(jié)紅腫；2分，趾關(guān)節(jié)、足趾部均紅腫；3分，踝關(guān)節(jié)以下均紅腫；4分，包括踝關(guān)節(jié)全部紅腫。選取評(píng)分≥6分大鼠隨機(jī)分為模型組、MTX組、云克小劑量組、云克大劑量組，每組8只。MTX組：尾靜脈注射MTX2.0mg·kg-1·周-1；云克小劑量組：尾靜脈注射云克2.0mg·kg-1·d-1；云克大劑量組：尾靜脈注射云克4.0mg·kg-1·d-1；空白組和模型組：每天尾靜脈注射與云克大劑量組等體積的生理鹽水。各組持續(xù)注射3周。MTX劑量和云克小劑量根據(jù)人和大鼠的劑量轉(zhuǎn)換[公式：B種動(dòng)物的劑量(mg·kg-1)=W×A種動(dòng)物的劑量(mg·kg-1)，W為折算系數(shù)]，劑量相當(dāng)于人體用量的10倍。初次免疫28d后每周行眶周取血2ml，離心后取上清液于-80℃保存。

1.3.3標(biāo)本留取 給藥結(jié)束后處死所有大鼠，用1ml生理鹽水沖洗膝關(guān)節(jié)腔留取膝關(guān)節(jié)液，-80℃保存，取右后踝關(guān)節(jié)置于10%中性福爾馬林溶液固定，EDTA溶液脫鈣后石蠟包埋，常溫保存。

1.3.4X線評(píng)分 給藥結(jié)束后，所有大鼠在水合氯醛麻醉下對(duì)右后踝關(guān)節(jié)進(jìn)行X線攝片(電壓40kV，電流7mA，曝光時(shí)間0.04ms)。踝關(guān)節(jié)骨質(zhì)破壞程度評(píng)分采用Larsen評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分為正常；1分為輕度異常，包括1處或多處關(guān)節(jié)周圍軟組織腫脹，骨質(zhì)疏松和輕微關(guān)節(jié)間隙狹窄；2分有明顯早期異常，包括明顯骨質(zhì)侵蝕改變，有或沒有關(guān)節(jié)間隙狹窄；3分為中度關(guān)節(jié)破壞；4分為重度關(guān)節(jié)破壞；5分顯示多個(gè)異常，關(guān)節(jié)間隙消失。

1.3.5病理組織形態(tài)學(xué)觀察 包埋好的右踝關(guān)節(jié)石蠟標(biāo)本切片、脫水、蘇木素-伊紅(HE)染色，觀察并攝片，根據(jù)踝關(guān)節(jié)病理組織形態(tài)學(xué)，按0～3分標(biāo)準(zhǔn)分別對(duì)滑膜炎細(xì)胞浸潤(rùn)、軟骨及骨破壞情況進(jìn)行評(píng)分，評(píng)價(jià)右踝關(guān)節(jié)滑膜炎及骨質(zhì)破壞程度。

1.3.6ELISA法檢測(cè)血清及關(guān)節(jié)液TNF-α和DKK1水平 將-80℃保存的血清及關(guān)節(jié)液標(biāo)本室溫中復(fù)融混勻后5000r·min-1離心5min，取上清液按試劑說明書進(jìn)行試驗(yàn)，酶標(biāo)儀波長(zhǎng)設(shè)定為450nm，以標(biāo)準(zhǔn)品的OD值為橫坐標(biāo)、濃度為縱坐標(biāo)做出線性曲線方程，從而將樣品的OD值換算成對(duì)應(yīng)的濃度。

1.3.7免疫組化法檢測(cè)踝關(guān)節(jié)區(qū)滑膜及軟骨的TNF-α和DKK1表達(dá) 右后踝關(guān)節(jié)石蠟標(biāo)本切片、脫蠟、微波修復(fù)抗原，H2O2酶內(nèi)源性阻斷，動(dòng)物血清封閉，滴加TNF-α和DKK1一抗4℃過夜后加入二抗、SP溶液，經(jīng)DAB顯色、蘇木精復(fù)染、分化、脫水、透明和封片后觀察并攝片，采用圖像分析系統(tǒng)Image-Pro Plus 6.0對(duì)組織中滑膜及軟骨區(qū)域的TNF-α和DKK1表達(dá)進(jìn)行半定量分析，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野，并以10個(gè)視野的平均光密度值代表TNF-α和DKK1表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，若滿足正態(tài)性和方差齊性，組間檢驗(yàn)采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；相關(guān)性分析采用Spearman檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況觀察

正常大鼠造模前飲食正常、活動(dòng)自如、體重增長(zhǎng)速度正常、毛發(fā)有光澤、反應(yīng)靈敏，造模后出現(xiàn)不同程度的攝食及活動(dòng)減少、毛發(fā)枯燥及體重減輕、反應(yīng)遲鈍，初次免疫14d后相繼出現(xiàn)關(guān)節(jié)紅腫、皮膚緊繃、活動(dòng)受限，以雙后足受累為主，逐漸加重，部分出現(xiàn)關(guān)節(jié)功能障礙，藥物治療后關(guān)節(jié)腫脹、活動(dòng)受限均有所減輕，攝食及活動(dòng)好轉(zhuǎn)，空白組無上述異常改變。

2.2 AI評(píng)分

初次免疫28d后對(duì)造模大鼠進(jìn)行AI評(píng)分，藥物干預(yù)前模型、MTX、云克小劑量及云克大劑量組AI值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，藥物干預(yù)后1周(35 d)云克大小劑量組AI值顯著低于模型組及MTX組(P<0.05)，云克大小劑量組組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，藥物干預(yù)后3周(49 d)MTX組AI值顯著低于模型組(P<0.05)，見表1。

a與模型組比較，P<0.05； b與MTX組比較，P<0.05

2.3 X線評(píng)分

空白組大鼠關(guān)節(jié)間隙清晰，骨關(guān)節(jié)面完整，骨密度均勻，無關(guān)節(jié)骨質(zhì)破壞。與空白組相比，模型組及藥物干預(yù)組均有不同程度的骨質(zhì)破壞，其中模型組大鼠骨質(zhì)破壞明顯，部分大鼠關(guān)節(jié)間隙狹窄甚至消失。MTX組Larsen評(píng)分低于模型組(P<0.05)。云克大小劑量組Larsen評(píng)分均低于模型組及MTX組(P<0.05)，云克大小劑量組組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

a.正常組； b.模型組； c.MTX組； d.云克小劑量組； e.云克大劑量組

圖1 各組大鼠右后踝關(guān)節(jié)X線表現(xiàn)

Fig 1 The right hind ankle X-ray appearances of all groups rats

2.4 病理組織形態(tài)學(xué)觀察

空白組踝關(guān)節(jié)面完整，滑膜細(xì)胞無增生，軟骨細(xì)胞排列整齊，骨組織無破壞。模型組踝關(guān)節(jié)區(qū)滑膜細(xì)胞有中至重度的增生、變性或壞死，滑膜組織內(nèi)有中度以上的纖維組織增生和炎細(xì)胞浸潤(rùn)，踝關(guān)節(jié)骨和軟骨受到明顯破壞，甚至部分關(guān)節(jié)腔消失。藥物干預(yù)組較模型組病理組織形態(tài)學(xué)評(píng)分均有不同程度減低(P<0.05)，且云克大小劑量組滑膜炎、骨和軟骨破壞均較MTX組輕(P<0.05)，云克大小劑量組組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

a.空白組; b.模型組; c.MTX組； d.云克小劑量組; e.云克大劑量組

圖2 各組大鼠右后踝關(guān)節(jié)病理學(xué)表現(xiàn) HE×100

Fig 2 Pathological results of the right hind ankle joints in different groups(HE ×100)

2.5 ELISA法檢測(cè)血清及關(guān)節(jié)液TNF-α和DKK1水平

2.5.1血清及關(guān)節(jié)液中DKK1水平 初次免疫28d(給藥前)CIA大鼠血清和關(guān)節(jié)液DKK1的水平均較空白組顯著增加(P<0.05)，MTX組血清DKK1水平于給藥2周后顯著低于模型組(P<0.05)，云克大小劑量組血清DKK1水平于給藥1周后顯著低于模型組及MTX組(P<0.05)，云克干預(yù)組組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。MTX組關(guān)節(jié)液DKK1水平低于模型組(P<0.05)，云克大小劑量組關(guān)節(jié)液DKK1水平顯著低于模型組和MTX組(P<0.05)，云克大小劑量組組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

2.5.2血清及關(guān)節(jié)液中TNF-α水平 初次給藥28d(給藥前)CIA大鼠血清和關(guān)節(jié)液TNF-α水平均較空白組顯著增加(P<0.05)，藥物干預(yù)組血清TNF-α水平給藥1周后均明顯低于模型組(P<0.05)，且各藥物干預(yù)組組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。藥物干預(yù)組關(guān)節(jié)液TNF-α水平明顯低于模型組(P<0.05)，且藥物組組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

a 與正常組比較，P<0.05； b 與模型組比較，P<0.05； c 與MTX組比較，P<0.05

a 與正常組比較，P<0.05； b 與模型組比較，P<0.05

2.5.3模型組及藥物干預(yù)組血清及關(guān)節(jié)液DKK1水平與TNF-α水平的相關(guān)性分析 模型、MTX、云克小劑量及云克大劑量組血清和關(guān)節(jié)液DKK1水平與TNF-α水平呈正相關(guān)(r=0.439，P<0.05)。見圖3。

2.6 免疫組化法檢測(cè)踝關(guān)節(jié)區(qū)TNF-α和DKK1表達(dá)

免疫組化顯示陽性表達(dá)區(qū)域呈棕黃色，TNF-α和DKK1陽性表達(dá)主要定位于滑膜細(xì)胞及軟骨細(xì)胞胞漿?？瞻捉M中踝關(guān)節(jié)區(qū)滑膜及軟骨僅見少量陽性表達(dá)，模型組陽性表達(dá)明顯增多，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件行半定量分析，比較各組平均光密度(mean optical density，MOD)顯示，與模型組相比，藥物干預(yù)組踝關(guān)節(jié)區(qū)滑膜及軟骨DKK1、TNF-α表達(dá)均顯著降低(P<0.05)，云克大小劑量組踝關(guān)節(jié)區(qū)滑膜及軟骨DKK1表達(dá)低于MTX組(P<0.05)，云克大小劑量組組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；云克大小劑量組、MTX組踝關(guān)節(jié)區(qū)滑膜及軟骨TNF-α表達(dá)組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4，圖4、5。

圖3 DKK1和TNF-α的相關(guān)性分析

Fig 3 The correlation analysis of synovial fluid and serum levels of DKK1 and TNF-αin model and drugs intervention groups

a 與正常組比較，P<0.05； b 與模型組比較，P<0.05； c 與MTX組比較，P<0.05

3 討 論

RA本身不僅可以引起局部的骨侵蝕，還可以導(dǎo)致全身性的骨質(zhì)丟失，為骨質(zhì)疏松性骨折顯著性的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。骨侵蝕的發(fā)生一方面是因?yàn)槠乒羌?xì)胞過度增殖活化，另一方面，越來越多的研究[6]發(fā)現(xiàn)RA的骨形成存在缺陷，即破骨細(xì)胞增殖活化能力增強(qiáng)，但成骨細(xì)胞并沒有相應(yīng)活化增多，從而造成骨質(zhì)減少，導(dǎo)致骨侵蝕。

DKK1是一種定位于胞漿的Wnt經(jīng)典信號(hào)通路的抑制劑，通過與共受體低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5(low density lipoprotein receptor related protein-5，LRP5)結(jié)合抑制經(jīng)典Wnt信號(hào)通路。Wnt信號(hào)通路是調(diào)節(jié)骨形成的重要信號(hào)通路，并由經(jīng)典Wnt/β-catenin發(fā)揮主要作用，Wnt蛋白激活經(jīng)典Wnt信號(hào)通路后，通過胞內(nèi)

a.空白組； b.模型組； c.MTX組； d.云克小劑量組; e.云克大劑量組

圖4 DKK1在踝關(guān)節(jié)區(qū)滑膜及軟骨的表達(dá) 免疫組化×200

Fig 4 Expression of DKK1 in synovial membrane and cartilage of ankle joints(immunohistostaining ×200)

a.空白組； b.模型組； c.MTX組； d.云克小劑量組; e.云克大劑量組

圖5 TNF-α在踝關(guān)節(jié)區(qū)滑膜及軟骨的表達(dá) 免疫組化×200

Fig 5 Expression of TNF-αin synovial membrane and cartilage of ankle joints(immunohistostaining ×200)

信號(hào)傳導(dǎo)活化核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，通過促進(jìn)干細(xì)胞更新刺激成骨前體細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化，抑制成骨細(xì)胞及骨細(xì)胞凋亡等機(jī)制增加骨量。研究[7]表明，經(jīng)典Wnt/β-catenin通路參與了RA的發(fā)病。LRP5失去功能的突變將導(dǎo)致骨密度降低、骨脆性增加[8]，LRP5表達(dá)增加將導(dǎo)致骨量增多[9]。另有研究[10]顯示經(jīng)典Wnt信號(hào)可以激活骨形態(tài)生成蛋白2(bone morphogenetic protein，BMP2)在成骨細(xì)胞的表達(dá)，其中BMP2是促進(jìn)骨形成和誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化最重要的細(xì)胞外信號(hào)分子之一。經(jīng)典Wnt通路不僅影響骨形成過程，還通過上調(diào)骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)表達(dá)水平及下調(diào)核因子κB受體活化因子配體(receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL)表達(dá)水平抑制骨吸收[11-12]。DKK1通過抑制經(jīng)典Wnt信號(hào)通路，使其促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖活化的功能受阻，并通過抑制Wnt信號(hào)通路阻礙其激活BMP2的功能，同時(shí)下調(diào)OPG的表達(dá)，增加RANKL表達(dá)，促進(jìn)破骨細(xì)胞活化，增加骨侵蝕。研究[13]發(fā)現(xiàn)，RA患者血清中DKK1表達(dá)水平明顯高于正常組及原發(fā)性骨質(zhì)疏松病人。

TNF-α是RA發(fā)病機(jī)制中具有重要地位的促炎癥細(xì)胞因子，可以刺激RANKL和巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor，M-CSF)表達(dá)增加，促進(jìn)破骨細(xì)胞生成，或直接通過TNF受體1誘導(dǎo)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞，促進(jìn)破骨細(xì)胞增加，導(dǎo)致骨侵蝕[1]。研究[4]發(fā)現(xiàn)TNF-α可通過TNF受體1和p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen activated protein kinase，p38MAPK)直接誘導(dǎo)DKK1表達(dá)，或通過刺激11β-羥基類固醇脫氫酶1型(11beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 1，11β-HSD1)表達(dá)間接誘導(dǎo)DKK1表達(dá)[3]，從而使骨形成減少，骨破壞增多。

云克是元素锝[99Tc]經(jīng)氯化亞錫還原后與亞甲基二膦酸(MDP)形成的螯合物。99Tc在人體內(nèi)通過得失電子而不斷清除體內(nèi)的自由基，抑制炎癥因子，MDP屬于雙膦酸鹽，有很強(qiáng)的抗骨吸收能力，可以抑制骨髓干細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞，并吸附于羥基磷灰石晶體表面，阻礙破骨細(xì)胞和骨礦化物的接觸，99Tc和MDP螯合后具有消炎止痛、抑制病理復(fù)合物、抑制TNF-α等炎癥因子骨質(zhì)破壞、延緩和修復(fù)骨侵蝕等作用[5]。研究[14-16]證實(shí)云克可抑制TNF-α、 白細(xì)胞介素6(interleukin 6，IL-6)、IL-17等炎癥因子的產(chǎn)生。亦有研究[17]顯示云克具有保護(hù)骨侵蝕功能。MTX作為改善病情抗風(fēng)濕的代表藥，主要是通過抑制TNFα、IL-17、IL-6等細(xì)胞因子而抑制炎癥反應(yīng)，從而達(dá)到治療RA、抑制骨破壞的目的[18]。

本研究采用CIA大鼠構(gòu)建RA動(dòng)物模型，研究[19]表明CIA大鼠模型的癥狀、病理學(xué)改變與RA類似，且都有針對(duì)CIA的自身免疫，受主要組織相容性復(fù)合體及相關(guān)基因控制，有熱休克蛋白的變性，是研究RA理想的動(dòng)物模型。本試驗(yàn)成功構(gòu)建CIA模型，造模大鼠相繼出現(xiàn)關(guān)節(jié)紅腫，活動(dòng)受限，部分大鼠出現(xiàn)關(guān)節(jié)功能障礙，AI評(píng)分顯示造模成功。X線攝片示模型組大鼠骨質(zhì)破壞明顯，部分出現(xiàn)關(guān)節(jié)間隙狹窄甚至消失，病理組織形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)模型組踝關(guān)節(jié)區(qū)骨和軟骨受到明顯破壞，部分關(guān)節(jié)腔消失，而藥物干預(yù)組上述骨質(zhì)破壞明顯減輕，云克大小劑量組骨質(zhì)破壞均較MTX組輕，云克大小劑量組療效差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明云克對(duì)CIA大鼠骨侵蝕有明確的保護(hù)作用，且優(yōu)于MTX，云克劑量大小對(duì)保護(hù)骨侵蝕功能無明顯影響。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)云克治療組血清及關(guān)節(jié)液中DKK1水平和踝關(guān)節(jié)區(qū)DKK1蛋白表達(dá)較模型組及MTX組均顯著性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，云克治療骨侵蝕的機(jī)制之一可能是通過抑制DKK1的表達(dá)，從而增強(qiáng)Wnt通路作用于成骨細(xì)胞的作用，且療效優(yōu)于MTX，云克大小劑量治療組組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示云克劑量大小對(duì)治療骨侵蝕的療效無明顯影響，但因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)采用2.0mg·kg-1·d-1小劑量，劑量進(jìn)一步降低對(duì)療效是否有影響沒有進(jìn)行驗(yàn)證，因而此結(jié)論具有一定的局限性。另外，與模型組相比，云克治療組可以顯著降低血清及關(guān)節(jié)液中TNF-α水平和踝關(guān)節(jié)區(qū)TNF-α蛋白表達(dá)，DKK1水平與TNF-α呈正相關(guān)，云克通過抑制TNF-α間接降低DKK1，增強(qiáng)Wnt信號(hào)通路，增加成骨合成，減少破骨生成，從而保護(hù)骨侵蝕。

綜上所述，云克可以減輕CIA大鼠骨侵蝕，療效優(yōu)于MTX，可能是通過直接降低DKK1或通過抑制TNF-α間接降低DKK1，增強(qiáng)Wnt信號(hào)通路，增加成骨合成，減少破骨生成，從而保護(hù)骨侵蝕的。

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Expression of DKK1 in collagen-induced arthritis rats and the intervention of99Tc-MDP

GU Zhi-qin1，WANG Mei-mei2

(1.SchoolofMedicine,SoutheastUniversity，Nanjing210009，China; 2.DepartmentofRheumatology，ZhongdaHospital，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China)

Objective： To observe the expression of dickkopf-1(DKKl) and the effects of99Tc-MDP on bone erosion in collagen-induced arthritis(CIA) rats， and to explore the possible treatment mechanism of99Tc-MDP. Methods: The CIA models were established by subcutaneous injection with typeⅡ collagen and complete Freud’s adjuvant to rats. CIA rats were randomly divided into 4 groups: model group， methotrexate(MTX) group， low dose99Tc-MDP group， and high dose99Tc-MDP group. Destruction of bone were assessed by Larsen score and histopathological score. The synovial fluid and serum levels of DKK1 and TNF-αwere tested by ELISA. The synovium and cartilage of ankle joints expressions of DKK1 and TNF-αwere tested by immunohistochemistry.Ttest， analysis of variance， and correlation analysis were used for statistic analysis. Results: Compared with model group， destruction of bone， synovial fluid and serum levels of DKK1 and TNF-α， and synovium and cartilage of ankle joints expressions of DKK1 and TNF-αin drugs intervention groups were significantly decreased(P<0.05). Destruction of bone， synovial fluid and serum levels of DKK1， and synovium and cartilage of ankle joints expressions of DKK1 in99Tc-MDP intervention groups were notably lower than those in MTX group(P<0.05)， and the indexes in both99Tc-MDP groups illustrated no significant difference(P>0.05). Moreover， synovial fluid and serum levels of TNF-α， and synovium and cartilage of ankle joints expressions of TNF-αin MTX group and both99Tc-MDP groups demonstrated no significant differences(P>0.05). Correlation analysis showed that synovial fluid and serum levels of DKK1 and TNF-αin model and drugs intervention groups were positively correlated(r=0.439，P<0.05). Conclusion:99Tc-MDP can reduce bone erosion of CIA rats， and the therapeutic effect is better than MTX， probably by reducing the DKK1 directly or inhibiting DKK1 to lower down TNF-αindirectly， thereby enhancing the wnt signaling pathway to protect bone erosion．

collagen-induced arthritis； bone erosion； dickkopf-1； tumor necrosis factor-α；99Tc-MDP

2015-01-30

2015-03-20

江蘇省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(BK2009276)

顧志琴(1988-)，女，江蘇泰州人，在讀碩士研究生。E-mail：guzhiqin1030@163.com

王美美 E-mail：wmm3272142@163.com

顧志琴,王美美.99Tc-MDP抑制膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠DKK1表達(dá)的研究[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2015,34(4):514-521.

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.04．005

R-332； R593.21; R593.22

A

1671-6264(2015)04-0514-08