殺傷性人工抗原提呈細(xì)胞治療小鼠皮膚移植排斥及其對治療鼠整體免疫功能的影響

李妙晨，王偉，李曉娥，房坤，吳優(yōu)，顧寧，沈傳來

(1.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 病原生物學(xué)與免疫學(xué)系，江蘇 南京 210009；2.東南大學(xué) 生物科學(xué)與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，江蘇 南京 210009)

·論 著·

殺傷性人工抗原提呈細(xì)胞治療小鼠皮膚移植排斥及其對治療鼠整體免疫功能的影響

李妙晨1，王偉1，李曉娥1，房坤2，吳優(yōu)1，顧寧2，沈傳來1

(1.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 病原生物學(xué)與免疫學(xué)系，江蘇 南京 210009；2.東南大學(xué) 生物科學(xué)與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，江蘇 南京 210009)

目的：研究殺傷性人工抗原提呈細(xì)胞(KaAPC)治療小鼠皮膚移植排斥的效果及其對治療鼠整體免疫功能的影響。方法：利用可生物降解的聚乳酸-羥基乙酸共聚物微米球做載體，共價吸附H-2Kb抗原和anti-Fas等負(fù)性調(diào)節(jié)分子，制備針對同種反應(yīng)性T細(xì)胞的特異性KaAPC，治療以C57BL/6和BALB/c為供受對的小鼠皮膚移植排斥，并利用混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)觀察治療鼠對第三方供體的同種反應(yīng)能力以及通過載瘤實驗觀察治療鼠的抗腫瘤能力等，以論證KaAPC治療對機(jī)體整體免疫功能的影響，幫助篩選有效治療方案。結(jié)果:成功制備KaAPC，F(xiàn)ACS驗證其有正確的表型；KaAPC輸注使皮膚移植物的存活時間明顯延長，P<0.000 1，但并未顯著損傷治療鼠T細(xì)胞對第三方供體鼠脾細(xì)胞的同種增殖能力，也并未顯著損傷治療鼠的抗腫瘤能力。結(jié)論：KaAPC可以抑制小鼠皮膚移植排斥并對治療鼠的整體免疫功能無明顯損傷。

殺傷性人工抗原提呈細(xì)胞； 聚乳酸-羥基乙酸； 同種反應(yīng)性T細(xì)胞； 小鼠

選擇性清除或抑制抗原特異性T細(xì)胞是治療移植排斥和自身免疫病等的理想策略之一，因為它能避免免疫抑制劑所致的患者整體免疫功能損傷。因此，以MHC/肽復(fù)合體(pMHC)分子為導(dǎo)向的針對T細(xì)胞的各種特異性免疫療法被廣泛研究。殺傷性人工抗原提呈細(xì)胞(KaAPC)就是其中之一，其基本方法是利用基因工程技術(shù)使現(xiàn)有的抗原提呈細(xì)胞表面表達(dá)Fas配體，通過細(xì)胞膜上的pMHC分子靶向結(jié)合抗原特異性T細(xì)胞，同時通過膜上的FasL與活化后T細(xì)胞膜上的Fas分子結(jié)合進(jìn)而誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡。這種方式對同種移植排斥[1-5]、自身免疫病[6]以及變態(tài)反應(yīng)[7]等的治療都有很多成功的報道。然而，殺傷性細(xì)胞療法同時也遭到強(qiáng)烈的質(zhì)疑：除了生物安全性和原代DC等細(xì)胞的大規(guī)模制備困難外，更重要的是FasL在載體細(xì)胞膜上的表達(dá)水平難以均勻控制。為了避免細(xì)胞性療法的這些缺陷，近年來人們轉(zhuǎn)而關(guān)注以非細(xì)胞性物質(zhì)為載體的特異性殺傷制劑的研究，如以膠乳微球或磁珠為載體標(biāo)記pMHC多聚體和FasL，制備殺傷性顆粒(或稱KaAPC)，在體外混合培養(yǎng)中特異性殺傷靶細(xì)胞[8-9]。但是這些載體生物相容性差，在體內(nèi)難以生物降解，不適宜于體內(nèi)使用。聚乳酸-羥基乙酸共聚物(polylactic-co-glycolic acid，PLGA)是一種被廣泛使用的藥物輔料或載體，早被美國FDA批準(zhǔn)用于臨床，在體內(nèi)能被生物降解，無毒副作用，生物相容性好。本研究用直徑4.0 μm的PLGA微球共吸附H-2Kb-Ig二聚體和抗Fas單抗，制作以H-2kb分子為靶抗原的KaAPC，以C57BL/6鼠(H-2Kb)和BALB/c鼠(H-2Kd)為皮膚移植的供受體，在皮膚移植后的第5、7、9天分別經(jīng)尾靜脈輸注治療，探討其在體內(nèi)治療移植排斥的可能性及其對治療鼠整體免疫功能的影響。

1 材料和方法

1.1 主要材料

PLGA由東南大學(xué)生物科學(xué)與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院顧寧教授實驗室制備，直徑4.0 μm，表面功能化。anti-mouse CD16/CD32、anti-mouse IgG1、PE-anti-mouse H-2Kb、FITC-anti-Armenian and Syrian Hamster IgG、Hamster anti-mouse CD95、CFSE購自BD Pharmingen公司，APC-anti-mouse CD3e、FITC-anti-mouse CD8a、7-AAD購自eBioscience公司，H-2Kb-Ig Dimer X購自美國Invitrogen公司，C57BL/6和BABL/c小鼠購自揚(yáng)州大學(xué)模式動物中心，B16、SP2/0和Yac-1等細(xì)胞株由東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)與免疫學(xué)系實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1KaAPC的制備以及表型的驗證 按1×107只-1的用量取出足量的PLGA微米球，經(jīng)過PBS洗滌后加入H-2Kb-Ig二聚體和anti-Fas單抗(5 μg∶5 μg)，4 ℃轉(zhuǎn)輪孵育過夜。PBS洗滌離心后加入30%的鼠血清封閉，經(jīng)4 ℃轉(zhuǎn)輪孵育24 h后PBS離心洗滌，分裝后即成KaAPC。制備的KaAPC在每次實驗之前均用PE-anti-mouse H-2Kb以及FITC-anti-Armenian and Syrian Hamster IgG進(jìn)行熒光染色，然后行FACS分析，以確定KaAPC表面吸附有H-2Kb-Ig二聚體和anti-Fas單抗。另設(shè)單吸附anti-Fas單抗組以及空白PLGA組作為對照。

1.2.2皮膚移植小鼠模型的建立以及KaAPC治療皮膚移植排斥 取供體鼠C57BL/6(H-2Kb)背部全厚皮片一塊，移植于受體鼠BALB/c(H-2Kd)背部，仔細(xì)平鋪于移植床后用創(chuàng)口貼適當(dāng)加壓包扎，每只小鼠單籠飼養(yǎng)，于術(shù)后第3天打開包扎，在皮膚移植后的第5、7、9天分別進(jìn)行尾靜脈輸注治療，KaAPC微球1×107只-1·次-1。每批治療實驗都同時設(shè)立3個對照治療組：單吸附anti-Fas PLGA、空白PLGA、PBS組。分組治療時，每組的小鼠數(shù)量為6只。每天觀察移植物存活情況。觀察指標(biāo)：皮片質(zhì)地、移植鼠皮毛色澤、局部紅腫炎癥，并取此3項指標(biāo)進(jìn)行臨床評分，每個指標(biāo)按照0、1、2、3共4個檔次進(jìn)行打分，完全無排斥現(xiàn)象為滿分(9分)，從第5天開始每日記錄，本實驗以皮片干縮至原來面積的80%即為排斥。

1.2.3KaAPC治療后皮膚移植鼠針對第三方供體的同種反應(yīng)能力 無菌殺鼠取脾細(xì)胞(皮膚移植并治療后的BALB/c鼠)制成脾細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×107ml-1，用CFSE常規(guī)染色，經(jīng)PBS洗滌3次，用含體積分?jǐn)?shù)10%小牛血清的1640細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1×106ml-1作為反應(yīng)細(xì)胞。另無菌殺鼠取脾細(xì)胞(昆明鼠1只)制成脾細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106ml-1，加入絲裂霉素處理以作為刺激細(xì)胞。在U形底的96孔板中每孔接種BALB/c鼠和昆明鼠脾細(xì)胞各100 μl，置37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中混合培養(yǎng)7 d。分別收集混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)各組的脾細(xì)胞，經(jīng)anti-CD3熒光單抗染色后用FACS分析治療鼠T細(xì)胞的同種增殖能力，觀察CD3+細(xì)胞群中CFSE熒光的減弱程度。

1.2.4KaAPC治療后皮膚移植鼠的抗腫瘤能力 皮膚移植后的BALB/c鼠，于移植后的第3天皮下注射SP2/0腫瘤細(xì)胞2×106只-1，并于皮膚移植后的第5、7、9天分別同上進(jìn)行尾靜脈輸注治療，比較各組小鼠的成瘤時間、瘤體生長曲線和存活時間等。

2 結(jié) 果

2.1 KaAPC的制備及其表型的驗證

將KaAPC PLGA微球以及對照PLGA微球(只吸附anti-Fas單抗)分別與PE-anti-mouse H-2Kb以及FITC-anti-Hamster IgG進(jìn)行熒光染色，anti-Fas分子即Hamster anti-mouse CD95 IgG單抗。FACS分析證實，KaAPC PLGA微球表面同時吸附有一定密度的H-2Kb分子和anti-Fas分子，而anti-Fas PLGA微球表面只有anti-Fas分子，沒有H-2Kb分子。見圖1。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)分析KaAPC PLGA微球和anti-Fas PLGA 微球的表型

Fig 1 Phenotype of KaAPC PLGA microspheres and anti-Fas PLGA microspheres characterized by flow cytometry

2.2 KaAPC治療皮膚移植排斥反應(yīng)的臨床評分

各治療組小鼠皮膚移植排斥的臨床評分見圖2A，從首次治療后的第2天開始(即移植后第7天)，KaAPC治療組的臨床排斥現(xiàn)象顯著弱于另外3個對照治療組(P<0.05，雙側(cè)t檢驗)。各治療組小鼠皮膚移植物的生存曲線見圖2B，KaAPC治療組、anti-Fas PLGA治療組、Blank PLGA 治療組、PBS治療組皮膚移植物的中位存活時間(MST)分別為16、12、11.5和9 d。與3個對照治療組相比，KaAPC治療組皮膚移植物的存活時間明顯延長，P<0.000 1(log-rank test)。各組小鼠數(shù)均為6只。

圖2 KaAPC輸注治療能明顯延長皮膚移植物的存活期

Fig 2 The skinallograft survival was prolonged significantly after treatment with KaAPC

2.3 KaAPC治療后皮膚移植鼠針對第三方供體的同種反應(yīng)能力

CFSE染色檢測KaAPC治療后皮膚移植鼠T細(xì)胞針對第三方供體的同種反應(yīng)能力的流式細(xì)胞術(shù)分析圖見圖3A，M1代表正在分裂的T細(xì)胞，可見4～5次循環(huán)增殖。經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)分析統(tǒng)計后，KaAPC組的同種增殖能力與其余3個對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義；anti-Fas PLGA組與PBS組相比，P<0.05，可能是由于anti-Fas PLGA 組的非特異性殺傷導(dǎo)致第三方小鼠的同種增殖能力有輕微降低，見圖3B。

圖3 KaAPC輸注治療并未顯著損傷受體鼠T細(xì)胞對第三方供體鼠脾細(xì)胞的同種增殖能力

Fig 3 The proliferation of recipient T cells against the third-party splenocytes did not apparently decreased after treatment with KaAPC

2.4 KaAPC治療后皮膚移植鼠的抗腫瘤能力

各組皮膚移植鼠用KaAPC治療，對照組3次治療及皮下用SP2/0攻擊。各治療組皮膚移植鼠皮下SP2/0移植瘤的生長曲線見圖4A。每組5只實驗小鼠，統(tǒng)計分析各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。各治療組皮膚移植鼠皮下SP2/0移植瘤的質(zhì)量也無明顯差異，見圖4B。

圖4 KaAPC輸注治療并未顯著損傷皮膚移植鼠的抗腫瘤能力

Fig 4 The defense to tumor did not apparently decreased after treatment with KaAPC in skin graft recipient mice

3 討 論

免疫抑制劑是目前治療移植排斥反應(yīng)的主要方法，但是它能非特異性地抑制患者對腫瘤以及感染的抵抗能力[10]。選擇性清除抑制同種反應(yīng)性T細(xì)胞可以治療同種移植排斥，以解決免疫抑制劑帶來的患者整體免疫功能下降的副作用[11]。為此，我們用直徑4.0 μm的PLGA共價吸附H-2Kb二聚體和抗Fas單抗，制作以H-2kb分子為靶抗原的KaAPC，以C57BL/6鼠(H-2Kb)和BALB/c鼠(H-2Kd)為皮膚移植的供受體，在皮膚移植后的第5、7、9天分別經(jīng)尾靜脈輸注治療，以期望該KaAPC能在BALB/c鼠體內(nèi)選擇性地與H-2Kb同種抗原特異性的T細(xì)胞結(jié)合并誘導(dǎo)其凋亡，從而特異性地減輕針對該同種抗原的排斥反應(yīng)。結(jié)果表明，KaAPC治療確能有效延緩皮膚移植物的存活期，并對治療鼠的抗腫瘤能力以及對第三方供體的同種反應(yīng)能力等整體免疫功能指標(biāo)都無明顯損傷。這些體內(nèi)的觀察性研究再次提示了這種非細(xì)胞的靶向殺傷性載體在控制同種移植排斥中的潛在應(yīng)用價值。但是，由于供受鼠間并不只有H-2Kb同種抗原的差異，針對其他同種抗原的T細(xì)胞并不能被殺傷或清除，這也可能是皮膚移植物不能長期存活的原因之一。因此，針對供受對間多種同種抗原的KaAPC的制備及其治療方案的優(yōu)化等值得進(jìn)一步研究。

PLGA具有生物相容性，可生物降解(biodegradable)，無毒性，已在藥物和疫苗遞送領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用，可包裹藥物，也可吸附藥物或疫苗于顆粒表面[12-13]，是美國FDA批準(zhǔn)的藥物輔料，廣泛用作商業(yè)化的藥物緩釋劑，如LupronDepot?、NutropinDepot?和Zoladex?等[14]。本研究首次選用PLGA微米粒作為KaAPC的載體，增加了KaAPC治療策略的臨床適用性[13]。后續(xù)實驗還將繼續(xù)研究該KaAPC微米球在體內(nèi)的具體作用機(jī)制、時空分布規(guī)律以及毒副作用等。

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Killer artificial antigen-presenting cells treating skin allograft rejection and its impact on the overall immune function in mice model

LI Miao-chen1，WANG Wei1，LI Xiao-e1，F(xiàn)ANG Kun2，WU You1，GU Ning2，SHEN Chuan-lai1

(1.DepartmentofPathogenicBiologyandImmunology，SchoolofMedicine,SoutheastUniversity，Nanjing210009，China;2.SchoolofBioscienceandMedicalEngineering，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China)

Objective: To study the therapeutic effect for skin allograft rejection of killer artificial antigen-presenting cells(KaAPC) and its impact on the overall immune function in mice model. Methods： KaAPC were prepared by co-coupling H-2Kbantigen and anti-Fas monoclonal antibody onto the biodegradable polylactic-co-glycolic acid (PLGA) microspheres， and then were administered intravenously into BALB/c mice (H-2Kd) that had previously been grafted with skin squares from C57BL/6 mice (H-2Kb). Tumor cell challenge and third-party mixed lymphocyte culture were used to assess the general immune functions of host. Results: KaAPC microspheres had the correct phenotype as verified by FACS; the skinallograft survival was prolonged significantly(P<0.000 1) after treatment with KaAPC;the proliferation of recipient T cells against the third-party splenocytes and the defense to tumor did not apparently decreased after treatment with KaAPC in therapy mice. Conclusion: The KaAPC have ability to inhibit skin allograft rejection in mice model， without impairment of host overall immune function．

killer artificial antigen-presenting cells; polylactic-co-glycolic acid; alloreactive T cells; mice

2015-03-05

2015-04-10

國家自然科學(xué)基金面上項目(81172823；81372448)

李妙晨(1988-)，女，江蘇無錫人，在讀碩士研究生。E-mail:limiaochen0719@163.com

顧寧 E-mail:guning@seu.edu.cn 沈傳來 E-mail:chuanlaishen@seu.edu.cn

李妙晨,王偉,李曉娥,等.殺傷性人工抗原提呈細(xì)胞治療小鼠皮膚移植排斥及其對治療鼠整體免疫功能的影響[J].東南大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版,2015,34(4):496-501.

R-33

A

1671-6264(2015)04-0496-06

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.04．002