根干模擬生長處理對杜仲有效成分含量的影響

吳 茜，肖深根*，張水寒，成 文，陳陽峰，胡 晟

(1 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院, 長沙 410128； 2 湖南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所, 長沙 410006 )

根干模擬生長處理對杜仲有效成分含量的影響

吳 茜1，肖深根1*，張水寒2，成 文1，陳陽峰1，胡 晟1

(1 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院, 長沙 410128； 2 湖南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所, 長沙 410006 )

對杜仲的根皮和干皮進(jìn)行露曬根、裸根莖和干包埋6個月處理，研究模擬生長處理對杜仲皮中有效成分含量的影響。采用高效液相色譜法，測定處理后杜仲主要有效成分桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、松脂醇二葡萄糖苷含量。結(jié)果表明：經(jīng)干包埋處理的杜仲干皮中的桃葉珊瑚苷含量提高了80.0%；經(jīng)裸根莖和露曬根處理的杜仲根莖和根皮中松脂醇二葡萄糖苷含量分別提高101.5%和921.0%。說明通過模擬生長處理可以改變杜仲皮中有效成分的合成和積累。

杜仲；模擬生長；有效成分

杜仲(EucommiaulmoidesOliver)屬杜仲科、杜仲屬，是我國獨有的一科一屬國家珍貴二級保護(hù)植物[1]。《中華人民共和國藥典》(一部)規(guī)定其樹皮作為中藥杜仲入藥[2]，杜仲根皮則沒有作為藥用部位使用，造成杜仲藥用資源的浪費。本研究通過對杜仲的根皮和干皮進(jìn)行模擬生長處理，探究模擬生長處理對杜仲不同部位有效成分含量變化的影響，以為杜仲根皮綜合開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

杜仲樣皮采自于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)長沙縣長安教學(xué)基地杜仲林，樹徑約12 cm，樹齡約12年，長勢相近。

1.2 試藥及儀器

桃葉珊瑚苷對照樣品(批號MUST-14072606)、京尼平苷酸對照樣品(批號MUST-14032413)、松脂醇二葡萄糖苷對照樣品(批號MUST-14052103)均購于成都曼斯特生物科技有限公司；綠原酸對照樣品(110753-201314)購于中國藥品生物制品檢定所。甲醇、乙腈為色譜純(美國Tedia公司)，水為怡寶純凈水，其他試劑均為分析純。

Agilent 1200高效液相儀(G1322A泵，G1314B VWD紫外檢測器，G1329A自動進(jìn)樣器),依利特hypersil BDS C18(4.6 mm×250 mm,5 μm，批號11026)，Agilent色譜工作站；電子分析天平 AL204(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-52AA(上海亞榮生化儀器)。

1.3 方法

按梅花5點法隨機(jī)選取杜仲植株。設(shè)3個處理和3個對照，共40株，分別進(jìn)行裸根莖、干包埋、露曬根及各自的對照處理。6個月(2014年1月-2014年7月)后，剝皮采樣。

1.3.1 裸根莖處理

以杜仲植株為中心，50 cm為半徑，由內(nèi)向外將土層外推，直至露出杜仲的根莖部分，裸露部分離地為15～20 cm。對照為形態(tài)、長勢相似的未露根莖的異株杜仲。樣本量均為6株，處理取樣部位為裸露部位的根莖皮，對照為相應(yīng)部位的根莖皮。

1.3.2 干包埋處理

將杜仲植株在離地0.5 m以下采用土壤立式包埋，包裹土壤厚度約為10 cm，外加硬紙板加固。對照為形態(tài)、長勢相似的離地0.5 m以下的異株杜仲。樣本量均為8株，處理取樣部位為包埋處理部位的干皮，對照為相應(yīng)部位的干皮。

1.3.3 露曬根處理

將杜仲植株的向陽側(cè)土壤呈輻射狀挖開，深約0.5 m，露出其發(fā)達(dá)側(cè)根，將側(cè)根上土壤用軟刷刷凈。對照為形態(tài)、長勢相似的土壤中的異株杜仲。樣本量均為6株，處理取樣部位為裸露的根皮，對照為相應(yīng)部位的根皮。

1.3.4 采樣

杜仲剝皮技術(shù)參見文獻(xiàn)[3] 。

1.4 樣品制備

1.4.1 主要有效成分對照品溶液的制備

精密稱取桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、松脂醇二葡萄糖苷，置于10 mL的容量瓶中，加入75%的甲醇溶解并稀釋，搖勻，配制成質(zhì)量濃度為0.26 mg/mL的桃葉珊瑚苷, 0.20 mg/mL的京尼平苷酸，0.025 mg/mL的綠原酸，0.0105 mg/mL的松脂醇二葡萄糖苷的混合儲備液，冷藏保存，備用。

1.4.2 杜仲皮樣品溶液的制備

制備方法參見文獻(xiàn)[4]，其中：精密稱取杜仲粉末1.0 g，置具塞錐形瓶中，加75%的甲醇40 mL，稱重，超聲提取40 min。

1.5 色譜條件

色譜條件參見文獻(xiàn) [5]。其中，流動相：乙腈-0.1%磷酸水；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。

1.6 方法學(xué)檢查

試驗對液相色譜條件進(jìn)行了方法學(xué)檢查：線性關(guān)系考察、精密度考察、重復(fù)性考察、穩(wěn)定性考察和加樣回收率考察。

1.7 樣品的測定

經(jīng)露曬根、干包埋、裸根莖及各自對照處理，采樣陰干后制備樣品溶液、并進(jìn)行含量測定。

1.8 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Spss軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 線性關(guān)系考察

從表1可以看出，線性方程相關(guān)系數(shù)范圍在0.9905～0.9993之間，說明線性關(guān)系良好，試驗方法符合檢驗要求。

表1 線性方程和檢測范圍

2.1.2 重復(fù)性、穩(wěn)定性、精密度及加樣回收率考察

從表2可看出，4個考察試驗結(jié)果的RSD(relative standard deviation，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差)均<3%，表明試驗重復(fù)性、穩(wěn)定性、精密度和加樣回收率均良好，符合檢驗要求。

表2 試驗精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性及加樣回收率的RSD (%)

2.2 干包埋處理對杜仲干皮有效成分含量的影響

由表3可以看出，經(jīng)干包埋處理后，杜仲干皮中桃葉珊瑚苷的含量提高了80.0%，具有顯著性差異；松脂醇二葡萄糖苷的含量下降了39.0%，具有顯著性差異；而京尼平苷酸和綠原酸的含量變化不具有統(tǒng)計學(xué)意義。

表3 干包埋處理杜仲干皮有效成分的平均含量(mg/mL)及標(biāo)準(zhǔn)差

注：*表示處理間有顯著性差異，**表示處理間有極顯著性差異。下同。

2.3 裸根莖處理對杜仲根莖皮有效成分含量的影響

經(jīng)裸根莖處理后，杜仲根莖部位皮的京尼平苷酸和松脂醇二葡萄糖苷含量分別提高了94.6%和101.5%，綠原酸的含量下降了39.6%，均具有顯著性差異；而桃葉珊瑚苷含量變化無統(tǒng)計學(xué)意義(表4)。

表4 裸根莖處理杜仲根莖皮有效成分的平均含量(mg/mL)及標(biāo)準(zhǔn)差

2.4 露曬根處理對杜仲根皮有效成分含量的影響

經(jīng)露曬根處理后，杜仲根皮中的京尼平苷酸和綠原酸含量分別下降了32%和49%，具有顯著性差異；松脂醇二葡萄糖苷含量則提高了921%，具有極顯著性差異；而桃葉珊瑚苷的含量變化無統(tǒng)計學(xué)意義(表5)。

表5 露曬根處理杜仲根皮有效成分的平均含量(mg/mL)及標(biāo)準(zhǔn)差

2.5 不同處理間有效成分含量比較

藥典中將杜仲干皮作為藥用杜仲部位，因此將3種模擬生長處理后的干皮、根莖皮及根皮與藥典規(guī)定的藥用部位干皮中有效成分含量進(jìn)行對比，比較其有效成分含量差異。

干包埋、裸根莖和露曬根處理與對照組(即正常生長的杜仲干皮)有效成分的比較結(jié)果見表6?？梢钥闯觯?jīng)3種模擬生長處理后杜仲干皮和根皮中桃葉珊瑚苷的含量比對照組要高且具有顯著性差異；裸根莖和露曬根處理的京尼平苷酸含量與對照的含量差異具有顯著性；干包埋及裸根莖處理的綠原酸的含量與對照組相比無顯著性差異；松脂醇二葡萄糖苷含量經(jīng)干包埋和露曬根處理后與對照相比具有顯著性差異。說明經(jīng)處理后的杜仲干、根皮的有效成分含量與正常生長的杜仲干皮的有效成分含量差異明顯。

表6 3種處理間杜仲有效成分的平均含量(mg/mL)及標(biāo)準(zhǔn)差

3 結(jié)論與討論

本試驗比較了杜仲的3個部位(根皮、干皮和根莖皮)及對照組的有效成分含量，發(fā)現(xiàn)未經(jīng)處理的杜仲根皮中桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸和綠原酸的含量均為最高，但指標(biāo)成分松脂醇二葡萄糖苷的含量很低；松脂醇二葡萄糖苷在干皮中含量最高。經(jīng)處理(露曬根、干包埋和裸根莖)后，杜仲不同部位的有效成分含量發(fā)生了變化，桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸含量最高的部位均變?yōu)槁愀o處理，綠原酸含量最高部位依舊為未處理杜仲根皮。但杜仲根皮和根莖皮中高含量的京尼平苷酸有預(yù)防性功能低下、抗癌抗氧化等作用，桃葉珊瑚苷、綠原酸具有較強(qiáng)的鎮(zhèn)痛、抗菌消炎作用[6～8]，說明杜仲根皮具有藥用價值。杜仲皮中有效成分含量的變化是否與處理時間的長短或樹齡大小有關(guān)還需要進(jìn)一步探究。

試驗結(jié)果表明，模擬生長處理可改變杜仲皮中有效成分的合成和積累，說明可通過調(diào)節(jié)生長過程探討使杜仲根皮達(dá)到藥用標(biāo)準(zhǔn)的可能性，為杜仲資源綜合利用提供依據(jù)。

[1] 中國杜仲學(xué)會. 中國杜仲研究文集[M]. 西安：陜西科學(xué)技術(shù)出版社，1986.77.

[2] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典(一部)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005.114.

[3] 李紅運.杜仲剝皮技術(shù)[J]. 河南林業(yè)，2001(3)：21.

[4] 馮薇薇，郭方遒，范 嵐. 多波長高效液相色譜法同時測定杜仲中三類有效成分[J]. 現(xiàn)代中藥研究與實踐，2013，27(2)：13-16.

[5] 梁雪娟.杜仲皮有效成分與其內(nèi)生真菌的相關(guān)性研究[D].長沙：湖南中醫(yī)藥大學(xué)碩士學(xué)位論文，2014.

[6] 李芳東，杜紅巖. 杜仲[M]. 北京：中國中醫(yī)藥出版社，2001.277.

[7] 戚友維. 杜仲化學(xué)成分研究進(jìn)展[J].中草藥，1989(4)：88.

[8] 杜紅巖. 杜仲活性成分與藥理研究的新進(jìn)展[J].經(jīng)濟(jì)林研究，2003，21(2)：58-61.

Effects of Simulation Growth Model on Components ofEucommiaulmoidesOliver Stem and Root Barks

WU Xi1, XIAO Shen-gen1*, ZHANG Shui-han2, CHENG Wen1, CHEN Yang-feng1, HU Sheng1

(1 College of Horticulture and Landscape, Hunan Agricultural University, Changsha, Hunan 410128,China; 2 Institute of Chinese Materia Medica, Hunan Academy of Chinese Medicine, Changsha ,Hunan 410006, China)

In order to study the effect of simulation growth model on the content variation of the active constituents of theeucommiaulmoidesoliver stem and its root barks. Three different simulation growth methods were carried out: Treatment 1.revealing the root bark; treatment 2.uncovering the connection of root and stem; treatment 3.covering the stem with soil and the control group, 6 months later the samples were collected respectively. HPLC was used to analyze the content of effective ingredients aucubin, geniposidic acid, chlorogenic acid and pinoresinol diglucoside. The results showed that the content of the aucubin increased by 80% after treated with the 3rd processing method，while the pinoresinol diglucoside increased by 101.5% and 921.0% after treated with the 1st and 2nd simulation of growth methods，dramatically，which meaned by simulating growth methods could change the synthesis and accumulation of the effective ingredients in theEucommiaulmoidesoliver stem and its root barks.

Eucommiaulmoidesoliver; simulation of growth treatment; effective ingredient

2014-12-24

吳 茜(1989-)，女，湖南吉首市人，碩士研究生， Email：wuxidwb@sina.com。

* 通信作者：肖深根，博士，教授，Email：2395265030@qq.com。

S567.1+9

A

1001-5280(2015)02-0173-04

10.3969/j.issn.1001-5280.2015.02.15