賁門腺癌患者癌組織RKIP基因甲基化和mRNA表達(dá)情況及其臨床意義

魏紅，谷俊霞，劉建霞，徐亮，李麗東，李華，董稚明，張向陽(yáng)

·論著·

賁門腺癌患者癌組織RKIP基因甲基化和mRNA表達(dá)情況及其臨床意義

魏紅，谷俊霞，劉建霞，徐亮，李麗東，李華，董稚明，張向陽(yáng)

目的研究賁門腺癌患者癌組織RKIP基因甲基化和mRNA表達(dá)情況及其臨床意義。方法選擇2008—2013年河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院收治的賁門腺癌患者160例，采用以Taq Man探針為基礎(chǔ)的實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和反轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)(RT－PCR)檢測(cè)賁門腺癌患者癌組織及癌旁正常組織RKIP基因甲基化和mRNA表達(dá)情況。結(jié)果賁門腺癌患者癌組織RKIP基因甲基化發(fā)生率為68.1%(109/160)，高于癌旁正常組織的35.6%(57/160)(χ2=33.843，P=0.000)。不同年齡、性別、臨床分期賁門腺癌患者RKIP基因甲基化發(fā)生率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);不同病理分級(jí)及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移賁門腺癌患者癌組織RKIP基因甲基化發(fā)生率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。賁門腺癌患者癌組織RKIP基因mRNA陽(yáng)性表達(dá)率為48.1%，低于癌旁正常組織的71.9%(χ2=18.802，P＜0.01)。癌組織RKIP基因甲基化患者RKIP基因mRNA陽(yáng)性表達(dá)率低于癌組織RKIP基因非甲基化患者(χ2=6.410，P＜0.01)。結(jié)論RKIP基因甲基化導(dǎo)致該基因mRAN表達(dá)缺失可能是賁門腺癌的發(fā)病機(jī)制之一，且RKIP基因的高甲基化與賁門腺癌患者病理分級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。

賁門腺癌;RKIP基因;甲基化;基因表達(dá)

魏紅，谷俊霞，劉建霞，等.賁門腺癌患者癌組織RKIP基因甲基化和mRNA表達(dá)情況及其臨床意義［J］.實(shí)用心腦肺血管病雜志，2015，23(3):43－46.［www.syxnf.net］

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賁門腺癌是臨床常見的消化道腫瘤，但其發(fā)現(xiàn)時(shí)大多已是中晚期，患者預(yù)后差，因此對(duì)賁門腺癌發(fā)病機(jī)制及早期診斷的研究日益受到臨床醫(yī)療工作者的重視［1］。有研究證實(shí)，RKIP是一種潛在的腫瘤抑制基因，其表達(dá)水平與人類多種惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移能力呈負(fù)相關(guān)，且與患者預(yù)后有關(guān)，RKIP表達(dá)下調(diào)/缺失者預(yù)后差［2－5］。本研究采用以Taq Man探針為基礎(chǔ)的實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和反轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)(RT－PCR)檢測(cè)賁門腺癌患者的癌組織及癌旁正常組織RKIP基因甲基化及其mRNA表達(dá)情況，分析RKIP基因甲基化在賁門腺癌患者中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2008—2013年河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院收治的賁門腺癌患者160例，其中男118例，女42例;年齡37～83歲，平均(61.8±8.7)歲;標(biāo)本切取后立即保存于液氮中，制作蠟塊進(jìn)行回顧性閱片，按國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)進(jìn)行臨床分期:Ⅰ～Ⅱ期70例，Ⅲ～Ⅳ期90例;病理分級(jí):高分化41例，中分化54例，低分化65例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者92例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者68例。術(shù)前未行放化療，標(biāo)本經(jīng)病理檢查證實(shí)，患者均知情同意。

1.2 主要試劑和儀器PCR擴(kuò)增儀Mastercycler5333 (德國(guó)eppendorf公司)，紫外分光光度儀TU－1800 PC (北京普析通用儀器)，PCR引物(上海捷瑞生物技術(shù)有限公司)，Trizol試劑(北京賽百盛生物技術(shù)有限公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Reverse Transcription System A3500，Promega公司)，QZAamp DNA FFPE Tissuekit試劑盒，EZ DNA Methylation－goldTMKit(D5005)試劑盒。

1.3 方法采用以Taq Man探針為基礎(chǔ)的實(shí)時(shí)定量PCR和RT－PCR檢測(cè)賁門腺癌患者癌組織及癌旁正常組織RKIP基因甲基化及其mRNA表達(dá)情況。

1.3.1 以Taq Man探針為基礎(chǔ)的實(shí)時(shí)定量PCR每個(gè)樣本均取10 μg DNA，用2 mol/L氫氧化鈉(NaOH)變性處理［6］，此樣本經(jīng)蛋白酶K(Merck公司產(chǎn)品)消化，用QZAamp DNA FFPE Tissuekit試劑盒提取組織DNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)量其純度，比值選擇在1.6～2.2。用EZ DNA Methylation－goldTMKit(D5005)試劑盒修飾DNA，使未甲基化的DNA的胞嘧啶(C)轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?U)。PCR反應(yīng)體系為25 μl:DNA模版2.5 μl;甲基化上游引物序列為5'－CGTTCGATCGTGGACGTGT－3'(115 bp)，甲基化下游引物序列為5'－GACGAACAACGTCTTATTACAACGC－3' (115 bp)，上、下游引物各10 μl;檢測(cè)RKIP非甲基化的上游引物序列為5'－TGGTCATCCAGGTTTAGTAACT－ 3'(200bp)，下游引物序列為AACCAATAAACCTACTCCTCCCTTAA－3'(200 bp)，量同甲基化引物;探針FAM 0.4 μl(10 pmol/L);Taq PCR Master Mix 10 μl×2;ROX 0.4 μl。PCR反應(yīng)條件: 95℃預(yù)變性5 min;95℃30 s，53℃45 s，72℃45 s，42個(gè)循環(huán);72℃繼續(xù)延伸10 min。選擇經(jīng)Sss甲基化酶處理的無(wú)任何腫瘤的正常人外周血中有核細(xì)胞的DNA作為陽(yáng)性對(duì)照，未經(jīng)處理的正常人外周血DNA作為陰性對(duì)照。DNA模版用滅菌雙蒸水取代作為空白對(duì)照。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，用UV凝膠電泳成像及圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，產(chǎn)物長(zhǎng)度均為169 bp。隨機(jī)抽取15%的標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)。擴(kuò)增產(chǎn)物得到預(yù)期大小的甲基化片段，空白對(duì)照無(wú)產(chǎn)物。RKIP基因甲基化狀態(tài)有3種表現(xiàn):(1)目的條帶由甲基化引物擴(kuò)增出來(lái)，而非甲基化引物無(wú)條帶擴(kuò)出，此為甲基化;(2)目的條帶由非甲基化引物擴(kuò)增出來(lái)，而甲基化引物未擴(kuò)增出目的條帶，此為非甲基化;(3)甲基化引物和非甲基化引物均由目的條帶擴(kuò)增出來(lái)，則為不完全甲基化，統(tǒng)計(jì)為甲基化(RKIP基因電泳圖見圖1)［7］。

1.3.2 RT－PCR技術(shù)按Trizol試劑說(shuō)明書提取總RNA(Invitrogen公司)并參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。合成RKIP mRNA的上游引物序列為5'－TCCTCTTCATATTGCGGCTT－3'，下游引物序列為5'－CTTGAGCACCTTTTCCCAGAA－3';GAPDH的上游引物序列為5'－TGAACCGGCATCTGCACAC－3'，下游引物序列為5'－CGTCTTCAGAGACAGCCAGGAG－3';PCR反應(yīng)體系為25 μl:cDNA 2.5 μl，目的基因和內(nèi)參照基因的上下引物各4 μl;反應(yīng)條件:RNA 94℃變性3 min，95℃15 s，68℃30 s，72℃90 s，最后72℃延伸10 min。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RKIP基因甲基化賁門腺癌患者癌組織RKIP基因發(fā)生甲基化109例(68.1%)，癌旁正常組織RKIP基因發(fā)生甲基化57例(35.6%)，癌組織RKIP基因甲基化發(fā)生率高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2= 33.843，P=0.000)。

2.2 RKIP基因甲基化與臨床病理特征的關(guān)系不同年齡、性別、臨床分期賁門腺癌患者RKIP基因甲基化發(fā)生率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);不同病理分級(jí)及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移賁門腺癌患者癌組織RKIP基因甲基化發(fā)生率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，見表1)。

圖1 賁門腺癌患者癌組織及癌旁正常組織RKIP基因電泳圖Figure 1 Electrophoregram of RKIP gene in cancerous tissues and correspondingnormaltissueofpatientswith cardia adenocarcinoma

表1 賁門腺癌患者臨床病理特征與癌組織RKIP基因甲基化的關(guān)系(例)Table 1 Relationship between clinicopathologic features and RKIP gene methylationincanceroustissuesofpatientswith cardia adenocarcinoma

2.3 RKIP基因甲基化與其mRNA表達(dá)的關(guān)系賁門腺癌患者癌組織RKIP基因mRNA陽(yáng)性表達(dá)77例，陽(yáng)性表達(dá)率為48.1%;而癌旁正常組織RKIP基因mRNA陽(yáng)性表達(dá)115例，陽(yáng)性表達(dá)率為71.9%。癌組織RKIP基因mRNA陽(yáng)性表達(dá)率低于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=18.802，P＜0.01)。癌組織RKIP基因甲基化患者109例，其中RKIP基因mRNA陽(yáng)性表達(dá)45例，陰性表達(dá)64例;癌組織RKIP基因非甲基化51例，其中RKIP基因mRNA陽(yáng)性32例，陰性19例。癌組織RKIP基因甲基化患者RKIP基因mRNA陽(yáng)性表達(dá)率低于癌組織RKIP基因非甲基化患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2= 6.410，P＜0.01)。

3 討論

RKIP是1999年Yeung等［8］發(fā)現(xiàn)的，因其與人磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白(PEBP)及Raf－1結(jié)合后具有調(diào)節(jié)Raf－1/MEK/ERK信號(hào)通路的作用而命名。免疫組織化學(xué)分析結(jié)果表明，RKIP在許多組織的細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜上均有表達(dá)，且通過(guò)靜電作用與帶負(fù)電荷的膜進(jìn)行結(jié)合［9］。Fu等［10］研究發(fā)現(xiàn)，RKIP具有抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用，因此臨床對(duì)其在各種腫瘤中的甲基化、表達(dá)、失活原因及對(duì)臨床指導(dǎo)價(jià)值等進(jìn)行了廣泛而系統(tǒng)的研究，認(rèn)為腫瘤發(fā)生早期階段RKIP具有基因甲基化事件。基因甲基化是腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的早期事件，本研究結(jié)果顯示，賁門腺癌患者癌組織RKIP基因甲基化發(fā)生率為68.1%，高于癌旁正常組織的35.6%，表明RKIP基因高甲基化是賁門腺癌發(fā)生的早期信號(hào)。同時(shí)本研究結(jié)果顯示，RKIP基因甲基化與臨床分期無(wú)關(guān)，原因可能是不同類型腫瘤抽樣誤差引起。另外，本研究觀察到，癌旁組織約34%表現(xiàn)為不完全甲基化，可能與本研究采用以Taq Man探針為基礎(chǔ)的實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行檢測(cè)有關(guān)，因其靈敏度較高，低于總DNA的5%的等位基因時(shí)甲基化即可被檢測(cè)出來(lái)［11］，還有手術(shù)切除過(guò)程中微量腫瘤組織混入正常黏膜組織也可表現(xiàn)為甲基化［12］。

本研究進(jìn)行的前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RKIP基因甲基化發(fā)生率與賁門腺癌患者的臨床分期無(wú)關(guān)，為此本研究增加了樣本量，且抽取了15%的標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，因此結(jié)果較可信。同時(shí)本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，賁門腺癌患者癌組織RKIP基因甲基化發(fā)生率與病理分級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，表明RKIP基因的高甲基化對(duì)腫瘤具有加深侵襲深度和促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的作用。RKIP基因定位于人體細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上，對(duì)細(xì)胞過(guò)分增殖具有抑制作用，其可以穩(wěn)定染色體，防止基因突變，促進(jìn)細(xì)胞凋亡、分化，進(jìn)而起到控制腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的作用，這在直結(jié)腸癌和胃癌中已得到證實(shí)。

RKIP作為Raf－1/MEK/EPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的調(diào)節(jié)因子，在良性黑色素細(xì)胞中表達(dá)最高、黑色素瘤次之、轉(zhuǎn)移黑色素瘤表達(dá)最低，RKIP過(guò)表達(dá)能下調(diào)BRaf的活性，RKIP強(qiáng)制性表達(dá)能致瘤B－Raf轉(zhuǎn)化的黑色素瘤部分恢復(fù)到非轉(zhuǎn)化狀態(tài)，提示腫瘤細(xì)胞的增殖和浸潤(rùn)能力及轉(zhuǎn)移概率均與RKIP表達(dá)下降有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，賁門腺癌患者癌組織RKIP基因的mRNA陽(yáng)性表達(dá)率(48.1%)低于癌旁正常組織(71.9%)，且賁門腺癌患者癌組織RKIP基因甲基化與其mRNA表達(dá)有關(guān)，表明賁門腺癌患者癌組織RKIP基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與該基因mRNA表達(dá)的缺失有關(guān)。然而Zhu［13］等研究指出，RKIP具有促進(jìn)細(xì)胞遷移的作用，RKIP在犬腎細(xì)胞(MDCK細(xì)胞)中過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞遷移有促進(jìn)作用，但其在人前列腺癌中過(guò)表達(dá)可降低浸潤(rùn)能力、抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，兩種不同的結(jié)果表明，RKIP在Raf－1/MEK/ EPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的調(diào)節(jié)具有正性和負(fù)性作用，因此

RKIP在不同類型腫瘤中通過(guò)不同方式抑制或促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)。

綜上所述，RKIP基因高甲基化導(dǎo)致該基因mRNA表達(dá)缺失可能是賁門腺癌的發(fā)病機(jī)制之一，且RKIP基因的高甲基化與賁門腺癌患者的病理分級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，可考慮將其作為評(píng)估賁門腺癌惡性程度和判斷預(yù)后的指標(biāo)。

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Methylation and mRNA Expression of RKIP Gene in Cancerous Tissues of Patients with Cardia Adenocarcinoma and Its Clinical Significances

WEI Hong，GU Jun－xia，LIU Jian－xia，et al．
The Affiliated Hospital of Hebei Engineering University，Handan 056002，China

ObjectiveTo observe the methylation and mRNA expression of RKIP gene in cancerous tissues of patients with cardia adenocarcinoma，to explore its clinical significances.MethodsFrom 2008 to 2013，a total of 160 patients with cardia adenocarcinoma were selected in the Affiliated Hospital of Hebei Engineering University，and Taq Man probe－based real－time quantitative PCR and RT－PCR were used to detect methylation and mRNA expression of RKIP gene in cancerous tissues and corresponding normal tissues.ResultsThe methylation rate of cancerous tissues was 68.1%，was higher than that of corresponding normal tissues of 35.6%(χ2=33.843，P=0.000).No statistically significant differences of methylation rate was found in patients with different ages，gender or clinical stages(P＞0.05);but there was statistically significant differences of methylation rate in patients with different pathological gradings and with or without lymphatic metastasis(P＜0.05).The positive expression rate of RKIP gene mRNA of cancerous tissues was 48.1%，was lower than that of corresponding normal tissues of 71.9%(χ2=18.802，P＜0.01).The positive expression rate of RKIP gene mRNA of patients with RKIP gene methylation was lower than that of patients without RKIP gene methylation(χ2=6.410，P＜0.01).ConclusionThe incomplete expression of RKIP gene mRNA caused by RKIP gene methylation may play a role in the mechanism of cardia adenocarcinoma，and the methylation of RKIP gene is correlated with pathological gradings and lymphatic metastasis.

Cardiac adenocarcinoma;RKIP gene;Methylation;Gene expression

R 735.2

A

10.3969/j.issn.1008－5971.2015.03.012

2014－12－13;

2015－03－05)

(本文編輯:謝武英)

河北省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(14277765D)

056002河北省邯鄲市，河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院(魏紅，谷俊霞，劉建霞，徐亮，李華，張向陽(yáng));邯鄲市第四醫(yī)院(李麗東);河北省腫瘤研究所(董稚明)