豬瘟疫苗質(zhì)量的替代檢驗方法研究進展

祖立闖，謝金文，2，沈志強，2＊，李 嬌，唐 娜，2，王金良，2，苗立中，2，張 娜，王 艷，2，吳信明，2

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州 256600）

豬瘟（Classical swine fever，CSF）是由豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起豬的以稽留高熱、皮膚和黏膜出現(xiàn)大量出血點為主要特征一種高度接觸性、致死性的傳染?。?-3］，世界動物衛(wèi)生組織將其列為A類烈性傳染?。?］，我國農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)局將其列為一類動物疫病，是目前危害我國養(yǎng)豬業(yè)的頭號殺手，嚴重阻礙著我國養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展［5］。半個多世紀以來，我國一直采用以豬瘟兔化弱毒疫苗免疫接種為主的綜合防控措施，使我國豬瘟的發(fā)生與流行得到了有效控制［6］。但近年來，我國豬瘟疫苗免疫失敗的病例逐漸增多，導致免疫失敗的原因很復雜，但疫苗質(zhì)量達不到要求是其中一個重要原因［7-8］。而目前國標中采用的豬瘟疫苗效力檢驗、支原體檢驗、外源病毒檢驗的兔體定型熱反應(yīng)、培養(yǎng)法、熒光抗體檢查法和致細胞病變檢查法等質(zhì)量檢驗方法均存在試驗周期長、操作繁瑣、敏感性較低等缺點，隨著現(xiàn)代免疫學與分子生物學技術(shù)的快速發(fā)展，豬瘟疫苗質(zhì)量檢驗新興替代方法日臻完善。本文綜述了豬瘟病毒的病毒含量測定、豬瘟疫苗效力檢驗、支原體檢驗、外源病毒檢驗等的免疫學與分子生物學檢測新方法，以期為提高豬瘟疫苗的質(zhì)量檢驗水平，保障豬瘟疫苗質(zhì)量提供參考依據(jù)。

1 豬瘟病毒含量測定及疫苗效力檢驗替代方法

由于豬瘟病毒不能產(chǎn)生細胞病變，因此國標中對病毒含量或疫苗效力檢驗主要依靠兔體定型熱反應(yīng)方法，該方法試驗成本較高、操作繁瑣、試驗周期較長，且受試驗動物的個體差異、環(huán)境因素等多方面原因影響，檢測結(jié)果不是十分準確。因此，建立新型實用、標準化的疫苗效力檢驗替代方法勢在必行。熒光定量RT-PCR方法可以對病毒含量進行實時監(jiān)測，具有特異、敏感、快速、高通量和實時等優(yōu)點［9-10］，為豬瘟病毒的病毒含量測定及豬瘟疫苗效力檢驗提供了新的技術(shù)支持。ELISA方法與膠體金方法檢測快速、操作簡單、高通量，且可實現(xiàn)對病毒的定量或半定量［11-12］，可應(yīng)用于豬瘟病毒的病毒含量測定及豬瘟疫苗的效力檢驗。

1.1 熒光定量RT-PCR方法

李安等［13］建立了一種能夠快速定量檢測豬瘟病毒含量的實時熒光定量RT-PCR方法，該方法可以對豬瘟脾淋苗和細胞苗進行定量檢測，102拷貝／μL的總RNA即能得到特異性擴增，并與兔體定型熱反應(yīng)具有良好的相關(guān)性。葛葉等［14］采用熒光定量RT-PCR方法與兔體定型熱反應(yīng)對5份豬瘟細胞苗和6份半成品樣品進行檢測，兩種檢測方法存在極高的正相關(guān)性。陳鍇等［15］應(yīng)用熒光定量RT-PCR方法和兔體定型熱反應(yīng)對4個廠家17個批次的34份豬瘟疫苗進行效力檢驗，二者表現(xiàn)出了極高的相關(guān)性，得出熒光定量RT-PCR方法可以用于豬瘟疫苗效力檢驗。實時熒光定量RTPCR檢測方法可以替代傳統(tǒng)的兔體定型熱試驗用于疫苗生產(chǎn)過程中的半成品抗原效價監(jiān)測，指導疫苗配制，也可以作為成品疫苗效力測定的一種參考方法，為豬瘟疫苗效力檢驗提供敏感、準確和快速的替代檢驗方法。但由于該方法高度敏感，導致難以確定疫苗半成品檢驗和成品檢驗合格的最低標準基準值，因此難以成為國家法定的質(zhì)量檢驗標準方法。盡管如此，該方法仍然可作為實驗室與豬瘟疫苗生產(chǎn)企業(yè)豬瘟疫苗質(zhì)量檢驗的參考方法應(yīng)用于豬瘟疫苗的生產(chǎn)檢驗等。

1.2 ELISA方法

唐紅慧等［16］應(yīng)用ELISA試劑盒和兔體定型熱反應(yīng)對24份豬瘟疫苗半成品和21份成品疫苗進行病毒抗原含量測定，二種檢測方法的檢測結(jié)果符合率達95.8%，表明ELISA方法能夠用于豬瘟細胞苗的半成品與成品的病毒含量測定，但該方法無法區(qū)分豬瘟病毒抗原與牛病毒性腹瀉病毒抗原。蔣卉等［17］采用IDEXX商品化的豬瘟抗體ELISA檢測試劑盒對注射豬瘟病毒的家兔血清樣品進行抗體檢測，并且與體溫反應(yīng)結(jié)果進行比較分析，家兔體溫反應(yīng)與ELISA抗體檢測結(jié)果具有較高的正相關(guān)性，兩者符合率為95.83%。李嬌等［18］以純化的豬瘟病毒重組E2蛋白為包被抗原，以辣根過氧化物酶標記葡萄球菌A蛋白為二抗，組裝了檢測豬瘟病毒抗體的PPA-ELISA診斷試劑盒，因SPA能與豬、兔等哺乳動物血清IgG的Fc段結(jié)合，使該試劑盒可應(yīng)用豬瘟疫苗免疫后的豬、兔血清抗體效價檢測。雖然ELISA抗體檢測方法依然采用家兔進行效力檢驗，但省去了傳統(tǒng)方法每6h家兔測溫1次的工作，大大減輕疫苗檢驗工作的強度，避免了傳統(tǒng)方法中因家兔質(zhì)量和環(huán)境等因素對體溫檢測結(jié)果的影響。ELISA方法具有操作簡便、快速的特點，其結(jié)果更具有良好的重復性和穩(wěn)定性，為豬瘟疫苗的質(zhì)量檢驗提供了一種可靠和穩(wěn)定的方法。

1.3 膠體金檢測方法

免疫膠體金技術(shù)具有簡便、快速、無污染、不需特殊儀器、特異性強、敏感性高、結(jié)果判斷直觀等優(yōu)點，在豬瘟的快速診斷與抗體效價檢測中得到了廣泛應(yīng)用。陳龍賓等［19］、李華瑋等［20］均建立了檢測豬瘟病毒的膠體金試紙條，試紙條不需要任何試驗儀器，將待測樣品加入檢測卡的加樣孔內(nèi)，室溫下靜置10min～20min，就可以準確地檢測出被檢樣品是否帶有豬瘟抗原，同時還可以通過檢測線顏色的深淺判定病毒含量的多少。但目前，膠體金檢測方法僅能夠進行豬瘟病毒含量及抗體效價的定性檢測，以及根據(jù)顏色深淺進行半定量檢測，還無法達到熒光定量RT-PCR方法和ELISA方法的定量分析，相信隨著免疫技術(shù)、標記技術(shù)的日趨成熟、分析儀等定量檢測儀器的開發(fā)與應(yīng)用，免疫膠體金技術(shù)在豬瘟病毒含量測定與豬瘟抗體效價檢測等方面將會有更為廣闊的應(yīng)用前景。

2 支原體檢驗替代方法

支原體污染是動物疫苗特別是動物細胞苗研制過程中的一個十分棘手的問題，生產(chǎn)生物制品的細胞一旦受到污染，就會影響病毒的繁殖，導致生物制品的品質(zhì)下降或廢棄，給動物疫苗生產(chǎn)企業(yè)帶來不小的經(jīng)濟損失，因此建立支原體的檢測方法非常重要。我國獸藥典中規(guī)定對支原體的檢測采用直接培養(yǎng)法，該方法通過觀察液體培養(yǎng)基的顏色變化和顯微鏡下的菌落形態(tài)就可得出結(jié)果，是較直接的檢測方法，其缺點是培養(yǎng)時間長，需29d才能完成，操作相對繁瑣。而PCR技術(shù)具有敏感、特異、快速、準確等優(yōu)點，為獸用疫苗中支原體的檢驗提供了新的方法［21］。張娜等［22］根據(jù)16SrRNA支原體種屬特異性區(qū)域設(shè)計合成引物，優(yōu)化PCR反應(yīng)條件與體系，建立了檢測獸用生物制品中支原體污染的PCR方法，并應(yīng)用該PCR方法和傳統(tǒng)培養(yǎng)法同步檢測血清、疫苗、細胞株等樣品共計224份，PCR方法檢測出陽性25份，陽性率為11.2%，傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢出陽性13份，陽性率為5.8%，PCR方法比傳統(tǒng)培養(yǎng)法靈敏、特異，且檢測時間大大縮短。蒙業(yè)軍［23］建立了檢測動物疫苗支原體的巢式PCR方法，該方法敏感性更高，且特異性強、重復性好、結(jié)果準確可靠，可廣泛用于細胞庫、病毒種子庫、動物疫苗細胞培養(yǎng)物中的支原體污染監(jiān)測。

3 外源病毒檢驗替代方法

豬瘟細胞苗在生產(chǎn)過程中要用牛血清、胰酶、牛睪丸等原輔材料，這些材料中若帶有牛病毒性腹瀉病 毒 （Bovine viral diarrhea-mucosal disease，BVDV）、豬圓環(huán)病毒（Porcinecircovirus，PCV）等，會造成豬瘟細胞苗污染外源病毒。我國獸藥典要求的豬瘟疫苗外源病毒檢驗方法為熒光抗體檢查法和致細胞病變檢查法，2種檢測方法耗時較長、費時費力，操作復雜，且BVDV-2不產(chǎn)生細胞病變，難以滿足快速檢驗的需要。另外，BVDV與CSFV存在血清學上的交叉反應(yīng)，故常規(guī)血清學診斷方法很難將其鑒別診斷。隨著分子生物學技術(shù)的日臻進步，基于BVDV與CSFV核酸序列差異的分子生物學方法不斷發(fā)展和完善，為豬瘟疫苗的外源病毒檢驗提供了技術(shù)支持。

3.1 RT-PCR方法

祖立闖等［24］建立了檢測BVDV的套式RTPCR方法，該方法重復性好、特異性強、敏感性高，可以準確快速檢測出極低含量的BVDV，可用于動物與疫苗生物制品原輔料中BVDV的快速檢測。葉兆美［25］采用PCR方法對19份豬瘟疫苗和藍耳病疫苗樣品進行BVDV和PCV-2抗原的檢測，BVDV污染率達10.53%。曹玉美等［26］采用RTPCR方法對國內(nèi)6個廠家生產(chǎn)的10個批號豬瘟疫苗進行了監(jiān)測，結(jié)果表明有4個廠家生產(chǎn)的疫苗BVDV核酸檢測陽性，有7批次疫苗檢出BVDV核酸。陶潔等［27］將上海豬場送檢的1份豬瘟疫苗接種于MDBK細胞，盲傳15代后仍無致細胞病變效應(yīng)，但通過RT-PCR和序列鑒定為BVDV-2型毒株，表明該豬瘟疫苗中的確污染BVDV。以上研究結(jié)果表明，我國豬瘟弱毒活疫苗中存在嚴重的BVDV、PCV-2等外源病毒污染現(xiàn)象，而RT-PCR檢測方法敏感性高、特異性強、操作簡單、檢測快速，在動物豬瘟疫苗的外源病毒檢驗中將具有廣闊的應(yīng)用前景。

3.2 熒光定量RT-PCR方法

Zhang X J等［28］建立了可檢測區(qū)分豬瘟野毒、豬瘟疫苗毒和BVDV-Ⅰ的三重實時熒光定量RTPCR方法，該方法檢測豬瘟野毒、豬瘟疫苗毒和BVDV-Ⅰ的下限分別為4.5、10、3.2TCID50，提供了一個鑒別豬瘟野毒、豬瘟疫苗毒和BVDV-Ⅰ的方法。陳其兵等［29］建立的快速檢測BVDV的實時熒光定量RT-PCR方法，檢測胎牛血清和豬瘟細胞苗半成品共計20份樣品，結(jié)果BVDV陽性6份，陽性率達30%（6／20）。韓文等［30］對278批次 HCLV 疫苗進行BVDV污染情況檢測，結(jié)果有42批（15.1%）疫苗存在BVDV污染。實時熒光定量RTPCR檢測方法敏感、特異、快速、準確，可用于牛血清及豬瘟疫苗等生物制品中BVDV等外源病毒的快速定量檢測。沈志強等［31］建立了BVDV SYBR GreenⅠ實時定量RT-PCR檢測方法，并應(yīng)用該方法檢測了山東綠都生物科技有限公司的豬瘟脾淋疫苗半成品樣品125份，疫苗成品樣品86份，未檢出BVDV，為疫苗的純凈性與安全性提供了技術(shù)保障。

4 結(jié)語

疫苗效價的高低是判定疫苗合格與否的關(guān)鍵指標，而無外源病毒和支原體污染是保證疫苗效價及安全的首要因素。及時、準確、快速的檢測豬瘟疫苗及其半成品、原輔材料中的純凈性，以及準確的定量監(jiān)測豬瘟病毒含量是生產(chǎn)合格疫苗的有效保證。盡管目前這些新型的替代檢驗方法尚未上升成為國家標準，但在豬瘟疫苗生產(chǎn)企業(yè)的生產(chǎn)與檢驗中也充分體現(xiàn)出了重要的關(guān)鍵的檢驗參考價值，相信隨著這些分子生物學和免疫學技術(shù)檢驗方法的進一步完善與標準化及廣泛應(yīng)用，豬瘟疫苗的質(zhì)量檢驗方法必將會不斷完善，將會走進每一個豬瘟疫苗生產(chǎn)企業(yè)，全面提高豬瘟疫苗質(zhì)量檢驗水平，在豬瘟疫苗質(zhì)量檢驗實踐中不斷總結(jié)經(jīng)驗，凝聚質(zhì)量檢驗標準共識，上升為國家法定標準，從而促進我國豬瘟疫苗與豬瘟防控事業(yè)的穩(wěn)定、健康發(fā)展。

［1］Simon G，Le Dimna M，Le Potier M F，et al.Molecular tracing of classical swine fever viruses isolated from wild boars and pigs in France from 2002to 2011［J］.Vet Microbiol，2013，166（3-4）：631-638.

［2］楊小燕，劉建奎，魏春華，等.豬瘟病毒福建野毒分離株FJ-1E2基因序列分析［J］.動物醫(yī)學進展，2013，34（8）：46-50.

［3］Seo S W，Sunwoo S Y，Hyun B H，et al.Detection of antibodies against classical swine fever virus in fecal samples from wild boar［J］.Vet Microbiol，2012，161（1-2）：218-221.

［4］Postel A，Jha V C，Schmeiser S，et al.First molecular identification and characterization of classical swine fever virus isolates from Nepal［J］.Arch Virol，2013，158（1）：207-210.

［5］沈志強.豬瘟疫苗的研究概況、選擇及科學使用［J］.飼料與畜牧：規(guī)模養(yǎng)豬，2013（2）：37-41.

［6］祖立闖，謝金文，唐 娜，等.豬瘟強毒與疫苗毒鑒別診斷方法的研究進展［J］.畜牧與獸醫(yī)，2012，44（3）：96-100.

［7］李 嬌，祖立闖，王 艷，等.豬瘟疫苗免疫失敗原因分析與防制對策探討［J］.養(yǎng)豬，2013（4）：105-109.

［8］韋顯凱，鄭 敏，鄭列豐，等.廣西部分地區(qū)豬瘟免疫抗體產(chǎn)生效果的監(jiān)測分析［J］.動物醫(yī)學進展，2013，34（12）：250-252.

［9］Eberling A J，Bieker-Stefanelli J，Reising M M，et al.Development，optimization，and validation of a classical swine fever virus real-time reverse transcription polymerase chain reaction assay［J］.J Vet Diagn Invest，2011，23（5）：994-998.

［10］Nandi S，Muthuchelvan D，Ahuja A，et al.Prevalence of classical swine fever virus in India：a 6-year study （2004-2010）［J］.Transb Emerg Dis，2011，58（5）：461-463.

［11］Shyu R H，Shyu H F，Liu H W，et al.Colloidal gold-based immunochromatographic assay for detection of ricin［J］.Toxicon，2002，40（3）：255-258.

［12］李 嬌，沈志強，祖立闖，等.間接ELISA在豬瘟抗體檢測上的應(yīng)用［J］.動物醫(yī)學進展，2012，33（6）：126-129.

［13］李 安，崔言順，沈志強，等.SYBR GreenⅠ實時熒光定量RT-PCR檢測豬瘟疫苗病毒含量［J］.中國獸醫(yī)學報，2010，30（8）：1018-1022.

［14］葛 葉，張興娟，朱慶虎，等.熒光定量RT-PCR方法與兔體定型熱試驗對于檢測豬瘟兔化弱毒疫苗的平行關(guān)系［J］.中國預防獸醫(yī)學報，2011，33（9）：699-703.

［15］陳 鍇，姚華偉，王長江，等.熒光定量PCR作為豬瘟兔化弱毒疫苗效價檢驗替代方法的研究與應(yīng)用［J］.中國農(nóng)業(yè)科學，2013，46（1）：162-169.

［16］唐紅慧，杜希珍，劉大偉，等.應(yīng)用豬瘟抗原／血清ELISA測定豬瘟兔化弱毒疫苗中的病毒含量［J］.金陵科技學院學報，2010，26（4）：73-78.

［17］蔣 卉，戴志紅，王在時，等.豬瘟兔化弱毒疫苗效力檢驗替代方法研究I家兔效力檢驗ELISA方法初探［J］.中國獸醫(yī)雜志，2013，49（5）：9-12.

［18］李 嬌，王金良，祖立闖，等.豬瘟病毒重組E2蛋白PPAELISA抗體檢測試劑盒的研制及應(yīng)用［J］.中國獸醫(yī)學報，2011，31（10）：1390-1394.

［19］陳龍賓，王愛華，蘇小庚，等.豬瘟病毒膠體金免疫層析檢測方法的建立及應(yīng)用［J］.中國獸醫(yī)科學，2007，37（6）：496-499.

［20］李華瑋，鄭 鳴.膠體金免疫層析法檢測豬瘟（強弱毒區(qū)分）抗體研究［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學，2012，39（7）：130-132.

［21］Uphoff C C，Drexler H G.Detection of mycoplasma contaminations［J］.Meth Mol Biol，2013，94（6）：1-13.

［22］張 娜，李書光，陳金龍，等.培養(yǎng)結(jié)合PCR檢測生物制品支原體污染的研究［J］.中國人獸共患病學報，2012，28（11）：98-100.

［23］蒙業(yè)軍.巢式PCR在動物疫苗支原體污染檢測中的應(yīng)用［J］.中國動物保健，2013，15（7）：21-23.

［24］祖立闖，王金良，李 嬌，等.牛病毒性腹瀉病毒套式RTPCR檢測方法的建立及初步應(yīng)用［J］.中國獸醫(yī)學報，2010，32（12）：1598-1601.

［25］葉兆美.豬瘟和藍耳病疫苗中BVDV和PCV污染情況調(diào)查［J］.四川畜牧獸醫(yī)，2012，39（3）：32-33.

［26］曹玉美，伍少欽，秦榮香，等.豬瘟疫苗中BVDV污染情況初探［J］.規(guī)模養(yǎng)豬，2012（10）：36-38.

［27］陶 潔，王 銀，王 娟，等.豬瘟疫苗中牛病毒性腹瀉病毒2型的檢測［J］.中國預防獸醫(yī)學報，2012，34（7）：581-583.

［28］Zhang X J，Han Q Y，Sun Y，et al.Development of a triplex TaqMan real-time RT-PCR assay for differential detection of wild-type and HCLV vaccine strains of classical swine fever virus and bovine viral diarrhea virus 1［J］.Res Vet Sci，2012，92（3）：512-518.

［29］陳其兵，薛 霜，漆世華，等.牛病毒性腹瀉-黏膜病病毒Taq-Man熒光定量RT-PCR檢測方法的建立及初步應(yīng)用［J］.中國獸藥雜志，2012，46（4）：4-6.

［30］韓 文，王 楠，張興娟，等.應(yīng)用定量RT-PCR對豬瘟兔化弱毒疫苗的質(zhì)量評價研究［J］.中國預防獸醫(yī)學報，2012，34（6）：464-467.

［31］沈志強，郭顯坡，王金良，等.SYBR GreenⅠ實時RT-PCR檢測牛病毒性腹瀉-黏膜病病毒方法的建立及初步應(yīng)用［C］／／Proceedings of 2010First International Conference on Cellular；Molecular Biology；Biophysics and Bioengineering，2010，5：53-57.