大蒜辣素對高糖環(huán)境下肝癌細胞HepG2/mdr耐藥性影響及其機制研究

燕丹，童本定，丁年羊，吳楠，王蕾，唐文婧，魏青

(江蘇省腫瘤醫(yī)院，江蘇 南京 210009)

·論 著·

大蒜辣素對高糖環(huán)境下肝癌細胞HepG2/mdr耐藥性影響及其機制研究

燕丹，童本定，丁年羊，吳楠，王蕾，唐文婧，魏青

(江蘇省腫瘤醫(yī)院，江蘇 南京 210009)

目的:探討大蒜辣素(allicin)對高糖環(huán)境下肝癌細胞HepG2/mdr耐藥性影響及其機制。方法：采用細胞計數(shù)試劑盒(Cell Counting Kit-8)檢測細胞株HepG2/mdr活性； RT-PCR檢測allicin作用后HepG2/mdr中晚期糖基化終產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation endproducts，RAGE)、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)、多藥耐藥基因-1(multidrug resistance-1，MDR1) 的轉(zhuǎn)錄水平；蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blotting)檢測allicin作用后HepG2/mdr細胞中相關(guān)基因的蛋白表達。結(jié)果:HepG2/mdr細胞呈對數(shù)生長，可以作為后續(xù)實驗的靶細胞。RT-PCR和Western blotting檢測表明，隨著allicin質(zhì)量濃度的增加，RAGE、NF-κB、MDR1 轉(zhuǎn)錄水平降低，蛋白表達量減少，呈現(xiàn)劑量依賴性。結(jié)論:allicin能通過影響腫瘤細胞NF-κB的核轉(zhuǎn)錄因子活性調(diào)控下游 MDR1 基因的表達，從而逆轉(zhuǎn)高糖狀態(tài)下HepG2/mdr細胞的耐藥性。

大蒜辣素; 肝癌細胞HepG2/mdr; 多藥耐藥

高糖環(huán)境下肝癌細胞耐藥現(xiàn)象產(chǎn)生與上調(diào)多藥耐藥基因MDR1(multidrug resistance-1，MDR1)的表達有關(guān)[1]。該基因的蛋白表達受到高度調(diào)控，特別是在轉(zhuǎn)錄水平[2]。大蒜辣素(allicin)為大蒜有效成分，含還原態(tài)硫，具有較強的抗氧化能力，歐洲藥典等將其當(dāng)作大蒜有效成分標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[3]。 長期食用大蒜可以降低多種腫瘤(特別是胃腸道腫瘤)的發(fā)生發(fā)展[4]。目前國內(nèi)外的流行病學(xué)調(diào)查和試驗研究證明，allicin具有良好的預(yù)防腫瘤發(fā)生和抑制腫瘤生長作用[5]。allicin可以通過多種機制來對腫瘤進行抑制，如影響致癌物代謝、誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡、影響腫瘤細胞周期、抗氧化以及調(diào)節(jié)免疫[6-7]。allicin如何逆轉(zhuǎn)高糖環(huán)境下腫瘤細胞多藥耐藥性，至今未見報道，值得深入研究。

1 材料與方法

1.1 材料

晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)購自BioVision公司，純度大于98%，用DMSO配置成母液，4℃冰箱保存，臨用前稀釋成所需質(zhì)量濃度。人肝癌細胞(human hepatocarcinoma cells)HepG2，購自中國科學(xué)院上海細胞庫，HepG2/mdr細胞[8]為本課題組前期實驗誘導(dǎo)的阿霉素耐藥細胞株。胰蛋白酶、低糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自Gibco公司，二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購自美國Sigma公司。青霉素、鏈霉素為杭州四季青公司產(chǎn)品。TRLzol購自美國Gibco公司，cDNA合成試劑盒、DEPC水為美國Fermentas公司產(chǎn)品。Western blotting試劑盒購自英國ABCam公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及觀察 HepG2細胞培養(yǎng)于含10%FBS的低糖DMEM培養(yǎng)液中，37℃、體積分數(shù)5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察，細胞生長良好無污染，透明度大、折光性強、可見到很多分裂期細胞，呈單層貼壁生長。

1.2.2實驗分組 實驗分為陽性對照組(培養(yǎng)液中含有終質(zhì)量濃度為400 μg·ml-1的AGEs)、空白對照組(單純培養(yǎng)液培養(yǎng))和AGEs-Allicin組(3組藥物干預(yù)實驗的培養(yǎng)液中AGEs質(zhì)量濃度固定為400 μg·ml-1，allicin終質(zhì)量濃度分別設(shè)定為6、12和24 μg·ml-1)。

1.2.3CCK-8法繪制細胞生長曲線 取對數(shù)生長期的細胞，用含10%EDTA胰蛋白酶消化，分別制備HepG2和HepG2/mdr單細胞懸液，以細胞數(shù)每孔2 500個接種至96孔培養(yǎng)板，每孔100 μl。按CCK-8檢測試劑盒說明書分別于細胞貼壁后(0 h)、24、48、72、96h時間點，每孔加入CCK-8試劑10 μl。分光光度計分別測450 nm時的吸光度值(A)，以培養(yǎng)時間(t)為橫坐標(biāo)，A值為縱坐標(biāo)，繪制細胞的生長曲線，并在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

1.2.4RT-PCR檢測目的基因轉(zhuǎn)錄水平 提取細胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo(dT)為引物(引物設(shè)計見表1)，利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進行PCR擴增，從而獲得檢測基因表達。PCR儀設(shè)定反應(yīng)程序為：95 ℃，5 min，94 ℃，30 s；退火58 ℃，30 s，延伸72 ℃，30 s；擴增循環(huán)均為35個循環(huán)，72 ℃延伸加時5 min，冷卻至4 ℃，-20 ℃保存待用。PCR產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠電泳中觀察，紫外分光儀成像分析。

表1 引物設(shè)計

1.2.5Western blotting檢測蛋白表達變化 提取細胞總蛋白及測定蛋白濃度參照試劑盒說明。按每5×106細胞加入100 μl RIPA裂解液，裂解10 min，制備總蛋白，BCA法測定各組細胞蛋白濃度，SDS-PAGE電泳分離各目的基因相關(guān)蛋白。將分離的條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，一抗(鼠抗人：1∶200)4℃孵育12 h，PBS洗膜5 min×4次;二抗(兔抗山羊∶1∶1 000)室溫孵育2 h，PBS洗膜5 min×4次。實驗所得Western blotting條帶，由Photoshop軟件處理，在Bandscan分析軟件中測得各自的總灰度值，進行定量比較分析，并且均采用自身β-actin灰度值校正。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

每項實驗至少重復(fù)3次，應(yīng)用SPSS 17.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較用t檢驗，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HepG2/mdr細胞形態(tài)及生長的變化

細胞貼壁72 h后，HepG2、HepG2/mdr分別進入對數(shù)生長期，倒置顯微鏡下觀察，細胞生長良好，透明度大、折光性強，可見很多分裂期細胞，呈單層貼壁生長(圖1)。 從生長曲線分析可見，HepG2/mdr生長速度雖然較HepG2細胞生長緩慢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖2)。鑒于本研究主要探究allicin對高糖環(huán)境下肝癌細胞HepG2耐藥性的影響，故本實驗選用HepG2/mdr細胞作為后續(xù)實驗的靶細胞。

A.HepG2組； B.HepG2/mdr組

圖1 HepG2和HepG2/mdr細胞72 h形態(tài)圖(×200)

圖2 HepG2與HepG2/mdr生長曲線

2.2 高糖環(huán)境下allicin對HepG2細胞RAGE、NF-κB、MDR1 mRNA表達的影響

提取的總RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示出的18S和28S的RNA區(qū)帶清晰明亮，且兩者條帶亮度比例約為1∶2，說明提取的RNA無明顯降解，如圖3。以目的基因與β-actin的灰度比值代表mRNA相對表達水平，檢測各組灰度值，結(jié)果顯示：allicin不同質(zhì)量濃度組間RAGE、NF-κB、MDR1 mRNA表達水平不同，隨著allicin質(zhì)量濃度的增加，RAGE、NF-κB、MDR1 mRNA表達減少(圖4)，呈現(xiàn)劑量依賴性，與對照組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

圖3 HepG2細胞總RNA完整性鑒定

A.陽性對照組；B.空白對照組；C.AGEs-allicin組(6 μg·ml-1); D.AGEs-allicin組(12 μg·ml-1)； E.AGEs-allicin組(24 μg·ml-1)

圖4 高糖環(huán)境下allicin對HepG2細胞RAGE、NF-κB、MDR1 mRNA表達的影響

與陽性對照組比較，aP<0.05； 與陰性對照組比較，bP<0.05

2.3 高糖環(huán)境下allicin對HepG2細胞RAGE、NF-κB、MDR1 蛋白表達的影響

在高糖環(huán)境下，不同濃度allicin作用HepG2/mdr細胞后，RAGE、NF-κB、MDR1的蛋白表達水平的變化見圖5。經(jīng)allicin處理HepG2/mdr細胞24 h后，RAGE、NF-κB、MDR1蛋白表達下調(diào)，同對照組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中陽性對照組3種蛋白表達量最高(表3)。

A.陽性對照組； B.陰性對照組； C.AGEs-allicin組(6 μg·ml-1)；D.AGEs-allicin組(12 μg·ml-1);E.AGEs-allicin組(24 μg·ml-1)

圖5 高糖環(huán)境下allicin對HepG2細胞RAGE、NF-κB、MDR1 蛋白表達的影響

3 討 論

我國是世界上肝癌發(fā)病最集中的國家，每年新發(fā)病例約占全球的50%以上[9]；而在糖尿患者群中，肝細胞癌的發(fā)病率明顯高于一般人群。高血糖狀態(tài)促進糖基化過程加快，導(dǎo)致體內(nèi)AGEs蓄積，AGEs與錨定在細胞膜表面的蛋白受體RAGE 結(jié)合[10]，激活以無活性的形式存在于胞漿中NF-κB發(fā)生磷酸化并降解，進入細胞核內(nèi)，與DNA鏈上特異部位結(jié)合，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活活性，啟動下游與腫瘤生物學(xué)行為相關(guān)的多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，導(dǎo)致某些基因表達水平的改變[11-12]。

近年來，隨著化療方案的不斷改進，治療腫瘤的效果已明顯改善。然而多藥耐藥(multi-drug resistance，MDR)的產(chǎn)生則成為目前肝癌化療不能有效緩解或者緩解后復(fù)發(fā)的主要原因。由MDR1編碼的糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)所發(fā)生的外排泵作用是細胞內(nèi)藥物濃度下降從而導(dǎo)致MDR的主要原因。研究表明，轉(zhuǎn)染變異的NF-κB抑制蛋白(inhibitor of NF-κB，IκB)可抑制多種腫瘤細胞NF-κB的活性，減少MDR1的表達，增強細胞內(nèi)化療藥物的濃度，細胞凋亡率升高，從而逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的多藥耐藥[13]。由此可見，MDR1基因及其產(chǎn)物的過度表達扮演了重要角色。然而，MDR1

與陽性對照組比較，aP<0.05； 與陰性對照組比較，bP<0.05

的化學(xué)逆轉(zhuǎn)劑因毒性較大而難于廣泛用于臨床，尋找開發(fā)高效低毒能夠逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性的藥物是目前研究的重要課題。

流行病學(xué)調(diào)查顯示，經(jīng)常攝入大蒜的人其發(fā)生腫瘤的幾率比未經(jīng)常攝入大蒜的人發(fā)生腫瘤的幾率低，且在已經(jīng)發(fā)生腫瘤的患者中經(jīng)常攝入大蒜的人其腫瘤發(fā)展的速度比未經(jīng)常攝入大蒜的人腫瘤發(fā)展的速度慢[14]。大蒜作為一種對人類疾病有確切療效的天然植物藥物，現(xiàn)代藥理學(xué)證明其中的活性成分二烯丙基硫代亞磺酸酯，俗稱大蒜辣素(allicin)，是其重要藥用功能的物質(zhì)基礎(chǔ)[15]。allicin能否逆轉(zhuǎn)高糖環(huán)境下腫瘤細胞多藥耐藥性，至今未見文獻報道，值得深入研究。

本實驗通過課題組前期實驗誘導(dǎo)的阿霉素耐藥細胞株HepG2/mdr細胞[8]探究allicin對高糖環(huán)境下肝癌細胞HepG2耐藥性的影響。 CCK-8結(jié)果表明，HepG2/mdr是研究高糖環(huán)境下腫瘤MDR很好的工具。 RT-PCR及Western blotting結(jié)果證實了allicin通過影響腫瘤細胞核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活性，抑制HepG2/mdr細胞MDR1 mRNA表達和降低MDR1蛋白表達水平，說明allicin能逆轉(zhuǎn)HepG2/mdr細胞的多藥耐藥性。

總之，allicin除可以通過影響致癌物代謝、誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡、影響腫瘤細胞周期、抗氧化以及調(diào)節(jié)免疫等機制抑制腫瘤外，還可能具有逆轉(zhuǎn)高糖環(huán)境下腫瘤細胞多藥耐藥性作用。

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Mechanism of allicin on drug resistance of HepG2/mdr hepatocellular carcinoma cells in high glucose

YAN Dan，TONG Ben-ding，DING Nian-yang，WU Nan，WANG Lei，TANG Wen-jing，WEI Qin

(JiangsuCancerHospital，Nanjing210009，China)

Objective: To investigated mechanism of allicin on drug resistance of HepG2/mdr hepatocellular carcinoma cells in high glucose. Methods: Cell counting kit-8(CCK-8) assay was used to assess the HepG2/mdr cells activity，The expression change of mRNA and protein among RAGE、NF-κB and MDR1 were examined by RT-PCR and Western-blot. Results: The results of CCK-8 assay showed that HepG2/mdr cells present logarithmic growth could be used as target cells in the following study，RT-PCR and Western blotting experimental results showed that allicin could reduce transcription level and decrease protein expression of RAGE、NF-κB、MDR1. the phenomena were more obvious when allicin concentration increasing. Conclusion: Allicin could reverse drug resistance of tumor cells to therapy. It showed that MDR was dramatically down-regulated in a Allicin-dependent manner in response to NF-κB changes．

allicin; hepatocellular carcinoma HepG2/mdr cells; multidrug resistance

2015-07-02

2015-08-28

燕丹(1980-)，女，安徽蕪湖人，主管藥師，藥學(xué)博士。E-mail:sharon06243731@sina.com

魏青 E-mail:jsschwq@sina.com

燕丹，童本定，丁年羊，等.大蒜辣素對高糖環(huán)境下肝癌細胞HepG2/mdr耐藥性影響及其機制研究[J].東南大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2015，34(6)：987-991.

R735.7

A

1671-6264(2015)06-0987-05

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.06．029