胡椒堿聯(lián)合順鉑對肺腺癌A549細(xì)胞生長及MMP-2、VEGF的影響

何含含，岳紅梅，魯文強(qiáng)，羅亞娟

(1.蘭州大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000； 2.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，甘肅 蘭州 730000)

·論 著·

胡椒堿聯(lián)合順鉑對肺腺癌A549細(xì)胞生長及MMP-2、VEGF的影響

何含含1，岳紅梅2，魯文強(qiáng)1，羅亞娟1

(1.蘭州大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000； 2.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，甘肅 蘭州 730000)

目的：研究胡椒堿與順鉑聯(lián)合對肺腺癌A549細(xì)胞生長和凋亡的作用，以及檢測A549細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF) 的表達(dá)水平。方法：MTT法檢測不同質(zhì)量濃度的胡椒堿、順鉑及兩者聯(lián)合對A549細(xì)胞增殖的影響。流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡。RT-PCR測定各組A549細(xì)胞MMP-2 mRNA和VEGF mRNA的表達(dá)變化。結(jié)果：胡椒堿與順鉑均可抑制人肺腺癌A549細(xì)胞的生長，呈時(shí)間—濃度依賴性(P<0.05)；聯(lián)合組隨作用時(shí)間延長，對A549細(xì)胞的抑制效應(yīng)增加(P<0.05)。聯(lián)合組較對照組、胡椒堿組、順鉑組的A549細(xì)胞凋亡率顯著增高(P<0.05)。聯(lián)合組與對照組及單用胡椒堿、順鉑比較，MMP-2 mRNA和VEGF mRNA的表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)。結(jié)論：胡椒堿顯著提高順鉑對肺腺癌A549細(xì)胞的生長抑制和促進(jìn)凋亡效應(yīng)，降低MMP-2、VEGF的表達(dá)，從而可能抑制肺癌細(xì)胞的遷移。

胡椒堿； 順鉑； A549細(xì)胞； 基質(zhì)金屬蛋白酶-2； 血管內(nèi)皮生長因子

肺癌是目前世界上最常見的惡性腫瘤及腫瘤相關(guān)主要死亡原因之一[1]。非小細(xì)胞肺癌在肺癌病例中占大多數(shù)，具有較高的發(fā)生率和小于15%的五年生存率。目前，非小細(xì)胞肺癌的化療中以鉑類與他類化療藥物的聯(lián)合作為標(biāo)準(zhǔn)治療方案[2]。然而，這類化療方案仍存在諸多缺點(diǎn)，如嚴(yán)重的毒性反應(yīng)和致命的器官功能障礙等。因此，探尋鉑類與新的藥物聯(lián)合治療肺癌是臨床實(shí)踐的迫切需要。

中國傳統(tǒng)醫(yī)藥的化合物在抗腫瘤方面的研究逐漸開展，并且部分化合物已被列入腫瘤治療的新方案[3]。胡椒堿是一種存在于黑胡椒和蓽茇的刺激性生物堿，表現(xiàn)廣泛的生物效應(yīng)，如抗炎[4]、神經(jīng)保護(hù)[5]、抗氧化[6]和心血管保護(hù)作用[7]等。近年胡椒堿抑制腫瘤細(xì)胞生長的有效性已得到證實(shí)。故本研究觀察胡椒堿聯(lián)合順鉑對肺腺癌A549細(xì)胞生長和凋亡的影響，以及檢測A549細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表達(dá)水平。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1細(xì)胞 人肺腺癌A549細(xì)胞株(中山大學(xué)腫瘤實(shí)驗(yàn)室)。

1.1.2藥物 胡椒堿(天津士蘭科技有限公司)；順鉑(江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司)。

1.1.3試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基和胰酶(美國Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；MTT(美國Sigma公司)；Annexin-PI試劑盒(美國Maxin Bioteeh公司)；RNA抽提試劑盒(陜西先鋒生物科技有限公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(加拿大ABM公司)；PCR所用引物(上海生工生物工程股份有限公司)。

1.1.4儀器 CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；酶標(biāo)儀(華東電子醫(yī)療裝備有限公司)；流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；PCR儀(美國ABI公司)；電泳儀(北京市六一儀器廠)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 對人肺腺癌A549細(xì)胞株采用含10%滅活的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，按時(shí)觀察細(xì)胞貼壁狀態(tài)并換液及傳代。實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞均處于對數(shù)生長期。

1.2.2MTT法測定細(xì)胞活力 取A549細(xì)胞，以每孔5×103個(gè)細(xì)胞隨機(jī)接種至96孔板，然后將其置于培養(yǎng)箱。次日上午分組并加藥處理，對照組的藥物質(zhì)量濃度為0 μg·ml-1；胡椒堿組為12.5、25、50、100 μg·ml-1；順鉑組為0.5、1、2、4 μg·ml-1；聯(lián)合組為胡椒堿50 μg·ml-1和順鉑2 μg·ml-1。各組分別設(shè)置24、48、72 h 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，然后培養(yǎng)至各時(shí)間點(diǎn)時(shí)取出相應(yīng)的96孔板，在避光狀態(tài)下各孔加入20 μl MTT液(5 mg·ml-1)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后移除孔內(nèi)培養(yǎng)基，各孔加入150 μl二甲基亞砜，用酶標(biāo)儀在570nm波長測定各孔的光密度(OD)。計(jì)算抑制率：抑制率(%)=(1-OD實(shí)驗(yàn)組)/OD對照組×100%。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡 取A549細(xì)胞，以每孔2×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板后置于培養(yǎng)箱孵育24 h。對照組只加DMEM高糖培養(yǎng)基；單藥組為胡椒堿50 μg·ml-1、順鉑2 μg·ml-1；聯(lián)合組為胡椒堿50 μg·ml-1和順鉑2 μg·ml-1。然后培養(yǎng)48 h后消化細(xì)胞，洗滌和離心以收集細(xì)胞并懸浮，固定和避光染色15 min后通過流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡率，每組樣品中至少分析1×104個(gè)細(xì)胞。

1.2.4RT-PCR測定MMP-2 mRNA和VEGF mRNA的表達(dá) 取A549細(xì)胞，以每孔8×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板，各組分別處理并培養(yǎng)48 h。用Fast200 RNA提取試劑盒提取各組RNA，測定其純度和濃度，然后PCR儀上反轉(zhuǎn)錄合成cDNA并擴(kuò)增。引物詳情見表1。反轉(zhuǎn)錄條件：25 ℃10 min，42 ℃50 min，85 ℃5 min。MMP-2擴(kuò)增條件：94 ℃5 min；94 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。VEGF和β-actin的退火溫度分別是58 ℃、55 ℃，其他均與MMP-2的反應(yīng)條件相同。取6 μl PCR產(chǎn)物采用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察及拍照，運(yùn)用ImageJ軟件分析凝膠條帶，計(jì)算以β-actin表達(dá)量為基準(zhǔn)的MMP-2 mRNA和VEGF mRNA的相對表達(dá)量。

表1 引物序列及產(chǎn)物大小

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 胡椒堿對A549細(xì)胞的抑制作用

胡椒堿抑制A549細(xì)胞的增殖，并且其抑制作用隨著作用時(shí)間的延長、藥物濃度的加大，呈增強(qiáng)趨勢(P<0.05)。見表2。

與相同作用時(shí)間的對照組相比，aP<0.05;與相同藥物濃度24 h的相比，bP<0.05；與相同藥物濃度48 h的相比，cP<0.05

2.2 順鉑對A549細(xì)胞的抑制作用

順鉑抑制A549細(xì)胞的增殖，并且抑制作用隨著作用時(shí)間的延長、藥物濃度的加大，呈增強(qiáng)趨勢(P<0.05)。見表3。

2.3 胡椒堿聯(lián)合順鉑對A549細(xì)胞的抑制作用

胡椒堿聯(lián)合順鉑對A549細(xì)胞的抑制作用較為明顯，隨著作用時(shí)間的延長，聯(lián)合用藥的抑制作用逐漸增強(qiáng)(P<0.05)；而相同的作用時(shí)間下，聯(lián)合用藥也比單用胡椒堿、順鉑的抑制效應(yīng)強(qiáng)(P<0.05)。見表4。

與相同作用時(shí)間的對照組相比，aP<0.05;與相同藥物濃度24 h的相比，bP<0.05；與相同藥物濃度48 h的相比，cP<0.05

與相同作用時(shí)間的聯(lián)合組相比，aP<0.05;與相同藥物濃度24 h的相比，bP<0.05；與相同藥物濃度48 h的相比，cP<0.05

2.4 胡椒堿聯(lián)合順鉑對A549細(xì)胞凋亡的影響

聯(lián)合組與對照組、胡椒堿組、順鉑組相比，細(xì)胞凋亡率明顯增高[分別為(55.52±1.33)%、(0.33±0.55)%、(10.37±0.97)%、(16.56±0.56)%，P<0.05]。見圖1。

2.5 胡椒堿聯(lián)合順鉑對A549細(xì)胞MMP-2 mRNA和VEGF mRNA的表達(dá)的影響

胡椒堿和順鉑分別處理A549細(xì)胞48 h后MMP-2 mRNA和VEGF mRNA的表達(dá)均降低，與對照組差異明顯(P<0.05)。聯(lián)合組較對照組、胡椒堿組和順鉑組的MMP-2 mRNA和VEGF mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見圖2、表5。

3 討 論

近年人們對草本植物重要性的認(rèn)識逐步提高。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在1940年至2006年6月產(chǎn)生的155種小分子抗腫瘤藥物，其中大約47%是天然產(chǎn)物或它們的衍生物[8]。胡椒堿作為植物的提取物，目前在多種腫瘤中顯露出抑制效應(yīng)[9-16]。胡椒堿可以增加乳腺癌和肺癌細(xì)胞對常規(guī)化療藥物的敏感性，并且此作用呈現(xiàn)劑量依賴性[17]。胡椒堿也能增強(qiáng)紫杉醇對Her-2過表達(dá)乳腺癌細(xì)胞的敏感性及放療對小鼠黑色素瘤、結(jié)腸癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞的殺傷作用[18-20]。這些研究都表明胡椒堿可用于腫瘤的聯(lián)合治療。

圖1 各處理組對A549細(xì)胞作用48 h后的凋亡率

A.對照組； B.胡椒堿組； C.順鉑組； D.聯(lián)合組

圖2 各處理組對A549細(xì)胞作用48h后MMP-2 mRNA和VEGF mRNA的表達(dá)

與對照組相比，aP<0.05；與聯(lián)合組相比，bP<0.05

本研究探討胡椒堿聯(lián)合順鉑對A549細(xì)胞生長和凋亡的影響，我們明確了胡椒堿能夠增強(qiáng)肺癌細(xì)胞在順鉑處理時(shí)的殺傷效應(yīng)。MTT結(jié)果表明,不同質(zhì)量濃度的胡椒堿、順鉑分別與A549細(xì)胞作用24、48、72 h均有抑制效應(yīng)。胡椒堿聯(lián)合順鉑處理A549細(xì)胞的抑制效應(yīng)強(qiáng)于單用胡椒堿或順鉑，且聯(lián)合組作用48 h與單用順鉑4 μg·ml-1作用72 h的抑制率大致相當(dāng)，分別是(60.06±0.14)%與(59.77±0.10)%，表明聯(lián)合用藥通過降低胡椒堿或順鉑的單用劑量和縮短作用時(shí)間而發(fā)揮較高的抑制效應(yīng)。細(xì)胞凋亡是機(jī)體的一種防御機(jī)制，主要通過清除惡性細(xì)胞，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，從而阻斷疾病的發(fā)生和進(jìn)展，因此研究凋亡機(jī)制，干預(yù)凋亡通路的策略成為疾病治療的突破點(diǎn)[21]。細(xì)胞凋亡的激活是化療抑制腫瘤生長的重要途徑之一。胡椒堿誘導(dǎo)乳腺癌[9]、肺癌[10]、前列腺癌[11]等惡性腫瘤細(xì)胞的凋亡已經(jīng)證實(shí)。流式細(xì)胞術(shù)顯示，胡椒堿聯(lián)合順鉑比其他各組的凋亡率呈現(xiàn)明顯的增高，提示胡椒堿能夠促進(jìn)順鉑誘導(dǎo)A549細(xì)胞的凋亡。

侵襲和轉(zhuǎn)移的激活是惡性腫瘤的重要標(biāo)志，主要與細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的降解有關(guān)。MMPs屬于鋅依賴性內(nèi)肽酶的家族，能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜，從而促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。Zhang等[12]發(fā)現(xiàn)，胡椒堿可抑制MMP-2、MMP-9的表達(dá)，降低兩者活性，從而抑制人骨肉瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。胡椒堿抑制小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞在體外的轉(zhuǎn)移，可能與減少M(fèi)MP-9和MMP-13的mRNA的表達(dá)有關(guān)；另外在乳腺癌4T1細(xì)胞的小鼠模型也觀察到其抑制肺轉(zhuǎn)移的作用[9]。這些研究均表明，胡椒堿抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制可能與MMPs的表達(dá)減少有關(guān)。本研究中胡椒堿組、順鉑組與對照組的MMP-2 mRNA表達(dá)相比均降低，聯(lián)合組較胡椒堿組、順鉑組的MMP-2 mRNA表達(dá)更低，提示胡椒堿、順鉑可能是通過降低MMP-2 mRNA的表達(dá)而調(diào)控肺癌的侵襲及轉(zhuǎn)移。

血管生成是腫瘤生長及擴(kuò)散的先決條件之一。VEGF是腫瘤血管生成的重要因子，可釋放活化因子，增加血管通透性，改變微環(huán)境從而誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的分化和遷移，吸引和刺激毛細(xì)血管的生長等。Doucette等[22]發(fā)現(xiàn)，胡椒堿阻斷PI3K/AKt信號傳導(dǎo)途徑的激活是抗血管生成的重要部分。PI3K/AKt信號可調(diào)控效應(yīng)因子的活化和轉(zhuǎn)錄缺氧誘導(dǎo)因子及VEGF的表達(dá)；而VEGF也能激活PI3K/AKT信號通路，在血管生成中二者發(fā)揮協(xié)同作用。本研究聯(lián)合組的VEGF mRNA較胡椒堿組、順鉑組、對照組均降低，提示胡椒堿和順鉑聯(lián)合可能通過抑制VEGF表達(dá)而發(fā)揮抑瘤效應(yīng)。

總之，本研究中我們發(fā)現(xiàn)胡椒堿、順鉑單用或聯(lián)合均可抑制A549細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)其凋亡，通過降低MMP-2、VEGF的表達(dá)進(jìn)而產(chǎn)生抑制癌細(xì)胞的遷移和血管生成的效應(yīng)；兩者聯(lián)合顯著增強(qiáng)誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡及降低其侵襲、遷移的能力，從而為探尋鉑類與生物堿類藥物聯(lián)合治療肺癌提供一種新策略，有必要進(jìn)一步研究兩者協(xié)同作用的分子機(jī)制和體內(nèi)抗腫瘤的效應(yīng)。

[1] BRAY F,JEMAL A,GREY N,et al.Global cancer transitions according to the Human Development Index (2008-2030):a population-based study[J].Lancet Oncol,2012,13(8):790-801．

[2] GOFFIN J,LACCHETTI C,ELLIS P M,et al.First-line systemic chemotherapy in the treatment of advanced non-small cell lung cancer:a systematic review[J].J Thorac Oncol,2010,5(2):260-274．

[3] WANG K L,HSIA S M,YEH J Y,et al.Anti-proliferative effects of evodiamine on human breast cancer cells[J].PLoS One,2013,8(6):e67297．

[4] BAE G S,KIM J J,PARK K C,et al.Piperine inhibits lipopolysaccharide-induced maturation of bone-marrow-derived dendritic cells through inhibition of ERK and JNK activation[J].Phytother Res,2012,26(12):1893-1897．

[5] CHONPATHOMPIKUNLERT P,WATTANATHORN J,MUCHIMAPURA S.Piperine,the main alkaloid of Thai black pepper,protects against neurodegeneration and cognitive impairment in animal model of cognitive deficit like condition of Alzheimer’s disease[J].Food Chem Toxicol,2010,48(3):798-802．

[6] MITTAL R,GUPTA R L.Invitroantioxidant activity of piperine[J].Methods Find Exp Clin Pharmacol,2000,22(5):271-274．

[7] TAQVI S I,SHAH A J,GILANI A H.Blood pressure lowering and vasomodulator effects of piperine[J].J Cardiovasc Pharmacol,2008,52(5):452-458．

[8] NEWMAN D J,CRAGG G M.Natural products as sources of new drugs over the last 25 years[J].J Nat Prod,2007,70(3):461-477．

[9] LAI L H,FU Q H,LIU Y,et al.Piperine suppresses tumor growth and metastasisinvitroandinvivoin a 4T1 murine breast cancer model[J].Acta Pharmacol Sin,2012,33(4):523-530．

[10] LIN Y,XU J,LIAO H,et al.Piperine induces apoptosis of lung cancer A549 cells via p53-dependent mitochondrial signaling pathway[J].Tumour Biol,2014,35(4):3305-3310．

[11] SAMYKUTTY A,SHETTY A V,DAKSHINAMOORTHY G,et al.Piperine,a bioactive component of pepper spice exerts therapeutic effects on androgen dependent and androgen independent prostate cancer cells[J].PLoS One,2013,8(6):e65889．

[12] ZHANG J,ZHU X,LI H,et al.Piperine inhibits proliferation of human osteosarcoma cells via G2/M phase arrest and metastasis by suppressing MMP-2/-9 expression[J].Int Immunopharmacol,2015,24(1):50-58．

[13] 鄭斌,王欣,麻彤輝.胡椒堿對人肝癌HepG2細(xì)胞抗腫瘤活性的體外實(shí)驗(yàn)研究[J].中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2012,16(2):218-220．

[14] 任杰,許園元,胡昆.胡椒堿對人胃癌SGC-7901細(xì)胞抗腫瘤活性的體外實(shí)驗(yàn)研究[J].常州大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2014,26(4):49-52．

[15] YAFFE P B,DOUCETTE C D,WALSH M,et al.Piperine impairs cell cycle progression and causes reactive oxygen species-dependent apoptosis in rectal cancer cells[J].Exp Mol Pathol,2013,94(1):109-114．

[16] FOFARIA N M,KIM S H,SRIVASTAVA S K.Piperine causes G1phase cell cycle arrest and apoptosis in melanoma cells through checkpoint kinase-1 activation[J].PLoS One,2014,9(5):e94298．

[17] LI S,LEI Y,JIA Y,et al.Piperine,a piperidine alkaloid from piper nigrum re-sensitizes P-gp,MRP1 and BCRP dependent multidrug resistant cancer cells[J].Phytomedicine,2011,19(1):83-87．

[18] DO M T,KIM H G,CHOI J H,et al.Antitumor efficacy of piperine in the treatment of human HER2-overexpressing breast cancer cells[J].Food Chem,2013,141(3):2591-2599．

[19] TAK J K,LEE J H,PARK J W.Resveratrol and piperine enhance radiosensitivity of tumor cells[J].BMB Rep,2012,45(4):242-246．

[20] GREENSHIELDS A L,DOUCETTE C D,SUTTON K M,et al.Piperine inhibits the growth and motility of triple-negative breast cancer cells[J].Cancer Lett,2015,357(1):129-140．

[21] 趙彥超,顧耘.細(xì)胞凋亡通路研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代醫(yī)學(xué),2013,41(4):285-288．

[22] DOUCETTE C D,HILCHIE A L,LIWSKI R,et al.Piperine,a dietary phytochemical,inhibits angiogenesis[J].J Nutr Biochem,2013,24(1):231-239．

Effect of piperine combined with cisplation on proliferation and MMP-2，VEGF of human lung adenocarcinoma A549 cell

HE Han-han1，YUE Hong-mei2，LU Wen-qiang1，LUO Ya-juan1

(1.TheFirstClinicalMedicalCollegeofLanzhouUniversity，Lanzhou73000，China； 2.DepartmentofRespiratory，theFirstAffiliatedHospitalofLanzhouUniversity，Lanzhou73000，China)

Objective: To investigate the proliferation and apoptosis of piperine combined with cisplation on A549 cells and the changes in the expression of MMP-2 and VEGF.Methods:MTT assay was used to detect the proliferation on A549 cells after treatment with series of monotherapy group (piperine or cisplation alone) or combination group (piperine combined with cisplation). Flow cytometry was performed to assess the cellular apoptosis. The expression of MMP-2，VEGF mRNA were measured by RT-PCR in each group.Results:Both piperine and cisplation could inhibit the growth of A549 cells in a time-dose dependent manner(P<0.05).With the increasing time，the cell proliferation was significantly inhibited in the combination group(P<0.05).The combination group also showed an obviously higher apoptosis rate than piperine alone，cisplation alone and control group，respectively(P<0.05). In addition，the expression of MMP-2 and VEGF mRNA in combination group were evidently lower than that of monotherapy group and control group(P<0.05).Conclusion:Piperine can evidently enhance the anti-proliferation and induce apoptosis effect of cisplation in A549 cells，as well as decrease the level of MMP-2 and VEGF mRNA，thus suppress cancer metastasis．

piperine; cisplation; A549 cell; matrix metalloproteinase-2; vascular endothelial growth factor

2015-05-13

2015-08-30

何含含(1990-)，男，陜西西安人，在讀碩士研究生。E-mail:hehanhan1990@126.com

岳紅梅 E-mail：yuehongmei18@sina.com

何含含，岳紅梅，魯文強(qiáng)，等.胡椒堿聯(lián)合順鉑對肺腺癌A549細(xì)胞生長及MMP-2、VEGF的影響[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2015，34(6)：962-967.

R734.2

A

1671-6264(2015)06-0962-06

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.06．023