非小細(xì)胞肺癌患者血清miR-133b的表達(dá)水平及其臨床意義探討

馮曉云，葛琴，陸志斌

(1.南通市腫瘤醫(yī)院 檢驗科，江蘇 南通 226361； 2.南京市浦口區(qū)中心醫(yī)院 胸外科，江蘇 南京 211800)

·論 著·

非小細(xì)胞肺癌患者血清miR-133b的表達(dá)水平及其臨床意義探討

馮曉云1，葛琴1，陸志斌2

(1.南通市腫瘤醫(yī)院 檢驗科，江蘇 南通 226361； 2.南京市浦口區(qū)中心醫(yī)院 胸外科，江蘇 南京 211800)

目的：探討非小細(xì)胞肺癌患者血清miR-133b的表達(dá)水平與臨床病理特征及疾病預(yù)后的關(guān)系。方法：將80例經(jīng)病理活檢證實為非小細(xì)胞肺癌患者納入此次研究的對象，同期選取進(jìn)行體檢的健康人群80例作為正常對照組，采用real-time熒光定量PCR方法檢測所有人員血清miR-133b的表達(dá)水平，進(jìn)一步分析非小細(xì)胞肺癌患者血清miR-133b的表達(dá)水平與患者的臨床及病理特征的關(guān)系。結(jié)果：非小細(xì)胞肺癌患者血清miR-133b表達(dá)水平(0.86±1.27)顯著低于正常對照組的表達(dá)水平(1.78±1.36)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=9.572，P=0.004)。非小細(xì)胞肺癌患者血清miR-133b的表達(dá)水平與病理分期、腫瘤分化程度、抽煙史及是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素密切相關(guān)(P<0.05)，與患者年齡、性別、腫瘤直徑及病理分型無關(guān)(P>0.05)；非小細(xì)胞肺癌患者術(shù)后miR-133b高表達(dá)者1年內(nèi)的生存率(73.8%)明顯高于miR-133b低表達(dá)者(52.6%)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=8.580，P=0.003)。結(jié)論：血清miR-133b的檢測有助于早期對非小細(xì)胞肺癌進(jìn)行篩選與診斷，其表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌臨床及病理特征、治療后存活時間具有明顯的相關(guān)性，對評估非小細(xì)胞肺癌的預(yù)后具有一定價值。

非小細(xì)胞肺癌； miR-133b； 表達(dá)； 生存率

隨著miRNA在腫瘤領(lǐng)域研究的不斷深入，許多microRNAs被發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中存在表達(dá)異常現(xiàn)象，其中miR-133b最為關(guān)注。miR-133b定位于6號染色體(6P12.2)，起初被認(rèn)為是一種與肌肉特異性相關(guān)的miRNA，其主要參與骨骼肌的生長與發(fā)育[1-2]。近年來有學(xué)者對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性和轉(zhuǎn)移陰性的非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)組織miRNA微陣列分析表明，NSCLC組織多種miRNA表達(dá)異常，其中miR-133b在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性NSCLC癌組織中的表達(dá)缺失或下調(diào)顯著高于淋巴轉(zhuǎn)移陰性NSCLC癌組織[3]。在多種腫瘤中miR-133b的過度表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡，miR-133b具有調(diào)控miRNA靶基因的作用，即轉(zhuǎn)錄后負(fù)調(diào)控作用，miR-133b可能是一個腫瘤抑制基因[4-5]。本研究通過檢測血清miR-133b在NSCLC患者中表達(dá)變化，探討其與臨床病理特征及疾病預(yù)后的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 研究對象

NSCLC組：經(jīng)活檢病理證實為NSCLC患者80例，均未行放化療及手術(shù)治療。按照WHO標(biāo)準(zhǔn)(2004版)[6]進(jìn)行組織學(xué)分類及UICC (2009年第7版)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行TNM分期。Ⅰ～Ⅲ期患者35例行手術(shù)治療，Ⅳ期患者45例行放、化療治療。正常對照組：同期進(jìn)行體檢的正常人80例。整理NSCLC觀察組和正常對照組的一般資料(如年齡、性別、既往病史、家族遺傳病史等)。記錄NSCLC觀察組患者的治療方式、吸煙與否、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移、是否遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、病理類型、TNM分期及分化程度等臨床資料，并對所有患者進(jìn)行為期1年的隨訪。

1.2 標(biāo)本采集

收集NSCLC組患者與正常對照組的血清標(biāo)本。于清晨空腹?fàn)顟B(tài)下抽取靜脈血5 ml,靜置20 min，室溫3 000 r·min-1離心10 min，分離血清。將血清轉(zhuǎn)移至收集管，按照400～500 μl·管-1分裝好，放入-80℃恒溫冰箱保存。

1.3 主要儀器與試劑

可見紫外自動掃描分光光度計(美國Stratagene公司)，7500 Real Time PCR System(美國ABI公司)，凝膠成像系統(tǒng)(美國UVP公司)，血清RNA試劑盒、mirVana Protein And RNA Isolation System(Life Technologies公司)，RT試劑盒、TaqMan miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green PCR Master Mix (美國ABI公司)，Golden view核酸染料(中生瑞泰科技)，EB(美國AMRESCO公司)，Elution Solution(上海葉舟生物科技有限公司)，DEPC(北京中生瑞泰科技公司)，Agarose瓊脂糖(美國Invitrogen公司)。

1.4 血清中總RNA的提取

取400 μl血清于離心管中，加入溶解試劑，充分混勻裂解；之后按RNA提取試劑盒說明書來分離提取總RNA。測定RNA濃度及純度，所抽RNA純度較好，可用于cDNA的合成。

1.5 逆轉(zhuǎn)錄合成

采用cDNA及real-time PCR將提取的RNA利用TaqMan miRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。U6作為內(nèi)標(biāo)。反應(yīng)體系：RNA模板2 μl、RT引物2 μl及ddH2O 7 μl?；靹蛞陨象w系，瞬時離心。70℃放置10 min，冰育2 min，再加入RT buffer 5×5 μl、dNTP mix(2.5 mm)2 μl、RNase inhibitor(40 U·μl-1) 0.5 μl、RT酶(200 U·μl-1)0.5 μl及ddH2O 17 μl?；靹蛞陨象w系，42℃ 60 min，70℃10 min。合成的cDNA放-80℃?zhèn)溆谩晒舛縋CR 檢測反應(yīng)體系：TaqMan Gene Expression Master Mix 10 μl、RT產(chǎn)物5 μl、正向Bulge-LoopTM miRNA Primer(5 μmol·L-1) 1 μl、反向Bulge-LoopTM miRNA Primer(5 μmol·L-1)1 μl、RNase-free H2O 3 μl。正向引物5′-GCGAGCACAGAATTAATACGA

CT-3′，反向引物5′-CACTATAGGTTTTTTTTTTTTCG-3′。熒光定量 PCR循環(huán)條件：95℃，30 s；95℃，5 s；60℃ 1 min(共40個循環(huán))。miRNA的相對表達(dá)量用RQ=2-△△CT來表示，△△CT=實驗組(CTmiRNA-CTU6)-對照組(CTmiRNA-CTU6)均值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計數(shù)資料以率表示。對miR-133b在NSCLC患者及正常受試者血清中的表達(dá)結(jié)果行t檢驗。對miR-133b低表達(dá)及高表達(dá)組間miRNA表達(dá)差異及各臨床病理特征(年齡、性別、吸煙與否、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移、是否遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、病理類型、TNM分期等)與表達(dá)量的關(guān)系均采用χ2檢驗；治療后NSCLC患者根據(jù)miR-133b的表達(dá)水平分為兩組(高于miR-133b表達(dá)的均值0.86為高表達(dá)，低于其均值為低表達(dá))，不同miR-133b表達(dá)水平組別的1年內(nèi)生存率比較采用χ2檢驗。以上所有統(tǒng)計學(xué)分析均采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR-133b在NSCLC患者及正常受試者血清中的表達(dá)

熒光定量PCR分析表明，NSCLC患者血清miR-133b相對表達(dá)量(RQ)均值為0.86±1.27，低于正常受試者的1.78±1.36，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=9.572，P=0.004),見圖1。

圖1 80例NSCLC患者與80例正常受試者血清miR-133b的表達(dá)

Fig 1 80 patients with NSCLC and 80 normal subjects serum miR-133b expression

2.2 miR-133b與NSCLC患者臨床及病理特征的關(guān)系

血清miR-133b的表達(dá)水平與NSCLC患者的病理分期(TNM分期)、腫瘤分化程度、抽煙史及是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素密切相關(guān)，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；但與患者的性別、年齡、腫瘤直徑及病理分型無關(guān)(P>0.05)，見表1。

表1 miR-133b與NSCLC患者各臨床及病理特征的關(guān)系 例

Tab 1 The relationship of miRNA-133b with clinical pathological features of NSCLC patients cases

注：miR-133b值大于0.86為高表達(dá)，低于0.86為低表達(dá);括號內(nèi)為相應(yīng)百分?jǐn)?shù)

2.3 miR-133b的表達(dá)與患者術(shù)后存活時間的關(guān)系及NSCLC的預(yù)后價值

NSCLC患者術(shù)后中miR-133b高表達(dá)者1年內(nèi)的生存率為73.8%(31/42)，miR-133b低表達(dá)者1年內(nèi)的生存率為52.6%(20/38)，兩組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=8.580，P=0.003)。

3 討 論

miR-133b最初被認(rèn)為是一種心肌特異性的miRNA，可靶向調(diào)節(jié)一些關(guān)鍵性的心肌發(fā)育及肌信號通路相關(guān)基因[7-8]。近年來，國外研究[9-10]發(fā)現(xiàn)miR-133b通過降低肺癌細(xì)胞MCL-1與BCL2L2的表達(dá)，達(dá)到誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的作用，這樣的結(jié)果為臨床用檢測miR-133b來判斷肺癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后提供了實驗基礎(chǔ)。

本研究采用實時熒光定量PCR檢測非小細(xì)胞性肺癌患者血清中miR-133b的表達(dá)變化，通過與正常受試者血清miR-133b的表達(dá)水平比較，NSCLC患者血清中的miR-133b表達(dá)水平顯著低于正常受試者血清miR-133b的表達(dá)水平，提示miR-133b水平的降低預(yù)示有癌變的可能。同時發(fā)現(xiàn)NSCLC患者血清miR-133b的表達(dá)水平與NSCLC患者的病理分期(TNM分期)、腫瘤分化程度、抽煙史及是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素密切相關(guān)，而與NSCLC患者的性別、年齡、腫瘤直徑及病理分型無關(guān)；提示血清miR-133b水平的變化可能與NSCLC患者腫瘤分化程度以及是否發(fā)生侵襲性轉(zhuǎn)移有關(guān)。根據(jù)miR-133b表達(dá)水平對NSCLC患者進(jìn)行分組后隨訪1年發(fā)現(xiàn)，miR-133b高表達(dá)者1年內(nèi)的存活率明顯高于低表達(dá)者，提示NSCLC患者術(shù)后其血清miR-133b高表達(dá)者存活時間較長，預(yù)后較好。

miR-133b在不同腫瘤中可能因主要作用靶點不同，而在不同的病理過程中發(fā)揮不同的作用[11-12]。對miR-133b生物學(xué)效應(yīng)的研究顯示，其可以通過靶向EGFR而抑制EGFR下游信號通路來發(fā)揮抑制NSCLC增殖和侵襲轉(zhuǎn)移能力的作用，這種作用在EGFR依賴的肺癌細(xì)胞中特別明顯[13]。同時miR-133b能夠改善NSCLC細(xì)胞對于EGFR-TKI的敏感性，從而推測miR-133b的表達(dá)水平高低可能與NSCLC的生物學(xué)行為具有相關(guān)性[14]。

綜上所述，血清miR-133b在正常人和NSCLC患者之間存在表達(dá)差異，可能有助于對NSCLC的早期篩選與診斷。血清miR-133b的表達(dá)與NSCLC各臨床及病理特征、治療后存活時間具有相關(guān)性，對NSCLC的預(yù)后評估具有一定價值。

[1] TRIOZZI P L,ACHBERGER S,ALDRICH W,et al.Differential immunologic and microRNA effects of 2 dosing regimens of recombinant human granulocyte/macrophage colony stimulating factor[J].Immunother,2012,35(7):587-594．

[2] 康歡，胡蔚，康艷紅，等.多種腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測在肺癌診斷中的實用價值[J].現(xiàn)代醫(yī)學(xué)，2012，40(6):706-708.

[3] 關(guān)雅萍.RNA結(jié)合蛋白HuR、TTP與miR-133b在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)和預(yù)后作用的研究[D].泰安：泰山醫(yī)學(xué)院，2014.

[4] SPINETTI G,FORTUNATO O,CAPORALI A,et al.MicroRNA-15a and microRNA-16 impair human circulating proangiogenic cell functions and are increased in the proangiogenic cells and serum of patients with critical limb ischemia[J].Circ Res,2013,112(2):335-346．

[5] MOTSCH N,ALLES J,IMIG J,et al.MicroRNA profiling of Epstein-Barr virus-associated NK/T-cell lymphomas by deep sequencing[J].PLoS One,2012,7(8):e42193．

[6] CRAWFORD M,BATTE K,YU L,et al.MicroRNA 133b targets pro-survival molecules MCL-1 and BCL2L2in lung cancer[J].Biochem Biophys Res Commun,2009,388(3):483-489．

[7] KANO M,SEKI N,KIKKAWA N,et al.miR-145,miR-133a and miR-133b:tumor suppressive miRNAs target FSCN1 in esophageal squamous cell carcinoma [J].Int J Cancer,2010,127(12):2804-2814．

[8] HU G,CHEN D,LI X,et al.miR-133b regulates the MET proto-oncogene and inhibits the growth of colorectal cancer cellsinvitroandinvivo[J].Cancer Biol Ther,2010,10(2):190-197．

[9] MELISSA C,KARA B,LIANBO Y,et al.MicroRNA 133B targets pro-survival molecules MCL-1 and BCL2L2 in lung cancer[J].Biochem Biophys Res Commun,2009，388：483-489．

[10] CIPOLLONE F,FELICIONI L,SARZANI R,et al.A unique microRNA signature associated with plaque instability in humans[J].Stroke,2011,42(9):2556-2563．

[11] 陳為軍，仲昭坤，張恩寧，等.血清her-2 ECD和cox-2水平與非小細(xì)胞肺癌患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系[J].中國實驗診斷學(xué)，2014，18(2)：227-230．

[12] 莫漢文，李麗萍，劉琦，等.ERCC1、BRCA1、RRM1表達(dá)與含鉑類方案治療晚期NSCLC的關(guān)系研究[J].中國臨床研究，2011，24(4)：283-285．

[13] 梁偉娟，葉靜，唐靜，等.非小細(xì)胞肺癌患者血清中胰島素樣生長因子-1水平的變化[J].中華實驗外科雜志，2014，31(10)：2308-2309．

[14] 牟小芬，吳青，馮長順.不同性別及吸煙狀態(tài)的825例非小細(xì)胞肺癌臨床特點[J].臨床肺科雜志，2012，17(10)：1858-1860．

Serum miR-133b levels and its relation with clinical pathological characteristics in non-small cell lung cancer patients

FENG Xiao-yun1，GE Qin1，LU Zhi-bin2

(1.DepartmentofClinicalLaboratory，NantongTumorHospital，Nantong226361，China; 2.DepartmentofThoracicandCardiovascularSurgery，PukouCentralHospital，Nanjing211800，China)

Objective: To explore the relationship between serum miR-133b levels and clinical pathological characteristics，as well as prognosis of disease in non-small cell lung cancer patients.Methods:A total of 80 patients were diagnosed as non-small cell lung cancers by pathological biopsy were included in this study. Meanwhile，80 health people underwent health examinations were selected as controls. The levels of serum miR-133b were measured by real-time PCR.Results:The serum miR-133b level in non-small cell lung cancer patients was (0.86±1.27)，which was obviously lower than that of the normal controls (1.78±1.36) (t=9.572，P=0.004)，and the differences had significance (P< 0.05). The serum miR-133b levels were related to the pathologic stage，tumor differentiation grade，smoking history and lymph node metastasis (P<0.05). The patients with high expression of serum miR-133b levels had greater 1-year survival rates than those of the low expression of serum miR-133b patients (52.6%) (χ2=8.580，P=0.003).Conclusion:Detection of serum miR-133b levels is beneficial for early screening and diagnosing non-small cell lung cancers. Closely related to the clinical pathological characteristics，survival times after treatment，it is a valuable tool for evaluating the prognosis of non-small cell lung cancer patients．

non-small cell lung cancer; miR-133b; expression; survival rate

2015-06-15

2015-08-25

南京市科技局項目(201303034)

馮曉云(1983-)，女，江蘇南通人，主管技師，醫(yī)學(xué)碩士。E-mail:ntfengxiaoyun@126.com

陸志斌 E-mail:luzhibin1983@126.com

馮曉云，葛琴，陸志斌.非小細(xì)胞肺癌患者血清miR-133b的表達(dá)水平及其臨床意義探討[J].東南大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2015，34(6)：934-937.

R734.2

A

1671-6264(2015)06-0934-04

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.06．017